TCNCYH 25 (5) - 2003 Tác dụng chống viêm, lợi niệu và độc tính cấp tính của cây Nhó đông trên thực nghiệm Đào Văn Phan 1 , Lại Thị Vân 2 1 Đại học Y Hà Nội, 2 Đại học Y Thái Bình Dịch chiết toàn phần trong nớc của rễ cây Nhó đông- Psychotria morindoides Hutch- Rubiaceae- theo tỷ lệ 1: 1 (1ml tơng đơng 1g dợc liệu khô), cho chuột cống uống với liều 10g/ kg thân trọng, đã: - Không có tác dụng chống viêm cấp trên mô hình phù bàn chân chuột bằng carrageenin, nhng lại chống đợc viêm mạn trên mô hình gây u hạt bằng amiant. - Làm tăng lợi niệu tới 83% ở giờ thứ 6 sau uống thuốc. Chuột nhắt uống liều tối đa 1 lần 120g/ kg thân trọng vẫn không chết nên không xác định đợc DL 50. I. Đặt vấn đề Nhó đông - Psychotria morindoides Hutch- Rubiaceae [1] hay còn đợc gọi là cây Lấu [3] mọc hoang nhiều ở tỉnh Sơn La, đợc nhân dân địa phơng dùng chữa rối loạn tiêu hóa, chữa viêm gan thể hoàng đản hoặc giã lấy nớc đắp lên chỗ sng viêm. Chúng tôi đã nghiên cứu tác dụng chống viêm gan thực nghiệm của dịch chiết toàn phần trong nớc của rễ cây Nhó đông [4], [6], trong phần này mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi là: - Đánh giá tác dụng chống viêm cấp và mạn tính của Nhó đông trên mô hình thực nghiệm. - Đánh giá tác dụng lợi niệu của Nhó đông trên chuột. - Xác định liều chết 50% (DL 50 ) của DCNĐ trên chuột nhắt II. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 1. Thuốc nghiên cứu: Dịch chiết toàn phần trong nớc của rễ cây Nhó đông (DCNĐ) thu hoạch ở vùng núi tỉnh Sơn La đợc thực hiện tại viện Dợc liệu theo tỷ lệ 1:1 (1ml DCNĐ tơng đơng 1g dợc liệu khô) 2. Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp: Chuột cống trắng chủng Wistar cả 2 giống có trọng lợng 160- 200g đợc chia thành 3 lô ì 10 con. Lô 1: uống NaCl 0,9%- 10ml/ g Lô 2: uống DCNĐ- 10g hay 10ml/ kg Lô 3: uống Aspirin 0,05g trong 10ml/ kg Một giờ sau khi uống các dung dịch trên, gây viêm phù chân chuột theo phơng pháp Winter [10]; tiêm vào dới da gan bàn chân phải của chuột dung dịch carrageenin 1% trong nớc muối sinh lý với liều 0,05ml/ chân. Bàn chân trái không tiêm, dùng làm chứng. Đo thể tích bàn chân chuột trớc (V 0 ) và sau gây viêm 2, 4, 6, 8 và 24 giờ (hoặc so sánh với thể tích bàn chân trái cùng thời điểm) bằng máy đo thể tích (plethysmo meter 7140) Ugo Basile, Italia. Mức độ phù đợc tính theo công thức V t - V 0 X% = ì 100 V 0 X%: độ phù bàn chân V t : thể tích bàn chân ở t giờ V 0 : thể tích chân đối chứng 3. Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn Gây u hạt thực nghiệm theo phơng pháp Ducrot và cộng sự [7] có cải tiến. Chuột cống trắng cả 2 giống có trọng lợng 130- 160g đợc chia thành 3 lô ì 10 con: 3 Đề tài đợc thực hiện tại bộ môn Dợc lý, trờng Đại học Y Hà Nội TCNCYH 25 (5) - 2003 Lô 1: uống NaCl 0,9%- 10ml/ kg Lô 2: uống DCNĐ- 10g hay 10ml/ kg Lô 3: uống Aspirin 0,05g trong 10ml/ kg Gây mê chuột bằng thiopental 40mg/ kg tiêm phúc mạc. Gây u hạt thực nghiệm với cục amiant có trọng lợng 30 mg đã đợc tiệt trùng bằng sấy ở 160 0 C trong 2 giờ, và nhúng vào carrageenin 1% trớc khi cấy vào dới da gáy của chuột . Sau đó cho chuột uống thuốc trong 5 ngày liền, ngày đầu sau cấy sợi amiant 30 phút. Chiều ngày thứ 5, gây mê chuột, bóc tách các khối u, cắt gọt sạch tổ chức mỡ rồi đặt vào tủ ấm 50 0 C trong 18 giờ. Cân trọng lợng khối u. Tác dụng chống viêm đợc đánh giá bằng tỷ lệ % giảm trọng lợng khối u so với lô chứng chỉ dùng NaCl 0,9%. 4. Đánh giá tác dụng lợi niệu Chuột cống trắng cả 2 giống có trọng lợng 180 20g chia thành 2 lô ì 6 con. Lô 1: uống nớc cất 10 ml/ kg Lô 2: uống DCNĐ 10g hay 10 ml/ kg Sau khi uống thuốc, các chuột đều đợc tiêm thêm vào phúc mạc dung dịch NaCl 0,9%- 30 ml/ kg để làm tăng khối lợng nớc tiểu. Đặt từng chuột vào mỗi phễu riêng để hứng nớc tiểu. Đo lợng nớc tiểu từng giờ trong 6 giờ. Xác định DL 50 trên chuột nhắt theo đờng uống của DCNĐ theo phơng pháp Litchfield Wilcoxon [8] III. Kết quả 1. Tác dụng chống viêm cấp Bảng 1: Tác dụng của DCNĐ lên thể tích bàn chân chuột bị gây phù bằng carrageenin (n = 10/ lô) Thể tích bàn chân (theo đơn vị máy đo) (1) NaCl 0,9% DCNĐ Aspirin Chân đối chứng 1,53 0,32 (100%) 1,31 0,08 (100%) 1,46 0,14 thể tích 2 giờ V 2 2,33 0,48 (152,3%) 2,00 0,21 (152,7%) 1,90 0,20 * (130,1%) bàn chân sau tiêm 4 giờ V 4 2,67 0,46 (174,5%) 2,34 0,13 (170,9%) 2,07 0,16 * (141,8%) carra- geenin 6 giờ V 6 2,29 0,32 (149,7%) 1,92 0,15 (146,6%) 1,97 0,15 * (134,9%) 8 giờ V 8 2,22 0,27 (145,1%) 1,87 0,12 (142,7%) 1,83 0,15 * (125,3%) 24 giờ V 24 1,98 0,23 (129,4%) 1,47 0,15 (110,7%) 1,64 0,15 (112,3%) (1) : Các số trên là thể tích theo đơn vị của máy đo Ugo Basile (M SE). Các số dới là tỷ lệ % tăng thể tích (phù) so với chân đối chứng. * : p < 0,05 so với lô chứng uống NaCl 0,9%. Qua bảng 1 cho thấy carrageenin gây phù rất mạnh, nhất là ở giờ thứ 4. Sau 1 ngày, tác dụng đã giảm đi rất nhiều. Chỉ có aspirin ức chế đợc tác dụng gây phù của carrageenin với p< 0,05 ở tất cả các thời điểm đã đợc đo trong ngày. 2. Tác dụng chống viêm mạn 4 TCNCYH 25 (5) - 2003 Bảng 2: Tác dụng chống viêm mạn tính của DCNĐ Thuốc dùng n Trọng lợng trung bình u hạt Tỷ lệ % so với lô chứng % giảm trọng lợng u so với lô chứng p NaCl 0,9% 10 202,7 23,5 100 DCNĐ 10 127,6 7,9 62,95 37,05 < 0,01 Aspirin 10 165,1 13,1 81,45 18,55 < 0,05 Kết quả cho thấy với liều đợc dùng trong thí nghiệm DCNĐ có tác dụng giảm viêm mạn tính mạnh hơn Aspirin (37,05% so với 18,55%). 3. Tác dụng lợi niệu Bảng 3: Tác dụng lợi niệu của DCNĐ (n= 6/lô) Lợng nớc tiểu (M SE) ml Giờ thứ Nớc cất DCNĐ Tỷ lệ % tăng nớc tiểu so với nhóm chứng p 1 3,35 0,13 3,94 0,26 1,8 2 3,97 0,28 4,04 0,28 1,8 3 5,26 0,16 7,25 0,22 38 < 0,05 4 7,74 0,22 10,21 0,26 32 < 0,05 5 7,61 0,15 11,24 0,13 48 < 0,01 6 7,79 0,21 14,27 0,28 83 < 0,01 DCNĐ có tác dụng lợi niệu mạnh từ giờ thứ 3 4. Xác định liều chết 50% (DL 50 ) Từng lô 10 chuột nhắt cả 2 giống nặng 20 2g đợc cho uống DCNĐ từ liều thử tác dụng 10g/ kg, tăng dần cho đến liều cao nhất chuột có thể uống đợc trong 1 thể tích 0,4 ml/10g. Theo dõi tình trạng chuột trong 24 giờ (bảng 4) và số chuột chết trong 72 giờ. Bảng 4: ảnh hởng của DCNĐ lên tình trạng chuột trong 24 giờ đầu (n= 10/ lô) Tình trạng chuột Lô Liềuuống (g/kg) ăn uống Hoạt động Lông Phân Chết Bình phục 1 10 Bình thờng Đi lại, leo trèo bình thờng Mợt khô, có khuôn 0 2 20 Bình thờng Đi lại, leo trèo bình thờng Mợt khô, có khuôn 0 3 40 ít ít đi lại, nằm tụ lại từng đám Mợt khô, có khuôn 0 4 60 ít ít đi lại, nằm tụ lại từng đám Mợt khô, có khuôn 0 5 80 ít Mợt Lỏng, nhiều 0 6 100 ít Mợt Lỏng, nhiều 0 7 120 Hầu nh không ăn uống Hầu nh không đi lại trong 5- 6 giờ đầu, nằm yên, tụ lại một góc, vẫn đáp ứng khi có kích thích Mợt Lỏng nhiểu 0 Chuột nhanh nhẹn hẳn lên, đi lại tìm kiếm thức ăn, uống bình thờng, từ giờ thứ 12. Ngày hôm sau hoàn toàn bình thờng 5 TCNCYH 25 (5) - 2003 Sau uống thuốc 24 giờ, mọi chuột đều trở lại ăn uống hoạt động bình thờng. Không có chuột nào chết trong vòng 72 giờ và cả trong 7 ngày sau. Nh vậy, với liều cao gấp 12 lần liều có tác dụng dợc lý, DCNĐ vẫn không gây chết chuột, không xác định đợc LD 50 . IV. Bàn luận Nhó đông là một cây thuốc dân gian mới đợc xác định tên khoa học vào tháng 7/ 2001 [1] và cũng mới bắt đầu đợc nghiên cứu [2] [5] [6] về tác dụng bảo vệ gan. Liên quan đến tác dụng này là tác dụng chống viêm và lợi niệu vì nếu làm tăng đào thải đợc chất độc qua thận và chống viêm thì sẽ làm gan ít bị phơi nhiễm với chất độc và chóng hồi phục. Vì thế chúng tôi đã nghiên cứu đánh giá các tác dụng này sau khi đã xác định đợc tác dụng của DCNĐ trong viêm gan thực nghiệm do carbon tetraclorid và paracetamol [4]. 1. Về tác dụng chống viêm Kết quả ở bảng 1 cho thấy DCNĐ không có tác dụng chống viêm cấp do carrageenin, trong khi aspirin với liều 0,05g/ kg chuột đã có tác dụng ức chế rõ hiện tợng phù viêm do carrageenin với p < 0,05 từ giờ thứ 2 và tác dụng tăng dần đến giờ thứ 8. Carrageenin gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch [10], dấu hiệu đặc trng của viêm cấp. DCNĐ không ức chế đợc 2 tác dụng này. Tuy nhiên, trên mô hình gây viêm gan mạn bằng amiant, kết quả ở bảng 2 lại cho thấy DCNĐ có tác dụng mạnh hơn aspirin về giảm trọng lợng u hạt (37,05% so với 18,55%) với p <0,05. Viêm là một quá trình phức tạp có rất nhiều loại tế bào và chất trung gian hóa học tham gia. Aspirin có tác dụng chống viêm chủ yếu là do ức chế tổng hợp prostaglandin [9]. Nh vậy DCNĐ có tác dụng chống viêm khác aspirin, có thể không phải thông qua ức chế tổng hợp prostaglandin mà là thông qua ức chế nhiều chất trung gian hóa học khác cần đợc tiếp tục đánh giá. 2. Về tác dụng lợi niệu Bảng 3 cho thấy từ giờ thứ 3 sau uống thuốc, DCNĐ có tác dụng lợi niệu rõ, số lợng nớc tiểu so với lô chứng tăng 38% với p <0,05. Vào giờ thứ 6 tăng tới 83% với p <0,01. Tác dụng này đợc nói tới trong kinh nghiệm dân gian và y văn, nhng rõ ràng là có đóng góp vào cơ chế giải độc cho gan đã đợc nhân dân địa phơng vùng cây thuốc (Sơn La) sử dụng. Chúng tôi hy vọng sẽ có dịp nghiên cứu thêm về cơ chế của tác dụng này. 3. Về độc tính cấp Trong thực nghiệm, chúng tôi cho chuột nhắt uống với liều tối đa chuột có thể chịu đựng đợc là 120g/kg, gấp 12 lần liều thử nghiệm tác dụng dợc lý, hoặc gấp 24 lần liều dùng theo kinh nghiệm dân gian cho ngời (0,5g/kg) tính theo kg cân nặng, nhng không gây chết chuột, không xác định đợc liều chết 50% (LD 50 ). Với liều lớn hơn 80g/kg, do uống quá nhiều nên chuột rất mệt, không hoạt động, phân ớt, nhng không có dấu hiệu nhiễm độc. Sau một ngày tình trạng hoạt động chuột trở lại hoàn toàn bình thờng. V. Kết luận - DCNĐ toàn phần với liều 10g/kg chuột cống không có tác dụng chống viêm cấp do carrageenin, nhng có tác dụng chống viêm mạn tính do amiant - Với liều trên, DCNĐ có tác dụng lợi tiểu rõ, làm tăng nớc tiểu tới 83% ở giờ thứ 6 sau uống thuốc. - Không xác định đợc liều chết 50%(LD 50 ) trên chuột nhắt, vì với khối lợng thuốc cao nhất chuột có thể uống đợc trong 1 lần, không gây chết đợc chuột. Tài liệu tham khảo 1. Vũ Văn Chuyên (2001), Biên bản giám định cây thuốc. Hà Nội tháng 7/2001. 2. Trần Phi Hùng (1999), Góp phần nghiên cứu về thực vật, hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Nhó đông (Cephaelis sp. Rubiaceae). Luận án Thạc sĩ Dợc học. Đại học Dợc Hà Nội. 3. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. 6 TCNCYH 25 (5) - 2003 4. Đào Văn Phan, Lại Thị Vân, Nguyễn Duy Thuần (2003), Tác dụng của Nhó đông trên gan chuột cống đợc gây nhiễm độc bằng paracetamol. Tạp chí Dợc liệu (đang in). 5. Bùi Thị Vân (2001), Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học của cây Nhó đông. Khóa luận tốt nghiệp Dợc sĩ đại học 1996- 2001. 6. Lại Thị Vân (2003), Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan và một số tác dụng dợc lý liên quan của cây Nhó đông, Luận văn Thạc sỹ y học - Đại học Y Hà Nội. 7. Ducrot R., Julou L. et al (1965), Screening methodes in pharmacology. Academic press, 114-115. 8. Litchfield J.T. et Wilcoxon F.(1949), A simplified method of evaluating dose - effect experiments. J. Pharmacol 96, Pp. 99-113. 9. Vane J. and Bothing R. (1987), Inflammation and the mechanism of action of anti inflammatory drugs - FASEB J. 1, 89-96. 10. Winter, C.A., Risley, E.A. and Nuss G.W. (1962), Carrageenin induced edema in hind paw of the rat as an assay for anti- inflammatory drugs. Proc. exp. Biol. N. J. (111), 544-574. Summary The anti inflammatory and diuretic effects and acute toxicity of aqueous extract of psychotria morindoides Hutch on rat and mice The aqueous extract of Radix Psychotria morindoides Hutch - Rubiaceae in 1:1 ratio (1ml extract is equivalent to 1 gr dried material) with the oral dose of 10g/kg body weight of rat: - Has no acute anti inflammatory effect on carrageenin-induced edema in hind paw, but reduces the amiant granuloma, as a subchronic inflammation model. - Increases the urine excretion up to 83% at the sixth hour after drug ingestion. - The DL 50 of aqueous extract could not be determined because of its very low toxicity. 7 . là: - Đánh giá tác dụng chống viêm cấp và mạn tính của Nhó đông trên mô hình thực nghiệm. - Đánh giá tác dụng lợi niệu của Nhó đông trên chuột. -. TCNCYH 25 (5) - 2003 Tác dụng chống viêm, lợi niệu và độc tính cấp tính của cây Nhó đông trên thực nghiệm Đào Văn Phan 1 , Lại Thị Vân 2 1 Đại