TCNCYH 26 (6) - 2003 Phát hiện virus viêm gan b trong huyết thanh ngời cho máu bằng kỹ thuật pcr Văn Đình Hoa, Võ Văn Huy Đại học Y Hà Nội Sàng lọc máu, các sản phẩm máu tốt là góp phần hạ thấp tỷ lệ các bệnh lây nhiễm qua đờng máu: HIV, HBV, HCV ở nhiều nớc tiên tiến, các kỹ thuật sinh học phân tử đã trở thành xét nghiệm sàng lọc thờng quy đối với các cơ sở sử dụng máu và các sản phẩm máu. Với kỹ thuật PCR, chúng tôi phát hiện đợc 1 trong số 73 trờng hợp (HBsAg(-)) đến khám sức khoẻ cho máu tại Viện Huyết học Truyền máu TW có DNA HBV(+). Số lợng còn ít nhng phần nào nói lên giá trị của kỹ thuật PCR - một công cụ góp phần nâng cao sự an toàn truyền máu. i. Đặt vấn đề Viêm gan do virus là một trong những bệnh gây lây nhiễm cao và nguy hiểm cho sức khoẻ các cộng đồng dân c trên toàn thế giới. Có nhiều loại virus gây viêm gan đã đợc phát hiện: HAV, HBV, HCV, HDV, HEV, HGV. Tỷ lệ mang HBsAg(+) của các cộng đồng thuộc các châu lục, các vùng địa lý rất khác nhau: Các nớc châu Âu có tỷ lệ thấp nhất, trung bình ở các nớc châu Mỹ, cao ở một số nớc châu á, châu Phi, rất cao ở thổ dân úc [2]. Sự lây nhiễm HBV, HCV từ ngời này sang ngời khác, chủ yếu qua đờng máu. Những ngời bị nhiễm HBV có thể bị viêm gan cấp, có thể bị viêm gan mạn dẫn đến hậu hoạ xơ gan, ung th gan. Những ngời bị viêm gan mạn có nguy cơ bị ung th gan tiên phát rất cao, gấp 200 lần những ngời bình thờng [2,3]. Nớc ta nằm trong khu vực lu hành dịch địa phơng cao, tỷ lệ ngời mang HBsAg(+): 10-20% tuỳ theo nghề nghiệp, đời sống sinh hoạt [3]. Cũng nh các virus khác, HBV có nhiều loại kháng nguyên khác nhau. Kháng nguyên bề mặt (HBsAg): là loại kháng nguyên đợc tổng hợp nhiều nhất trong số các kháng nguyên của HBV, xuất hiện sớm ở trong máu ngời bị nhiễm (có thể sau 6 ngày bị nhiễm), tăng dần và biến mất sau 4-8 tuần lễ từ khi có triệu chứng lâm sàng. Nếu sau 6 tháng mà HBsAg vẫn dơng tính thì có nguy cơ bị nhiễm HBV mạn tính. Đa số các kỹ thuật xét nghiệm HBsAg hiện nay thờng chỉ phát hiện đ ợc từ tuần lễ thứ 4 đến tuần lễ thứ 8 [2]. Kháng nguyên lõi (HBcAg) có trong nhân tế bào gan bị nhiễm virus, kháng nguyên này không xuất hiện trong máu. Kháng nguyên vỏ (HBeAg) xuất hiện sau HBsAg. Vừa có HBsAg (+) vừa có HBeAg (+) là các đối tợng chủ yếu gây lây nhiễm mạnh nhất vì HBeAg là dấu hiệu của virus đang nhân lên. Trong các đờng lây nhiễm HBV thì lây nhiễm qua truyền máu và các sản phẩm của máu đã và đang đợc cộng đồng hết sức quan tâm bởi lẽ nhu cầu về máu và sản phẩm của máu vừa ngày càng tăng 1 TCNCYH 26 (6) - 2003 cao trong điều trị vừa là môi trờng rất dễ bị nhiễm virus. An toàn truyền máu càng cao thì phòng tránh các bệnh lây nhiễm nói chung và lây nhiễm HBV nói riêng càng hiệu quả [4,8]. Các kỹ thuật xét nghiệm tiên tiến có độ chính xác cao nh ELISA, RIA chỉ phát hiện đợc các kháng nguyên, kháng thể chống HBV trong máu của ngời nhiễm. Sau khi xâm nhập, HBV phải có một thời gian sinh sôi phát triển, phải có một khoảng thời gian nhất định thì lợng kháng nguyên phóng thích vào máu mới đủ để các kỹ thuật tiên tiến ở trên phát hiện đợc. Mặt khác sau khi bị nhiễm cơ thể cũng phải có một thời gian mới đáp ứng tạo đợc một lợng kháng thể nhất định. Giai đoạn cha có đáp ứng miễn dịch thờng kéo dài từ 2-26 tuần (gọi là giai đoạn cửa sổ). Trong giai đoạn cha có triệu chứng lâm sàng, cha có đáp ứng miễn dịch, việc phát hiện sự có mặt của HBV rất khó khăn. Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) của Karry Mullis là một phát kiến quan trọng của sinh học phân tử giúp phát hiện các genom của các virus, có nghĩa là phát hiện đợc sự có mặt của chúng kể cả khi chúng không hoặc cha gây hại gì. Mục tiêu: - Dùng kỹ thuật PCR để phát hiện genom virus viêm gan B trong huyết thanh. - Phát hiện DNA HBV trong huyết thanh của các đối tợng cho máu ii. Đối tợng, phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng nghiên cứu: - Hoàn chỉnh kỹ thuật: 30 mẫu huyết thanh có HBsAg(+) và 30 mẫu huyết thanh có HBsAg(-) (kỹ thuật ELISA). - Đối tợng nghiên cứu: 73 mẫu huyết thanh có HBsAg(-) của các đối tợng cho máu (HIV-, HBV-, HCV-), trong số 73 mẫu huyết thanh này có 52 mẫu của các đối tợng cho máu nhân đạo, 21 mẫu của các đối tợng đến khám sức khoẻ để cho máu tại Viện Huyết học Truyền máu trung ơng. 2. Phơng pháp, kỹ thuật nghiên cứu: - Lấy máu tách huyết thanh. - Chiết tách DNA từ huyết thanh bằng phơng pháp Ethanol/ Chloroform và Boom. - Tiến hành phản ứng PCR trên máy của hãng Perkin Elmer với Primer của hãng Takara Nhật Bản có trình tự nucleotid: C1 sense, 21 mer 5' CCT CCA AGT TGT GCC TTG GG3' (nt 1741-1760) C2 antisense, 21 mer 3' CGT GAG TCC GTT CGA TAA GA5' (nt 1932-1951) - Kiểm tra kết quả PCR bằng điện di trên thạch Agarose 1,5% có Ethilium bromide. Marker 100, 200, 300, 400 và 500 nm. iii. Kết quả Tất cả các mẫu huyết thanh đều tuần tự tiến hành theo các bớc: chiết tách DNA kiểm tra lợng DNA của mẫu bằng phơng 2 TCNCYH 26 (6) - 2003 pháp đo mật độ quang (OD) ở bớc sóng 260nm, 280nm, tiến hành phản ứng PCR, kiểm tra xác định PCR bằng điện di trên thạch Agarose. 1. Phát hiện DNA HBV ở 30 mẫu huyết thanh có HBsAg(+) Bảng 1: PCR phát hiện DNA trong huyết thanh các đối tợng HBsAg(+) PCR n DNA HBV (+) DNA HBV (-) 30 30 0 Nhận xét: cả 30 trờng hợp HBsAg(+) đều phát hiện đợc DNA HBV. 2. Phát hiện DNA HBV ở các mẫu huyết thanh có HBsAg(-) 2.1. Kết quả phát hiện DNA HBV Bảng 2: PCR phát hiện DNA trong huyết thanh các đối tợng có HBsAg(-) PCR n DNA HBV (+) DNA HBV (-) 30 1 29 Nhận xét: 30 mẫu huyết thanh này là của ngời đến khám sức khoẻ tại Viện Huyết học Truyền máu TW có HBsAg(-) với ELISA. 01 trờng hợp có DNA HBV (+). Trờng hợp này đợc kiểm tra lần 2 vẫn cho kết quả DNA HBV (+) mặc dầu cha có biểu hiện gì về lâm sàng. 2.2. Kết quả kiểm tra PCR bằng điện di trên thạnh Agarose 100 nm 200 nm 300 nm 400 nm 500 nm A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 29 30 M ảnh 1: Điện di kiểm tra DNA HBV Chú thích: A: Mẫu chứng âm tính B: Mẫu chứng dơng tính Mẫu dơng tính: 12. Mẫu âm tính: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Mẫu M: Marker 3 TCNCYH 26 (6) - 2003 3. Kết quả PCR phát hiện DNA của 73 mẫu huyết thanh nghiên cứu Bảng 3: Kết quả PCR DNA HBV DNA HBV (-) DNA HBV (+) Tổng số n 72 1 73 Nhận xét: Trong số 73 mẫu huyết thanh HBsAg(-) với ELISA thì có 72 mẫu cho kết quả DNA HBV (-), 1 trờng hợp có DNA HBV (+): 1/73. Trờng hợp có DNA HBV (+) là một trong số các đối tợng đến khám sức khoẻ để cho máu. Tất cả các trờng hợp đến hiến máu nhân đạo (52) đều cho kết quả DNA HBV (-). iv. Bàn luận PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử có độ chính xác cao để phát hiện genom của virus HBV, nghĩa là phát hiện đợc sự có mặt của virus ở ngời bị nhiễm mặc dầu lúc đó cha có các kháng nguyên hoặc kháng thể chống lại HBV trong máu [1,6,7]. Một số nớc tiên tiến trên thế giới đã sử dụng kỹ thuật PCR thờng quy trong sàng lọc HIV, HBV, HCV nh Đức, Mỹ, Nhật, do đó họ đã hạ thấp đợc tỷ lệ viêm gan do truyền máu một cách rõ rệt [9]. Các bệnh lây nhiễm qua máu và các sản phẩm của máu đã đợc nhiều tác giả nghiên cứu. Công tác sàng lọc để đảm bảo an toàn truyền máu luôn đợc đặt ra cho ngành [4]. Hiện nay các trung tâm truyền máu của nớc ta đã tiến hành sàng lọc máu bằng kỹ thuật ELISA, chỉ một vài cơ sở sử dụng kỹ thuật PCR với tính chất nghiên cứu. Chúng tôi ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện DNA HBV ở những ngời cho máu đã phát hiện đợc 1 trong 73 trờng hợp HBsAg(-) có DNA HBV (+). Số liệu còn ít: 1/73 mẫu của các đối tợng đến khám sức khoẻ để cho máu nhng cũng phần nào nói lên đợc vai trò của kỹ thuật PCR trong việc phát hiện HBV. Có thể nói PCR là một công cụ góp phần tăng khả năng sàng lọc, hạ thấp thêm bệnh viêm gan do truyền máu. Tuy nhiên, kỹ thuật PCR là kỹ thuật sinh học phân tử đòi hỏi trang thiết bị kỹ thuật cao nên giá thành còn đắt hơn so với ELISA. v. Kết luận - PCR là kỹ thuật có giá trị phát hiện đợc sự có mặt của HBV trong thời kỳ mà cơ thể cha có đáp ứng miễn dịch. - Đã phát hiện đợc một trờng hợp có DNA HBV (+) trong 73 trờng hợp của những ngời hiến máu nhân đạo và đến khám sức khỏe để cho máu có HBsAg(-) Tài liệu tham khảo 1. Vũ Triệu An (1995) Một kỹ thuật y sinh học hiện đại: phơng pháp PCR Thông tin Y học: tập 3, số 7: 10-12 2. Nguyễn Thị Kim Liên (2000) ý nghĩa lâm sàng và tiên lợng viêm gan virus B dựa vào một số thông số miễn dịch. Luận án Tiến sĩ Y học - Đại học Y Hà Nội. 3. Nguyễn Thị Nga (1995) Góp phần nghiên cứu tỷ lệ mang HBsAg trên một số nhóm ngời, mối liên quan với an toàn truyền máu và ung th gan. Luận án Tiến sĩ Y học - Đại học Y Hà Nội. 4. Đỗ Trung Phấn (1995) Cung cấp máu và an toàn truyền máu: hai nhiệm vụ khẩn thiết hiện nay. Y học Việt Nam: Số 9, 15-18 5. Carman-WF, Van-Deusen-FJ, Mimmis-LT (1997) The prevalence of surface antigen variants of hepatitis B virus 4 TCNCYH 26 (6) - 2003 in Papua New Guine, South Africa and Sardinia”. 6. Gomes-Sa, Yoshida-CF, Niel-C (1996) “Detection of hepatitis B virus DNA in hepatitis B surface antigen conditions”. Acta-Virol. June, 40(3), 8-133. 7. Huo-TI, et al (1996) “Polemerase chain reaction analysis for viral nucleic acids in acute sporadic hepatitis patients negative for serum hepatitis B surface antigen and antibodies to hepatitis C virus”. Chung-Hua-I-Hsueh-Tsa-Chih- Taipei. December: 58(6): 379-384. 8. Koerner-K, et al (1998) “Estimated risk of transmission of hepatitis C virus by blood transfusion”. Vox Sang, 74: 213-216. 9. Shottsted-V, et al (1997) “Routine PCR screening for HBV, HCV and HIV-I genome in a large blood donation services: experiences and initial results”. Beitr- infusion-Tranfusionmed. 34: 22-27. Summary HBV Detection in serum of blood donors by PCR Well-screening blood and blood products helps reduce the ratio of blood-transmitted diseases such as HIV, HBV, HCV, etc. In developed countries, molecular biology techniques have become routine screening tests in laboratories using blood and blood products. Using PCR, we have found that one out of 73 cases (HBsAg(-)) having health checks and donating blood at the National Institute of Hematology and Blood Transfusion has DNA HBV(+). This number is small but it can still demonstrate the value of PCR, a tool contributing to enhance blood transfusion safety. 5 . tiêu: - Dùng kỹ thuật PCR để phát hiện genom virus viêm gan B trong huyết thanh. - Phát hiện DNA HBV trong huyết thanh của các đối tợng cho máu ii. Đối. - 2003 Phát hiện virus viêm gan b trong huyết thanh ngời cho máu b ng kỹ thuật pcr Văn Đình Hoa, Võ Văn Huy Đại học Y Hà Nội Sàng lọc máu, các