KỸ THUẬT GIEO HẠT LAN HỒ ĐIỆP HL3 PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG MỚI Hoàng Thị Lan Hương, Nguyễn Xuân Linh, Nguyễn Thị Kim Lý, Lê Huy Hàm Summary Multiplication of Phalaenopsis (HL3) from seed serve selecting and creating of new variety Seeds of Phalaenopsis anthura Stockhon (HL3) after 170 days self - pollination were sterilirated by H 2 O 2 15% in 20 minutes and were cultured on MT medium supplemented with 50 g potato per lit. After 7 - 8 weeks, the seed germinated into protocorm (1 - 2 mm size). The protocorm developed PLBs (protocorm - like bodies) with 12 weeks depending on the growth medium supplemented with cytokinins [(kinetin (KIN) and N6 - benzyladenine (BAP)], auxin [2,4 - dichlorophenoxyacetic (2,4D)]. An optimum of 12,3 PLBs from 1 protocorm on medium supplemented with 1,5mg/l BAP and 0,3mg/l 2,4D.Upon subculture in basal MT with 50 g potato/l, the PLBs differentiated into plantlet within 8 weeks. Keywords: Phalaenopsis anthura Stockhon, self - pollination, protocorm, cytokinins, auxin, PLBs, plantlets. MT: Vacine and Went (VW)+ 7 g/l agar + 10 g/l sugar + 3 g/l charcoal I. ĐẶT VẤN ĐỀ Lan Hồ điệp có tên gọi Phalaenopsis, thuộc họ phụ Vandae, là một trong những loại phong lan được trồng phổ biến trên thế giới, chiếm 80% tổng giá trị lan bán trên thị trường. Giống Phalaenopsis gồm 21 loài, qua kết quả chọn lọc và lai tạo, hàng năm số lượng loài này tăng lên không ngừng. Nhân giống từ hạt của những quả tự thụ phấn không giữ được ưu thế đồng nhất của cây hoa lan F1 mà bị phân ly mạnh ở thế hệ F2. Chính vì vậy, để phục vụ cho công tác tạo giống lan Hồ điệp mới, chúng tôi đã nghiên cứu nhân giống HL3 từ hạt. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu Giống lan Hồ điệp HL3 - là giống lai F1 (Phalaenopsis anthura Stockhon) nguồn gốc từ Hà Lan có hoa trắng, môi đỏ, độ bền của hoa lâu (10 - 11 tuần), có khả năng chống chịu bệnh thối nhũn, thời gian xuất hiện ngòng hoa vào đầu tháng 12. Giống được chọn lọc và đưa ra sản xuất từ Trung tâm Hoa cây cảnh - Viện Di truyền Nông nghiệp. 2. Phương pháp nghiên cứu ghiên cứu sự ny mầm của hạt: - Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi quả lên sự nảy mầm của hạt. Quả được lấy từ cây mẹ khoẻ mạnh, ở các độ tuổi khác nhau (125 ngày, 140 ngày, 155 ngày và 170 ngày). Mẫu sau khi thu thập về, được khử trùng bằng H 2 O 2 15%, trong 20 phút và được gieo trong môi trường MT (Vacine and Went (VW) + 7 g/l agar + 10 g/l sucrose + 3 g/l than hoạt tính). - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất phụ gia hữu cơ lên sự nảy mầm của hạt. Quả lấy ở độ tuổi 170 ngày và được gieo vào trong môi trường MT có bổ sung khoai tây và chuối ở các nồng độ khác nhau. Số quả cấy đối với từng công thức thí nghiệm là 5 - 7, mỗi quả được tính trọng lượng hạt bao gồm cả xơ. Thời gian nảy mầm được tính từ khi xuất hiện khoảng 10 thể protocorm đầu tiên. Số thể protocorm/mg hạt được tính sau 40 ngày gieo. ghiên cứu nhân nhanh: - Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BAP (N6 - benzyladenine), KIN (kinetin) và 2,4D (2,4 - dichlorophenoxyacetic) ở các nồng độ khác nhau đến khả năng nhân nhanh protocorm của hạt. - Nghiên cứu tác dụng của chất phụ gia (chuối và khoai tây) lên sự nhân nhanh chồi từ các thể protocorm. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần theo dõi 5 bình, mỗi bình 10 mẫu cấy. Điều kiện thí nghiệm: Quá trình nuôi cấy được tiến hành tại Trung tâm Hoa cây cảnh, Viện Di truyền Nông nghiệp trong điều kiện hoàn toàn nhân tạo, có thể chủ đng iu chnh ánh sáng, nhit ,  Nm theo ý mun. Trong thí nghim này ánh sáng ưc s dng là ánh sáng lnh ca èn neon, thi gian chiu sáng 10 h/ngày, cưng  chiu sáng 2400 - 3000 lux, nhit  27 ± 1 0 C,  Nm 65 - 70%. III. KT QU VÀ THO LUN 1. ghiên cứu sự nảy mầm của hạt Qu lan phát trin chm, thưng phi qua 4 tháng mi chín và tách v. S lưng ht trong mi qu là khác nhau. Ht ca chúng thưng rt nh, không có ni nhũ, trong iu kin t nhiên rt khó ny mm thành cây con nên thưng phi gieo ht trong môi trưng vô trùng thích hp mi có th ny mm. Chính vì vy, nghiên cu nh hưng ca tui qu và tác dng ca mt s cht ph gia (chui, khoai tây) lên vic nuôi cy ht là nhm mc ích tìm ra tui qu và môi trưng thích hp nht. Bảng 1. Ảnh hưởng của tuổi quả tới sự nảy mầm của hạt Tuổi quả (ngày) Trọng lượng hạt (mg/quả) Thời gian nảy mầm (ngày) Số protocorm/mg hạt Chất lượng mẫu 125 140 155 170 61,9 76,4 121,7 132,9 25,1 ± 0,91 20,5 ± 0,98 17,7 ± 0,97 15,5 ± 0,82 15,7± 2,85 95,3± 9,77 135,7 ± 12,83 137,8 ± 11,68 + ++ +++ +++ +: Th protocorm nh, xanh nht; ++: Th protocorm nh, xanh; +++: Th protocorm to, xanh m. Tui qu nh hưng rt ln n thi gian ny mm và t l ny mm ca ht. Nếu thu hoạch quả sớm, quả chưa chín thành thục sẽ làm giảm độ nảy mầm của hạt và kéo dài thời gian nảy mầm. Quả 125 và 140 ngày, do hạt chưa hình thành đầy đủ nên chủ yếu là xơ. Còn quả ở độ tuổi 155 và 170 ngày, hạt đã chín thành thục, số hạt trên quả. Qua bảng 1 cho thấy, quả của giống HL3 sau 170 ngày thụ phấn có độ nảy mầm cao nhất (137,8 protocorm/mg) và thời gian nảy mầm ngắn nhất (15,5 ngày). Bảng 2. Ảnh hưởng của chất phụ gia lên sự nảy mầm của hạt Công thức Thời gian nảy mầm (ngày) Số protocorm/mg hạt Chất lượng mẫu MT 15,5± 0,82 137,8 ± 11,68 ++ MT + 30 gKT 11,3 ± 0,81 140,6 ± 7,64 ++ MT + 50 gKT 9,6 ± 0,51 142,9 ± 9,90 +++ MT + 100 gKT 10,1 ± 0,43 138,3 ± 12,76 +++ MT +150 gKT 10,6 ± 0,74 132,7 ± 8,41 ++ MT + 30 gCH 12,9 ± 0,88 139,2 ± 7,74 ++ MT + 50 gCH 13,7 ± 0,70 133,3 ± 9,31 ++ MT + 100 gCH 18,7 ± 0,72 121,4 ± 9,51 ++ MT +150 gCH 23,2 ± 0,56 93,8 ± 10,14 + MT + 30 gKT + 30 gCH 11,7 ± 0,46 139,3 ± 8,41 ++ MT + 50 gKT + 50 gCH 15,6 ± 0,73 130,1 ± 7,99 ++ MT + 100 gKT + 100 gCH 19,4 ± 0,73 99,0 ± 10,00 ++ MT + 150 gKT + 150 gCH 22,9 ± 0,88 82,0 ± 9,55 ++ CH: Chui + Th protocorm nh, xanh nht; KT: Khoai tây ++ Th protocorm nh, xanh; +++ Th protocorm to, xanh m; MT: VW + 7 g/l agar + 10 g/l sucrose + 3 g/l than hot tính. Ht ca ging lan H ip HL3 u ny mm  tt c loi môi trưng. Tuy nhiên  môi trưng khác nhau thì thi gian ny mm và s ny mm khác nhau. Qua bng 2 cho thy, môi trưng có b sung chui (30 g CH, 50 g CH) hoc t hp chui và khoai tây (30 gKT + 30 gCH) có nh hưng không rõ rt lên s ny mm ca ht, còn  nng  cao, chúng kìm hãm  ny mm ca ht. Trong khi ó, môi trưng có b sung khoai tây (30, 50, 100, 150 g KT) u kích thích ht ny mm nhanh hơn (4,2 - 5,9 ngày) so vi i chng. Môi trưng thích hp nht  gieo ht ca ging HL3: MT + 50 gKT/l. 2. ghiên cứu nhân nhanh - hân nhanh protocorm: Phương pháp nhân nhanh protocorm t ht là phương pháp rt hu hiu  làm tăng nhanh ngun mu ban u. Phương pháp này c bit có ý nghĩa i vi nhng qu lai quý him, khó u qu, s lưng ht trong qu ít. Trong i sng thc vt, t l auxin/cytokinin có mt vai trò quan trng trong s bit hóa các cơ quan và quyt nh n s sinh trưng và phát trin ca cây. Vì vy, trong k thut vi nhân ging các nhà nghiên cu u thng nht rng t hp auxin và cytokinin cho hiu qu tt hơn s tác ng riêng l (Mathws & Rao, 1980; Yam & Weatherhead, 1991; Teng et al., 1997). Tuy nhiên, trong mt s trưng hp s tác ng riêng r ca cytokinin cũng cho h s nhân cc i (Bhojwani, 1980) bi có th  mt s loi cây trng, bn thân mu nuôi cy t tng hp  auxin cho nên không cn cung cp auxin ngoi sinh (Robert J.Weaver, 1972). Nghiên cứu tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ hoặc kết hợp ở các nồng độ khác nhau lên mẫu cây lan Hồ điệp là nhằm mục đích tìm ra tổ hợp tối ưu nhất cho hệ số nhân cao nhất trong ống nghiệm. Sau khi hạt nảy mầm (khoảng 7 - 8 tuần) các thể protocorm được cấy vào môi trường MT có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau. Bảng 3. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự nhân nhanh protocorm (sau 12 tuần) Nồng độ của các chất điều hòa sinh trưởng mg/l Tỷ lệ tạo protocorm mới (%) Hệ số nhân (lần) BAP 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0 40,7 70,7 85,3 82,0 62,0 0 3,5 ± 1,02 6,5 ± 1,14 9,5 ± 1,91 7,2 ± 0,76 4,4 ± 1,00 KIN 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 31,3 61,3 74,0 76,7 68,0 3,2 ± 0,48 3,5 ± 0,68 4,8 ± 0,87 7,7 ± 0,64 5,4 ± 0,64 BAP + 2,4D 1,5 + 0,3 1,5 + 0,5 1,5 + 0,7 1,5 + 1,0 87,3 72,0 Không phản ứng Không phản ứng 12,3 ± 1,22 4,8 ± 0,62 0 0 KIN + 2,4D 2,0 + 0,3 2,0 + 0,5 2,0 + 0,7 2,0 + 1,0 75,3 64,0 Không phản ứng Không phản ứng 7,1 ± 0,66 5,5 ± 0,67 0 0 Qua bng 3 cho thy, cytokinin hoc t hp cytokinin và auxin có nh hưng tích cc n quá trình phát sinh protocorm mi.  công thc i chng, mu không phát sinh protocorm mi, nhưng  nhng công thc sau h s nhân tăng lên rõ rt. Thí nghim i vi BAP cho thy, t l to protocorm và h s nhân t giá tr cao nht  nng  1,5 mg/l ln lưt là 85,3% và 9,5 ln. Còn môi trưng có b sung kinetin, t l to protocorm cao nht là 76,7%, h s nhân là 7,7 ln  nng  2,0 mg/l. Mu ưc cy trong môi trưng có s kt hp gia BAP và 2,4D; KIN và 2,4D cũng làm tăng sự hình thành protocorm của mẫu. Tuy nhiên, nếu kết hợp với 2,4D ở nồng độ cao (0,7 và 1,0 mg/l) mẫu không có phản ứng. Kết quả tốt nhất là ở môi trường có 1,5 mg/l BAP và 0,3 mg/l 2,4D, 87,3% mẫu nuôi cấy tạo PLBs với hệ số nhân là 12,3 lần. Như vậy, môi trường thích hợp nhất cho sự nhân nhanh protocorm là: MT + 1,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l 2,4D. - hân nhanh chồi: Sau khi nhân nhanh các thể protocorm, chúng tôi nghiên cứu tác dụng của chất phụ gia lên sự hình thành chồi từ các thể protocorm bằng cách cấy các thể protocorm vào môi trường MT có bổ sung khoai tây và chuối ở các nồng độ khác nhau. Bảng 4. Ảnh hưởng của chất phụ gia lên hệ số nhân chồi (sau 8 tuần) Công thức Hệ số nhân (lần) Tỷ lệ tạo chồi (%) MT 5,1 41,3 MT + 30 gKT 7,4 78,0 MT + 50 gKT 8,4 85,3 MT + 100 gKT 7,3 77,3 MT +150 gKT 7,1 64,7 MT + 30 gCH 5,9 54,7 MT + 50 gCH 5,4 49,3 MT + 100 gCH 4,7 38,7 MT + 150 gCH 4,3 32,0 MT + 30 gKT + 30 gCH 6,4 54,0 MT + 50 gKT + 50 gCH 6,0 20,7 MT + 100 gKT + 100 gCH 4,8 19,3 MT + 150 gKT + 150 gCH 4,1 17,3 Khoai tây và chui u nh hưng n h s nhân chi và t l to chi. Qua bng 4 cho thy,  tt c các công thc có b sung khoai tây u cho h s nhân và t l to chi cao hơn so vi i chng và t cao nht  công thc 50 g/l khoai tây. Tuy nhiên, nu b sung  nng  cao, s hình thành chi t cm protocorm gim i. Còn  nhng công thc có b sung chui hoc t hp chui và khoai tây thì h s nhân và t l to chi gim i theo t l nghch vi nng . H s nhân và t l to chi thp nht  công thc 150 g/l khoai tây + 150 g/l chui ln lưt là 4,1 ln và 17,3%. Môi trưng thích hp nht cho nhân nhanh cây con là: MT + 50 g/l khoai tây. IV. KẾT LUẬN - Gieo hạt: Quả lan 170 ngày tuổi, không bị sâu bệnh được khử trùng bằng H 2 O 2 15% trong 20 phút. Sau 9,6 ngày hạt nảy mầm với số lượng 142,9 mầm/mg hạt trong môi trường MT + 50 g/l khoai tây. - Nhân nhanh: Hạt sau 7 - 8 tuần gieo phát triển thành thể tiền chồi có kích thước 2 mm. Lấy thể tiền chồi này cấy vào môi trường MT + 1,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l 2,4D. Sau 12 tuần từ một thể tiền chồi phát sinh ra 12,3 PLBs. Sau khi nhân nhanh protocorm, cấy chuyển các protocorm này vào môi trường MT + 50 g khoai tây/l, sau 8 tuần hình thành chồi con với hệ số nhân là 8,4 chồi/ cụm protocorm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 guyễn Quang Thạch, guyễn Thị Lý Anh, guyễn Thị Lâm Hải, 2005. K thut chn to, nhân nhanh và nuôi trồng lan Hồ điệp, NXB Nông nghiệp 2 Rod Santa Ana III, 2001. Rio grand valleya leader in orchid production, research, Agricultural Communications Taxas A$M University system. 3 Teng, W.L.; icloson, L.; Teng, M.C, 1997. Micropropagation of Spathoglotis plicata. Plant Cell Rep, pp. 831 - 835. 4 Yam, T.W.; Weatherhead, M.A, 1991. Leaf - tip culture of several native orchids of Hong Kong. Lindleyana 6, pp. 147 - 150. gười phản biện: Trần Duy Quý T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 6 . KỸ THUẬT GIEO HẠT LAN HỒ ĐIỆP HL3 PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG MỚI Hoàng Thị Lan Hương, Nguyễn Xuân Linh, Nguyễn. tác tạo giống lan Hồ điệp mới, chúng tôi đã nghiên cứu nhân giống HL3 từ hạt. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu Giống lan