BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: VÕ CÔNG DANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ VÕ CÔNG DANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TẠ Không ngôn từ nào có thể nói hết tình yêu con dành cho Ba Mẹ, ngƣời sẵn sàng hy sinh tất cả vì con. Cảm ơn các anh em, những ngƣời luôn tạo động lực cho tôi tiến lên. Em xin chân thành cảm ơn: Các Thầy Cô trong trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm học. Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận. Thầy Bùi Minh Trí đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Chị Hƣng, chị Dung, chi Trân, anh Thế, anh Phƣơng, anh Khoa cùng các anh chị trong Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận. Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thu thập mẫu. Anh Bình, anh Kiệt cùng các anh trong phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu. Xin cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Sinh học 29 đã cùng tôi chia sẻ biết bao niềm vui, nỗi buồn trong suốt bốn năm đại học. Chân thành cảm ơn! Võ Công Danh iv TÓM TẮT VÕ CÔNG DANH, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 9/2007. “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. Cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ rất có giá trị về kinh tế và môi trƣờng. Việc nghiên cứu đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi là cấp thiết nhằm bảo vệ, quản lý và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ theo hƣớng đa dạng sinh học. Những kết quả đạt đƣợc Thu thập đƣợc 40 mẫu lá đƣớc với những đặc điểm hình thái khác nhau Xác định điều kiện tối ƣu để bảo quản mẫu lá đƣớc Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ lá đƣớc Xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho cây đƣớc Kết quả thực hiện phản ứng RAPD với primer OPAC10 trên 10 mẫu kết quả thu đƣợc 5 band đa hình chiếm tỷ lệ 83,3% và 1 band đồng hình chiếm tỷ lệ 16,7%. Phân tích kết quả RAPD với phần mềm NTSYSpc cho kết quả nhƣ sau: các mẫu đƣớc trồng cùng năm có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,83 – 1,00. Các mẫu đƣớc trồng năm 1978 và năm 1980 có hệ số đồng dạng di truyền biến thiên trong khoảng 0,50 – 0,83. Các mẫu đƣớc nguồn gốc tại chỗ đƣợc trồng năm 1991 và trồng năm 1996 có hệ số đồng dạng di truyền là 0,50. Những cây đƣớc đôi nguồn giống tại chỗ và nguồn giống Cà Mau có hệ số đồng dạng di truyền khá thấp từ 0,33 đến 0,67. ( II ) ( III ) v SUMMARY VO CONG DANH, Nong Lam University Ho Chi Minh City, September 2007. “DEVELOP A METHOD TO ACEESS THE GENETIC DIVERSITY OF Rhizophora apiculata Blume IN CAN GIO MANGROVE BIOPHERE RESERVE BY RAPD-PCR” Mangrove population (Rhizophora apiculata Blume) in Can Gio swamp forest eco-conservation area has a high economic and environmental value. Researching the genetic diversity of this plant is necessary to preserve and develop this area in a sustainable way. Obtained results were: Collected 40 samples of Rhizophora apiculata Found out the best conditions to preserve Rhizophora apiculata Completed DNA extraction protocol from Rhizophora apiculata Established RAPD protocol for Rhizophora apiculata We analysed 10 samples using RAPD with primer OPAC 10 and got 5 polymorphic bands (100 – 600kb) and 1 monomorphic band (170 kb) which made up 83,3 percents and 16,7 percents of bands. Analyse RAPD data with NTSYSpc software showed following results: Rhizophora apiculata planted in 1978, 1980 had high similarity from 0,83 to 1,00. Compare R. apiculata planted in 1978 with the one planted in 1980 showed a similarity from 0,50 to 0,83. The similarity of local R. apiculata and the one planted in 1991 or in 1996 is 0,50. While the local R. apiculata and the one from Camau plants had long distance from 0,33 to 0,67. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT iv SUMMARY v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ xi Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích, yêu cầu, giới hạn của đề tài 2 1.2.1. Mục đích 2 1.2.2. Yêu cầu 2 1.2.3. Giới hạn đề tài 2 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 3 2.1.1. Giới thiệu khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 3 2.1.2. Cấu trúc của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 5 2.1.3. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 6 2.2. Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây đƣớc đôi 8 2.2.1. Hình thái học 8 2.2.2. Phân bố 9 2.2.3. Vai trò của rừng đƣớc 9 2.3. Quy trình ly trích DNA thực vật 9 2.3.1. Đánh giá chất lƣợng DNA 11 vii 2.4. PCR (Polymerase chain reaction) 12 2.4.1. Khái niệm 12 2.4.2. Nguyên tắc 13 2.4.3. Ứng dụng 13 2.4.4. Ƣu và nhƣợc điểm 13 2.5. Đa dạng di truyền 14 2.5.1. Khái niệm 14 2.5.2. Ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền 14 2.6. Chỉ thị phân tử DNA (DNA marker) 15 2.6.1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 16 2.6.2. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 17 2.6.3. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 18 2.6.4. Một số nghiên cứu về chỉ thị phân tử trên cây đƣớc 21 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 22 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 22 3.1.1. Thời gian thực hiện 22 3.1.2. Địa điểm thực hiện 22 3.2. Vật liệu thí nghiệm 22 3.1.2. Mẫu đƣớc đôi 22 3.2.2. Hoá chất thí nghiệm 23 3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm 24 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 25 3.3.1. Bố trí thí nghiệm 25 3.3.2. Phƣơng pháp ly trích DNA 25 3.3.3. Kiểm tra kết quả ly trích 28 3.3.4. Kỹ thuật RAPD 30 viii 3.3.5. Phƣơng pháp đánh giá mối quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS 34 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1. Kết quả thu thập mẫu đƣớc tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 36 4.2. Bảo quản mẫu 36 4.3. Hoàn thiện quy trình ly trích DNA 37 4.4. Kết quả phản ứng RAPD – PCR 44 4.4.1. Thí nghiệm 1 44 4.4.2. Thí nghiệm 2 45 4.4.3. Thí nghiệm 3 45 4.4.4. Thí nghiệm 4 46 4.4.5. Thí nghiệm 5 47 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 5.1. Kết luận 51 5.2. Đề nghị 51 TÀI LIÊU THAM KHẢO 53 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 53 TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 54 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A, T, G, C, U: Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine, Uracine bp: Base pair CTAB: Cetyltrimethyl Ammonium Bromide dNTP: Deoxynucleotide triphosphate DNA: Deoxyribonucleic acid EB: Extraction Buffer EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid ng: Nanogram OD: Optical density PCR: Polymerase chain reaction RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease RAPD: Random Amplified Polymorphism of DNA SDS: Sodium Dodecyl Sulfate SIDA: Swedish Inernaional Devolopment cooperration Agency TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA TE: Tris EDTA Tm: Melting temperature UNESCO: United Nations Educational Scientific and Cultural Organization UBND: Ủy ban Nhân dân UV: Ultra Violet x DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 4 Hình 2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD 19 Hình 3.1 Lá, hoa, trái của cây đƣớc đôi 23 Hình 4.1 Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ 36 Hình 4.2 DNA tổng số của 4 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ (Ly trích theo 3 quy trình ) 40 Hình 4.3 DNA tổng số của 6 mẫu lá đƣớc (Lá già và lá non) thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ (Ly trích theo quy trình 3). 40 Hình 4.4 DNA tổng số của 17 mẫu lá đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 41 Hình 4.5 DNA tổng số pha loãng của 17 mẫu lá đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 41 Hình 4.6 Sản phẩm PCR với primer OPAC10 của 3 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 44 Hình 4.7 Sản phẩm PCR khảo sát nồng độ Mg 2+ ở thí nghiệm 2 45 Hình 4.8 Sản phẩm PCR khảo sát nồng độ primer OPAC10 ở thí nghiệm 3 45 Hình 4.9 Sản phẩm PCR thử nghiệm 2 primer OPAC10 VÀ OPA10 46 Hình 4.10 Sản phẩm PCR của 10 mẫu đƣớc ở thí nghiệm 5 47 Hình 4.11 Cây phân nhóm di truyền của 10 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển ngập mặn Cần Giờ 48 ( I ) ( II ) [...]... số tiểu khu trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Chỉ tiến hành kiểm tra 2 primer chọn lọc dùng trong RAPD Thời gian thực hiện từ ngày 08/05/2007 đến 30/08/2007 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.1 Giới thiệu khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nằm ở địa bàn huyện Cần Giờ, đƣợc... 2.5.2 Ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền Việc nghiên cứu đa dạng di truyền có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong chiến lƣợc quản lý, bảo vệ và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng Cần Giờ Kết quả quản lý khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ luôn luôn là kế hoạch dài hạn Từ 1978 – 1983 trồng phủ xanh bằng cây đƣớc (Rhizophora apiculata) , từ 1984 – 1999 trồng đa dạng loài để đạt đa dạng sinh học Từ... công tác trồng rừng, đảm bảo cho sự phát triển bền vững 2 Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp HCM, dƣới sự hƣớng dẫn của Thầy Bùi Minh Trí, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD 1.2 Mục... 2000 trở đi, quan sát động lực phát triển và mối quan hệ với các hệ sinh thái tiếp giáp, theo dõi độ tăng đa dạng sinh học.[5] Nghiên cứu đa dạng di truyền cây đƣớc để tìm hiểu hệ số đồng dạng di truyền, nhằm điều chỉnh kịp thời độ đa dạng di truyền của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Bởi vì khi hệ số đồng dạng di truyền cao thì ảnh hƣởng của các tác nhân nhƣ sâu bệnh là rất lớn và thiệt... trƣởng đƣờng kính của Đƣớc tại huyện Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh (Viên Ngọc Nam, 1995) Nghiên cứu sinh khối và năng suất sơ cấp rừng Đƣớc trồng tại Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh, Sở Nông Nghiệp và phát triển Nông thôn (Viên Ngọc Nam và Nnk, 1996) 22 Về nghiên cứu đa dạng di của truyền Lâm Vỹ Nguyên (2006) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) ở khu dự trữ. .. mâu thuẫn với mục tiêu của khu dự trữ sinh quyển Mối quan hệ giữa con ngƣời và thiên nhiên cần phải đƣợc hài hòa Đệm mở rộng: việc quản lý và phát triển của vùng chuyển tiếp nhằm mục tiêu mở rộng không gian có sẵn nhƣ môi trƣờng sống cho các loài thú hoang dã từ vùng đệm [5] 7 2.1.3 Vai trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ vừa là “lá phổi” vừa... mặn Cần Giờ với hầu hết giống đƣớc đƣợc thu mua ở Năm Căn (Cà Mau) Qua 22 năm khôi phục, tổ chức UNESCO sau khi kiểm tra công trình rừng ngập mặn Cần Giờ đã thống nhất công nhận là Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ vào ngày 21/01/2000 [5] Trƣớc áp lực là khu dữ trữ sinh quyển thế giới cùng với những vai trò vô cùng quan trọng về kinh tế và môi trƣờng thì việc nghiên cứu đa dạng di truyền của. .. trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Thời gian và điạ điểm thực hiện 3.1.1 Thời gian thực hiện Đề tài đƣợc thực hiện từ 08/05/2007 đến 30/08/2007 3.1.2 Địa điểm thực hiện Mẫu lá đƣớc đƣợc thu thập tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Mẫu lá đƣợc ly trích DNA và thực hiện phản ứng RAPD tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và. .. yêu cầu, giới hạn của đề tài 1.2.1 Mục đích Hoàn thiện kỹ thuật RAPD trên cây đƣớc đôi Xác định đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi tại khu dữ trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 1.2.2 Yêu cầu Thành thạo thao tác ly trích DNA tổng số từ mẫu lá đƣớc Nắm vững kỹ thuật RAPD, hạn chế sai sót khi thực hiện Hiểu rõ phần mềm NTSYSpc 2.1 1.2.3 Giới hạn đề tài Đề tài chỉ tiến hành nghiên cứu đối với quần thể... gần giữa cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) và cây đƣng (Rhizophora mucronata) [14] Năm 2002, Mukkamala Lakshmi và cộng sự đã sử dụng RAPD và RFLP nghiên cứu mối quan hệ giữa các cây thuộc họ đƣớc (Rhizophoreae) tại Ấn Độ Kết quả nghiên cứu cho thấy mối quan hệ di truyền của 10 loài thuộc họ đƣớc trong rừng ngập mặn Ấn Độ [15] 2.6.4.1 Nghiên cứu trong nƣớc Có rất nhiều nghiên cứu về cây đƣớc . về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.1. Giới thiệu khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ