2008 THÔNG TIN VỀ TÁC GIẢ PHẠM VI VÀ ĐỐI TƯỢNG SỬ DỤNG CỦA GIÁO TRÌNH THƠNG TIN VỀ TÁC GIẢ Họ tên: Đặng Thị Hoàng Oanh Sinh năm:1969 Cơ quan công tác: Bộ môn: Sinh học Bệnh Thuỷ sản Khoa: Thuỷ sản Trường: Đại học cần Thơ Địa Email để liên hệ: dthoanh@ctu.edu.vn PHẠM VI VÀ ĐỐI TƯỢNG SỬ DỤNG Giáo trình dùng tham khảo cho ngành: Nuôi trồng thuỷ sản bệnh học thuỷ sản Có thể dùng cho trường nào: trường Cao đẳng đại học Các từ khóa: vi khuẩn, vi-rút, vi nấm, nguyên sinh động vật, PCR, kỹ thuật miễn dịch, bệnh cá, bệnh tôm, chẩn đoán, thủy sản Yêu cầu kiến thức trước học mơn này: sinh học bản, sinh hố, sinh học phân tử đại cương Đã xuất in chưa, có Nhà xuất nào: Giáo trình lưu hành nội Đại Học Cần Thơ Chưa xuất thức nhà xuất MỤC LỤC THƠNG TIN VỀ TÁC GIẢ MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ GIỚI THIỆU CHƯƠNG I: NHỮNG KIẾN THỨC TỔNG QUÁT 10 I.1 SỨC KHỎE VÀ ĐỘNG VẬT THỦY SẢN .10 I.2 NHỮNG VẤN ĐỀ CHUNG TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỦY SẢN 10 I.2.1 Sự đồng thao tác thu, xử lý phân tích mẫu .10 I.2.2 So sánh kết phịng thí nghiệm 10 I.2.2.1 Các dạng kết ý nghĩa chúng .10 I.2.2.2 Phương thức so sánh, ví dụ: 11 I.2.3 Những vấn đề cần lưu ý 11 I.2.3.1 Giá trị giới hạn cho phép phân tích 11 I.2.3.2 Tính hiệu lực phương pháp chẩn đốn 11 I.2.3.3 Tính ổn định phương pháp 11 I.2.3.4 Đối chứng .11 I.2.4 Phát chẩn đoán bệnh .12 I.2.4.1 Chẩn đoán lâm sàng .12 I.2.4.2 Những biện pháp sàng lọc (screening) 12 I.2.4.3 Phát bệnh (detection) .12 I.2.4.4 Chẩn đoán bệnh (diagnostic) 12 I.2.4.5 Các đường lây truyền bệnh (disease transmission) .12 I.2.5 Vai trị chẩn đốn quản lý dịch bệnh thủy sản 13 I.2.6 Các mức độ chẩn đoán bệnh thủy sản 13 I.2.6.1 Mức I: 13 I.2.6.2 Mức 2: 14 I.2.6.3 Mức 3: 14 I.2.7 Phân nhóm kỹ thuật phát hiện/chẩn đốn bệnh thủy sản 14 I.2.8 Các kỹ thuật quan sát 17 I.2.8.1 Những kỹ thuật quan sát 17 I.2.8.2 Những kỹ thuật mô học đặc biệt 17 I.2.8.3 Kỹ thuật hiển vi điện tử 17 I.2.8.4 Các kỹ thuật nuôi vi sinh vật 17 I.2.9 Các kỹ thuật huyết .17 I.2.10 Các kỹ thuật phân tử 17 I.3 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG 18 CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT .19 II.1 QUAN SÁT DẤU HIỆU BỆNH, MẪU GIẢI PHẪU TƯƠI VÀ MÔ BỆNH HỌC 19 II.1.1.Phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh 19 II.1.1.1.Những vấn đề cần lưu ý quan sát bệnh lý thủy sản .19 II.1.1.2 Quan sát bệnh lý tôm .20 II.1.1.3.Phương pháp quan sát bệnh lý cá .22 II.1.2 Phương pháp quan sát mẫu giải phẫu tươi 25 II.1.3 Phương pháp mô học 26 II.1.3.1 Mục tiêu 27 II.1.3.2 Những điều cần lưu ý sử dụng phương pháp mô bệnh học: 27 II.1.3.3 Phương pháp mô học bao gồm bước: 27 II.2 KỸ THUẬT HĨA MƠ MIỄN DỊCH .28 II.2.1 Nguyên tắc 28 II.2.2 Ứng dụng .28 II.2.3 Mẫu phân tích 29 II.2.4 Thao tác .29 II.2.5 Ưu nhược điểm phương pháp 29 II.2.5.1 Ưu điểm: .29 II.2.5.2 Nhược điểm: 30 II.3 KỸ THUẬT NUÔI VI SINH VẬT 30 II.2.1 Nuôi vi khuẩn 30 II.2.1.1 Ứng dụng 30 II.2.1.2 Phương pháp .30 II.2.1.3 Mẫu phân tích .31 II.2.1.4 Ưu nhược điểm phương pháp 31 II.2.2 Nuôi nguyên sinh động vật 31 II.2.2.1 Ứng dụng 31 II.2.2.2 Phương pháp .31 II.2.2.3 Mẫu phân tích .31 II.2.2.4 Ưu nhược điểm phương pháp 31 II.2.3 Nuôi vi-rút 31 II.2.3.1 Ứng dụng 31 II.2.3.2 Phương pháp .32 II.2.3.3 Mẫu phân tích .32 II.2.3.4 Đọc kết 32 II.3 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG II 33 CHƯƠNG III: CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH 34 III.1 PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA MIỄN DỊCH 34 III.1.1 Nguyên lý 34 III.1.2 Ứng dụng 35 III.1.3 Mẫu phân tích 35 III.1.4 Các dạng khuếch tán miễn dịch 35 III.1.4.1 Kết tủa môi trường lỏng 35 III.1.4.2 Tủa môi trường gel 37 III.1.4.3 Miễn dịch khuếch tán điện 38 III.1.4.4 Miễn dịch khuếch tán: Điện di với miễn dịch khuếch tán in situ .38 III.1.5 Ưu nhược điểm phương pháp 39 III.1.5.1 Ư u ểm: 39 III.1.5.2 Nhược điểm: 39 III.2 PHƯƠNG PHÁP NGƯNG KẾT MIỄN DỊCH 39 III.2.1 Nguyên lý 39 III.2.2 Xếp loại phản ứng ngưng kết .40 III.2.2.1 Ngưng kết trực tiếp: 40 III.2.2.2 Ngưng kết gián tiếp: 40 III.2.2.3 Ngưng kết nhân tạo: 40 III.2.3 Ứng dụng 41 III.2.4 Mẫu phân tích 41 III.2.5 Ưu nhược điểm phương pháp 41 III.2.5.1 Ư u ểm: 41 III.2.5.2 Nhược điểm: 41 III.3 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG 41 III.3.1 Nguyên lý 41 III.3.2 Phương pháp .42 III.3.2.1 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp 42 III.3.2.2 Kỹ thuật miễn dịch huỳng quang gián tiếp 42 III.3.3 Ứng dụng 43 III.3.4 Mẫu phân tích 43 III.3.5 Ưu nhược điểm phương pháp 43 III.3.5.1 Ưu điểm: 43 III.3.5.2 Nhược điểm: 43 III.4 KỸ THUẬT MIỄN DỊCH LIÊN KẾT ENZYM 44 III.4.1 Nguyên lý 44 III.4.2 Ứng dụng 45 III.4.3 Mẫu phân tích 45 III.4.4 Phương pháp .45 III.4.4.1 Kỹ thuật ELISA gián tiếp 45 III.4.4.2 Kỹ thuật ELISA trực tiếp 46 III.4.5 Ưu nhược điểm phương pháp 47 III.4.5.1 Ưu điểm: 47 III.4.5.2 Nhược điểm: 47 III.5 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG III 47 CHƯƠNG 4: CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ 48 IV.1 KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP .48 IV.1.1 Nguyên tắc 48 IV.1.1.1 Giai đoạn biến tính (denaturation): .48 IV.1.1.2 Giai đoạn lai (hybridization): 48 IV.1.1.3 Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (extension): 48 IV.1.2 Ứng dụng 49 IV.1.3 Phương pháp 50 IV.1.3.1 Ly trích DNA hay RNA từ vật chủ để sử dụng làm mạch khuôn .50 IV.1.3.2 Chuẩn bị 50 IV.1.3.3 Đối chứng 51 IV.1.4 Các hạn chế phương pháp PCR 52 IV.1.5 Các dạng PCR 52 IV.1.5.1 PCR truyền thống 52 IV.1.5.2 PCR phiên mã ngược 53 IV.1.5.3 PCR thời gian thật .54 IV.2 KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG VỀ CHIỀU DÀI ĐOẠN GIỚI HẠN 54 IV.2.1 Nguyên lý 54 IV.2.2 Phương pháp 54 IV.2.3 Hệ thống phi phóng xạ DIG .55 IV.2.4 Ứng dụng kỹ thuật lai Southern 56 IV.2.5 Mẫu phân tích 57 IV.2.6 Ưu nhược điểm 57 IV.2.6.1 Ưu điểm: .57 IV.2.6.2 Nhược điểm: 57 IV.3 KỸ THUẬT LAI IN SITU 57 IV.3.1 Nguyên lý 57 IV.3.2 Ứng dụng 57 IV.3.3 Mẫu phân tích 57 IV.3.4 Ưu nhược điểm phương pháp 58 IV.3.4.1 Ưu điểm: .58 IV.3.4.2 Nhược điểm: 58 IV.4 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG IV .58 CHƯƠNG V: MỘT SỐ QUI TRÌNH PHÁT HIỆN BỆNH Ở THỦY SẢN .59 V.1 PHÁT HIỆN VI-RÚT ĐỐM TRẮNG Ở TÔM BẰNG KỸ THUẬT PCR 59 V.1.1 Ðối tượng phạm vi áp dụng 59 V.1.2 Tài liệu tham khảo xây dựng tiêu chuẩn ngành 59 V.1.3 Giải thích thuật ngữ 59 V.1.4 Thiết bị, dụng cụ, mồi hóa chất 60 V.1.4.1 Thiết bị, dụng cụ 60 V.1.4.2 Mồi, hóa chất 61 V.1.5 Chuẩn bị mẫu .62 V.1.5.1 Số lượng mẫu .62 V.1.5.2 Yêu cầu mẫu để phân tích 63 V.1.6 Phương pháp tiến hành 63 V.1.6.1 Xử lý mẫu 63 V.1.6.2 Phản ứng khuếch đại PCR 63 V.1.6.3 Tiến hành điện di 64 V.1.7 Ðọc kết 64 V.1.8 Quy định đảm bảo an toàn 65 V.2 PHÁT HIỆN YHV VÀ GAV BẰNG KIT IQ2000 YHV/GAV 65 V.2.1 Giới thiệu 65 V.2.2 Thành phần 65 V.2.3 Thiết bị hóa chất .66 V.2.4 Giới hạn phát tính nhạy 67 V.2.5 Chuẩn bị mẫu ly trích RNA 67 V.2.5.1 Thao tác ly trích RNA 67 V.2.5.2 Hoà tan RNA 68 V.2.6 Qui trình khuếch đại 68 V.2.6.1 Chuẩn bị hoá chất phản ứng 68 V.2.6.2 Điều kiện phản ứng 68 V.2.6.3 Phương thức chuẩn bị phản ứng 69 V.2.7 Điện di 70 V.2.7.1 Chuẩn bị thạch (gel) 70 V.2.7.2 Điện di 70 V.2.7.3 Thuốc nhuộm gel đọc kết 71 V.2.8 Đọc kết 71 V.2.9 Khắc phục cố kỹ thuật 73 V.3 PHÁT HIỆN VI KHUẨN Ở CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP 74 V.3.1 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm phân lập vi khuẩn 74 V.3.2 Phương pháp RFLP 74 V.3.2.1 Ly trích DNA 74 V.3.2.2 Cắt DNA enzym giới hạn 74 V.3.2.3 Quá trình khử puria, biến tính thấm chuyển 75 V.3.2.4 Quá trình tiền lai lai DNA màng 75 V.3.2.5 Phát vạch DNA 75 V.3.3 Xử lý thống kê .75 V.3.4 Đọc kết 76 PHỤ LỤC 1: CÁC BƯỚC THU MẪU CHẨN ĐOÁN BỆNH 77 Phụ lục 1a Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh cá 77 Phụ lục 1b Các bước thu mẫu chẩn đốn bệnh tơm 79 Phụ lục 1c Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh nhuyễn thể 80 PHỤ LỤC 2: CÁC DẤU HIỆU BỆNH THƯỜNG GẶP Ở TÔM .83 PHỤ LỤC 3: CÁC DẤU HIỆU BỆNH THƯỜNG GẶP Ở CÁ 87 PHỤ LỤC 4: PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HEMATOXYLIN VÀ PHLOXINE/EOSIN 90 Công thức pha thuốc nhuộm Hematoxylin Phloxine/Eosin (H&E) 90 Qui trình nhuộm Mayer-Bennett Hematoxylin Phloxine/Eosin (H&E) 90 PHỤ LỤC 5: CÔNG THỨC DUNG DỊCH DAVIDSON,S AFA CỦA HUMASON,1972) 92 PHỤ LỤC 6: PHƯƠNG PHÁP NHUỘM NHANH PHÁT HIỆN MBV, YHV VÀ WSSV 93 A Phát MBV phương pháp nhuộm Malachite Green 93 B Phát YHV phương pháp nhuộm Wright - Giemsa .94 C Phát WSSV phương pháp nhuộm Haematoxyline Eosin 95 LỜI CẢM TẠ Tác giả chân thành cảm tạ Tiến sỹ Ngô Thị Thu Thảo Thạc sỹ Trần Thị Tuyết Hoa góp ý mặt hình thức nội dung cho giáo trình Xin cảm ơn giúp đở Cô Phạm Trần Nguyên Thảo hai em sinh viên Phạm Thị Ngọc Yến Hoàng Tuấn lớp bệnh học thủy sản khố 29 q trình chỉnh sửa chuẩn bị in giáo trình GIỚI THIỆU Q trình xét nghiệm bệnh phẩm thủy sản thường có nhiều khả người phân tích thu kết chẩn đoán tác nhân gây bệnh hội tác nhân gây bệnh chủ yếu Kết chẩn đốn bệnh phụ thuộc lớn vào tính sẵn có phương pháp chẩn đốn áp dụng phịng thí nghiệm, lãnh vực nghiên cứu người thực việc chẩn đoán phép chẩn đoán phát triển sở loài địa phương Nắm vững nguyên tắc kỹ thuật đoán cách đọc kết cách chuẩn xác có ý nghĩa quan trọng Môn học nguyên lý kỹ thuật chẩn đốn bệnh thủy sản mơn học kỹ thuật chuyên ngành bệnh học thủy sản cung cấp cho sinh viên hiểu biết nguyên lý phương pháp thực kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản Đồng thời môn học giới thiệu lãnh vực ứng dụng phương pháp chẩn đốn bệnh thủy sản Một phương pháp ứng dụng để phát hiện/chẩn đoán nhiều mầm bệnh Phần thực hành môn học cung cấp kiến thức kỹ hỗ trợ cho phần lý thuyết sở để sinh viên tiếp cận phương pháp chẩn đoán bệnh thủy sản Phần tài liệu tham khảo sử dụng để xây dựng giáo trình trình bày sau chương Sinh viên tìm thấy tài liệu từ trung tâm học liệu Đại học Cần thơ, thư viện Khoa Thủy sản hay tài liệu cá nhân giảng viên CHƯƠNG I: NHỮNG KIẾN THỨC TỔNG QUÁT I.1 SỨC KHỎE VÀ ĐỘNG VẬT THỦY SẢN Khác với vật nuôi cạn, động vật thủy sản thường địi hỏi theo dõi nhiều mơi trường sức khỏe chúng Do sống nước nên hoạt động động vật thủy sản thường khó quan sát trừ chúng bắt khỏi mặt nước bị bệnh Động vật thủy sản lại sống môi trường sinh thái phức tạp thường xuyên biến động Thêm vào đó, thức ăn thừa, thủy sản chết nhiều thứ khác ẩn đáy ao Các đối tượng nuôi thủy sản đa dạng lồi, mơi trường sống, mức độ thâm canh kỹ thuật nuôi hệ thống nuôi áp dụng Các dạng bệnh động vật thủy sản đa dạng có nhiều biến đổi, có số bệnh chưa xác định vật chủ có nhiều bệnh khơng có dấu hiệu lâm sàng riêng biệt Bệnh nuôi thủy sản thường không nguyên nhân riêng lẻ mà kết loại kiện/nguyên nhân có liên quan với có tương tác vật chủ (bao gồm điều kiện sinh lý, sinh sản giai đoạn phát triển), môi trường diện mầm bệnh Sự diện mầm bệnh mơ tơm/cá khơng có nghĩa mầm bệnh ngun nhân gây bệnh Phần lớn nguyên nhân gây bệnh biến đổi xấu môi trường gây tổn thương đến thể làm giảm khả kháng bệnh tơm/cá Trong lúc mầm bệnh sẵn có môi trường nhân hội xâm nhập vào thể chúng Do cần phải xem xét vật chủ, mầm bệnh môi trường để xác định ngun nhân gây bệnh nhằm có biện pháp phịng ngừa xử lý thích hợp I.2 NHỮNG VẤN ĐỀ CHUNG TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỦY SẢN I.2.1 Sự đồng thao tác thu, xử lý phân tích mẫu Thao tác thu, xử lý phân tích mẫu yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến kết phép chẩn đoán bệnh Thời gian thu mẫu, khoảng cách lần thu mẫu, phương pháp cố định mẫu, nhiệt độ bảo quản mẫu, chất lượng môi trường phân lập, thời gian sử dụng dung dịch hoá chất sau chuẩn bị, vv, vấn đề cần cân nhắc q trình phân tích mẫu Số lần mẫu đông lạnh rả đông ảnh hưởng đến kết phân tích Giữa phịng thí nghiệm phép phân tích sử dụng phải đồng kết đạt có ý nghĩa mặt so sánh I.2.2 So sánh kết phịng thí nghiệm Để so sánh kết phân tích hay kết chẩn đốn từ phịng thí nghiệm chẩn đoán bệnh thủy sản, yếu tố sau cần phải xem xét: I.2.2.1 Các dạng kết ý nghĩa chúng 10 - 120 ml 37-40% dung dịch đệm formalin ** - 20 ml 50% glutaraldehyde - 360 ml nước máy ** Dung dịch đệm formalin: - lít 37-40% formaldehyde - 15 g disodium phosphate (Na2HPO4) - 0.06 g sodium hydroxide (NaOH) - 0.03 g phenol red (chỉ thị pH) Dung dịch sử dụng phải sử dụng sau pha: - 500 ml nước biển qua lọc vô trùng - 500 ml dung dịch gốc 1G4F* Độ dày mô cố định khoảng 2-3 mm Mẫu giữ lâu dung dịch cố định nhiệt độ phòng Mẫu dày hay nguyên thể nhuyễn thể giữ 10% dung dịch đệm formalin có thành phần sau: ii) 10% dung dịch đệm formalin nước biển qua lọc vô trùng 10 ml 37-40% dung dịch đệm formalin ** 90 ml nước biển qua lọc vô trùng Nếu mẫu lớn 10 mm cắt mẫu thành mảnh nhỏ cố định iii) Dung dịch cố định mơ Davidson’s sử dụnh với mẫu lớn 10 mm Trước đúc parafin, phải chuyển mô sang dung dịch 50% ethanol tối thiểu giờ, sau dung dịch 70% ethanol, cho trực tiếp vào dung dịch 70% isopropanol Dung dịch cố định thích hợp chuẩn bị sau: Dung dịch gốc: - 400 ml glycerin - 800 ml formalin(37-40% formaldhyde) - 1200 ml 95% ethanol (hay 99% iso propanol) - 1200 ml nước biển qua lọc vô trùng Dung dịch sử dụng: pha phần dung dịch gốc với phần glacial acetic acid 81 Hình thái cấu tạo thể tôm Cấu tạo giải phẫu cá xương (nguồn: FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease fisheries technical paper 402/2) 82 PHỤ LỤC 2: CÁC DẤU HIỆU BỆNH THƯỜNG GẶP Ở TÔM (nguồn: FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease fisheries technical paper 402/2; Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Phương, Đặng Thị Hoàng Oanh Trần Ngọc Hải (2002) Quản lý sức khỏe tôm ao ni) Hình Tơm giống khỏe Hình Tơm giống yếu Hình Tơm khỏe Hình Tơm cịi nhiễm MBV 83 Hình Tơm ấu niên khỏe Hình Tơm có màu sẫm nước q Hình Mịn phụ Hình Gan tụy tơm bị teo (trái) Hình Lột xác khơng thành cơng Hình 10 Mịn phụ 84 Hình 11 Đốm trắng vỏ đầu ngực Hình 12 Tơm bị bệnh đốm trắng Hình 13 Tơm bị đen mang Hình 14 Ngun sinh động vật bám vỏ đầu ngực Hình 15 Tơm bị thối Hình 16 Tơm có mảng đen 85 Hình 17 Tơm bị viêm ruột Hình 18 Tơm bị đục Hình 20 Tơm bị đóng rong Hình 19 Ruột tơm rỗng (hình trên) Hình 21 Phồng nhiễm khuẩn Hình 22 Ngun sinh động vật bám phụ tôm 86 PHỤ LỤC 3: CÁC DẤU HIỆU BỆNH THƯỜNG GẶP Ở CÁ (nguồn: FAO, Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease fisheries technical paper 402/2; dự án WES thuỷ sản, Đại học Cần Thơ; Cơ Từ Thanh Dung; Cơ Phạm Trần Ngun Thảo) Hình Khoang bụng cá bống vàng Nhật Bản (Acanthogobius flavimanus) bị nhiễm ấu trùng sán (Ligula sp.) Hình Nội quan cá tra (Pangasius hypophthamus) có nhiều đốm trắng Hình Cá bống tượng bị lở loét Hình cá sặc bị lở loét 87 Hình Cá bống tượng bị lở loét nhớt Hình Cá trắm cỏ bị bệnh đốm đỏ Hình Cá lóc bị lở lt Hình Cá rơ bị xuất huyết lở loét Hình Mang cá bị nhiễm sán Hình 10 Cá bột nhiễm IHN có túi nỗn hồng bị xuất huyết 88 Hình 11 Bụng cá vàng bị trương to Hình 12 Cá hồi nhật (Onchorynchus masou) giai đoạn giống có bụng trương to Hình 13 Cá chép bị nhiễm Myxobolus artus xương Hình 14 Cá tai tượng bị trùng mỏ neo ký sinh bên 89 PHỤ LỤC 4: PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HEMATOXYLIN VÀ PHLOXINE/EOSIN (Theo Lightner ctv, 1996) Công thức pha thuốc nhuộm Hematoxylin Phloxine/Eosin (H&E) Mayer-Bennett Hematoxylin Nước cất (đun sôi) 2000 ml Hematoxylin g Sodium iodate 0.4 g Potassium aluminum potassium sulfate 180 g Citric acid g Chloral hydrate 100 g Trộn hỗn hợp theo thứ tự Eosin-Phloxine Eosin (1% aqueous eosin Y) 100 ml Phloxine (1% aqueous phloxine B) 10 ml 95 % ethanol 780 ml Glacial acetic acid ml Qui trình nhuộm Mayer-Bennett Hematoxylin Phloxine/Eosin (H&E) - Hemo De - phút - Hemo De - phút - 100 % EtOH - 10 nhúng - 100 % EtOH - 10 nhúng - 95 % EtOH - 10 nhúng - 95 % EtOH - 10 nhúng - 80 % EtOH - 10 nhúng - 80 % EtOH - 10 nhúng - 50 % EtOH - 10 nhúng - nước cất - rửa qua lần (thay nước sau lần rửa) - hematoxylin - 4-6 phút - rửa vòi nước chảy - 4-6 phút 90 - Phloxine/eosin - phút - 95 % EtOH - 10 nhúng - 95 % EtOH - 10 nhúng - 100 % EtOH - 10 nhúng - 100 % EtOH - 10 nhúng - Hemo De - 10 nhúng - Hemo De - 10 nhúng - Hemo De - 10 nhúng - Hemo De - 10 nhúng - Dán lam kính Permount - Làm dấu tiêu 91 PHỤ LỤC 5: CÔNG THỨC DUNG DỊCH DAVIDSON,S AFA CỦA HUMASON,1972) (Theo Lightner ctv, 1996) - Ethyl alcohol 330 ml - Formalin 100% 220 ml (dung dịch nước bảo hịa khí formaldehyde dung dịch 37-39 %) - acid acetic lạnh 115 ml - nước cất 355 ml Giữ nhiệt độ phòng 92 PHỤ LỤC 6: PHƯƠNG PHÁP NHUỘM NHANH PHÁT HIỆN MBV, YHV VÀ WSSV (Theo Lightner ctv, 1996) A Phát MBV phương pháp nhuộm Malachite Green Đối tượng xét nghiệm: Tơm Phương pháp • Dụng cụ: Bộ dụng cụ mổ, thớt nhựa, lame lamella, kính hiển vi • Hóa chất: Malachite green 0.05 - 0.1% , Cồn 90° • Mẫu vật: Tơm sú giống tơm lớn • Tiến hành: * Quan sát mẫu trực tiếp: - Tôm lớn: dùng dao mổ dãy ruột tôm, lấy phân tôm đặt lên lame, tán mỏng, đậy lamella quan sát kính hiển vi - Tơm bột: tán mỏng tồn thể tơm lame, đậy lamella quan sát kính hiển vi Các thể ẩn MBV có dạng cầu.Có thể có dạng đơn lẻ thường kết thành chùm * Nhuộm malachite green: - Chuẩn bị tiêu • Tơm lớn: dùng dao mổ giáp đầu ngực tôm lấy gan tụy đưa lên lame, tán mỏng • Tơm bột: tán mỏng tồn thể tơm lame - Nhỏ giọt dung dịch 0.1% Malachite green lên mẫu, đậy lamella lại - Quan sát thể ẩn MBV kính hiển vi vịng phút Các thể ẩn MBV bắt màu xanh, hình cầu đơn lẻ hay kết thành chùm Nhân giọt lipid tế bào không bắt màu 93 B Phát YHV phương pháp nhuộm Wright - Giemsa Đối tượng xét nghiệm:Tơm Phương pháp • Dụng cụ: Ống chích, kim tiêm, lame lamella, kính hiển vi • Hóa chất: dung dịch 10% formalin nước biển, methanol nguyên chất, thuốc nhuộm Wright Giemsa, nước cất • Mẫu vật: Tơm lớn • Tiến hành: * Quan sát trực tiếp kính hiển vi: - Dùng ống chích hút mẫu máu từ tim tôm - Đặt giọt máu lên lame đậy lamella lại - Quan sát tế bào máu khác thường kính hiển vi phản pha * Nhm Wright - Giemsa: - Dùng ống chích 1ml hút 0.5 ml dung dịch Formalin nước biển 10 % - Hút tiếp 0.5 ml máu tôm từ tim vào ống chích,lắc nhẹ trộn - Nhỏ giọt máu cố định từ ống chích lên lame để khô - Cố định mẫu máu lame methanol nguyên chất phút - Nhuộm Wright mẫu 3-5 phút - Ngâm lame nước cất pH 6.2 - 6.5 rong phút - Nhuộm mẫu dung dịch Giemsa (10 %) 20-30 phút - Rửa mẫu nước cất cho trôi phẩm nhuộm - Ngâm nước cất 20 -30 phút Để khô, đậy lamella Quan sát tế bào máu khác thường (tế bào rỗng) kính hiển vi 94 C Phát WSSV phương pháp nhuộm Haematoxyline Eosin Đối tượng xét nghiệm: Tôm Phương pháp - Dụng cụ: Bộ dụng cụ mổ, thớt nhựa, lame lamella, kính hiển vi - Hóa chất: Formaline, methanol ngun chất, xylene, dung dịch Davidson, dung dịch nhuộm Haematoxyline Eosin, nước cất - Mẫu vật: - Tiến hành: Tôm lớn * Chuẩn bị tiêu bản: - Dùng dao cắt phiến mang lớp biểu bì vỏ giáp cố định 1-2 dung dịch Davidson - Cắt mẫu thành mảnh thật nhỏ đặt lên lam * Nhuộm Haematoxyline Eosin: Rửa nước cất phút (lập lại lần) Nhuộm Heamatoxyline 10 phút Rửa hút nước cất phút (lập lại lần) Nhuộm Eosin phút Ngâm giây 50 % ethanol Ngâm giây 70 % ethanol Ngâm phút 90 % ethanol (lập lại lần) Ngâm phút 100 % ethanol (lập lại lần) Ngâm phút xylene 10 Rửa nước cất Quan sát tế bào tế bào rỗng bắt màu hồng Eosin kính hiển vi 95 ... dõi nghiên cứu bệnh 12 I.2.5 Vai trị chẩn đốn quản lý dịch bệnh thủy sản Chẩn đốn có hai vai trị quan trọng quản lý khống chế bệnh thủy sản Trước hết, kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản ứng dụng... việc chẩn đoán phép chẩn đoán phát triển sở loài địa phương Nắm vững nguyên tắc kỹ thuật đoán cách đọc kết cách chuẩn xác có ý nghĩa quan trọng Môn học nguyên lý kỹ thuật chẩn đốn bệnh thủy sản. .. vào tình hình mức độ nghiêm trọng dịch bệnh mà người thực việc chẩn đốn mức phải đối phó giải I.2.7 Phân nhóm kỹ thuật phát hiện /chẩn đốn bệnh thủy sản Các kỹ thuật phát hiện /chẩn đoán bệnh thủy