BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TRÊN CHÓ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: TRƢƠNG THỊ HOÀNG DIỆU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TRÊN CHÓ Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS TRẦN THỊ DÂN TRƯƠNG THỊ HOÀNG DIỆU KỸ SƯ NGUYỄN VĂN ÚT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iii LỜI CẢM ƠN Qua 4 năm học tập tại trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, em đã đƣợc tiếp thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu, mà nó sẽ là nền tảng vững chắc cho em trong cuộc sống sau này. Để có đƣợc những thành công bƣớc đầu nhƣ ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Ba má là những ngƣời đã có công sinh thành, dƣỡng dục và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong cuộc sống, đặc biệt trong bốn năm đại học. Cô Trần Thị Dân là một nhà giáo ƣu tú, rất tận tụy trong công tác, là ngƣời đã vạch ra hƣớng nghiên cứu và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài, đồng thời trong quá trình nghiên cứu và tìm hiểu em cũng đƣợc tiếp thu thêm nhiều kiến thức chuyên ngành mới về lĩnh vực công nghệ sinh học trong sinh sản. Thầy Nguyễn Văn Út là ngƣời rất năng nổ và nhiệt tình, thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cô Quách Tuyết Anh đã cung cấp những tài liệu chuyên ngành rất bổ ích cho em làm cơ sở áp dụng trong đề tài. Cô Hồ Thị Nga đã giúp đỡ em thêm một số trang thiết bị trong quá trình thực hiện đề tài. Hai anh Khƣu Tú Phát và Nguyễn Bảo Khánh, Huỳnh Ngọc Thịnh và Võ Khánh Hƣng là những ngƣời bạn chung nhóm đề tài với em, đã trực tiếp giúp đỡ, cùng trao đổi, chia sẻ những kinh nghiệm với em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn tới tất cả bạn bè, những ngƣời đã giúp đỡ, chia sẻ với em rất nhiều trong học tập và cuộc sống. Sinh viên Trƣơng Thị Hoàng Diệu iv TÓM TẮT TRƢƠNG THỊ HOÀNG DIỆU. Lớp DH03SH, Khóa 2003-2007, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tên đề tài: “Bƣớc đầu thụ tinh trong ống nghiệm trên chó” Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS TRẦN THỊ DÂN Kỹ sƣ NGUYỄN VĂN ÚT Thời gian tiến hành đề tài: từ 1/3/2007 đến 15/8/2007 Địa điểm: phòng Nuôi cấy tế bào và phòng thí nghiệm Sinh Lý Sinh Hóa, Khoa Chăn nuôi Thú y, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. Thụ tinh trong ống nghiệm là một thành công nổi bậc của ngành công nghệ sinh học sinh sản. Phôi là nguồn nguyên liệu rất quan trọng trong công nghệ tế bào gốc, chuyển gen, tạo dòng, hay trong bảo tồn nguồn động vật quý hiếm…và chó cũng là một loài đáng đƣợc lƣu tâm. Trong đề tài có 3 thí nghiệm đƣợc tiến hành: Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng Thí nghiệm 3: So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trƣờng Fert- TALP và TYH Kết quả: Tỷ lệ trứng chín khi bổ sung β-mercaptoethanol với 50 µM là 4,88%, 100 µM là 1,65% và đối chứng (0 µM ) là 1,3%. Tỷ lệ trứng nhìn thấy rõ các giai đoạn là 21,64% với nồng độ orcein là 0,75% và 28,19% với nồng độ 1%. Tỷ lệ trứng thụ tinh trên môi trƣờng Fert- TALP là 0,4%, trên môi trƣờng TYH là 0%. v SUMMARY TRUONG THI HOANG DIEU. Class: DH03SH, course: 2003-2007, Biotechnology Department of Nong Lam University. Advisor: Prof: TRAN THI DAN Engineer: NGUYEN VAN UT Name of thesis: “Preliminary results of in vitro fertilization in dog”. Period: from the 1 st Match, 2007 to the 15 th August, 2007. Place: Cell culture lab, physiological and biochemical lab of Faculty of Animal Science and Veterinary Medicine, Nong Lam University. In vitro fertilization technology is an important achievement in reproductive biotechnology. Embryos are used for stem cell technology, animal breeding, conservation of valuable mammalian species,… including dog. The thesis consists of three experiments: To evaluate the effect of different concentrations of β-mercaptoethanol on mature oocyte rate. To examine the effect of different concentrations of orcein on staining oocyte result. To compare the effect of TYH medium and Fert-TALP medium on in vitro fertilization result. The results: Mature oocyte rate was 1,3% in control; 4,88% in 50 µM β-mercaptoethanol; 1,65% in 100 µM β-mercaptoethanol. Defined oocyte rate was 21,64% in 0,75% orcein; 28,19% in 1% orcein. Fertilized oocyte rate was 0,4% in Fert-TALP medium and 0% in TYH medium. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh mục các chữ viết tắt x Danh mục các hình và biểu đồ xi Danh mục các bảng xii Chƣơng 1 : MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu 2 1.3 Yêu cầu 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Buồng trứng 3 2.1.1 Vị trí, hình thái 3 2.1.2 Cấu tạo 3 2.1.3 Chức năng 3 2.2 Nang noãn 4 2.2.1 Đặc điểm hình thái 4 2.2.2 Sự phát triển của nang noãn 4 2.2.3 Nội tiết nang tăng trƣởng 6 2.2.4 Sự trƣởng thành của nang noãn 7 2.2.4.1 Trƣởng thành nhân 7 2.2.4.2 Trƣởng thành tế bào chất 8 2.2.5 Sự rụng trứng 9 2.3 Nuôi chín trứng trong ống nghiệm (In vitro maturation - IVM) 9 2.3.1 Lịch sử IVM 9 2.3.2 Môi trƣờng IVM 10 vii 2.3.2.1 Các loại môi trƣờng IVM 10 2.3.2.2 Thành phần trong môi trƣờng IVM 10 2.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả IVM 12 2.3.3.1 Thời gian 12 2.3.3.2 Chất lƣợng noãn và kích thƣớc nang noãn 13 2.3.3.3 Tuổi và tình trạng sinh dục chó cái 13 2.3.3.4 Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu buồng trứng 13 2.4 Phó tinh hoàn 13 2.5 Tinh trùng 15 2.5.1 Nguồn gốc và hình dạng 15 2.5.2 Quá trình sinh tinh 16 2.5.3 Cấu tạo 16 2.5.4 Thành phần 17 2.5.5 Đặc tính sinh lý 17 2.5.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của tinh trùng 18 2.6 Thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization-IVF) 19 2.6.1 Lịch sử IVF 19 2.6.2 Cơ chế của sự thụ tinh 20 2.6.3 Các giai đoạn phát triển của phôi 21 2.6.4 Vật liệu cho IVF 22 2.6.4.1 Giao tử 22 2.6.4.2 Môi trƣờng IVF 22 2.6.5 Các hệ thống thụ tinh in vitro 23 2.6.6 Đánh giá kết quả thụ tinh 24 2.6.7 Các yếu tố ảnh hƣởng đến IVF 25 Chƣơng 3: VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP 26 3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành 26 3.2 Nội dung nghiên cứu 26 3.3 Vật liệu 26 viii 3.3.1 Nguồn mẫu 26 3.3.2 Hóa chất 27 3.3.2.1 Hóa chất dùng cho trứng 27 3.3.2.2 Hóa chất dùng cho tinh trùng 29 3.3.2.3 Hóa chất dùng cho thụ tinh 30 3.3.3 Dụng cụ - thiết bị 31 3.3.3.1 Dụng cụ 31 3.3.3.2 Thiết bị 31 3.4 Bố trí thí nghiệm 32 3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ β-mercaptoethanol sử dụng để nuôi chín trứng 32 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng 32 3.4.3 Thí nghiệm 3: So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trƣờng Fert-TALP và TYH 32 3.5 Phƣơng pháp tiến hành 33 3.5.1 Thu nhận buồng trứng tại lò mổ 33 3.5.2 Xử lý buồng trứng 35 3.5.3 Tìm và rửa trứng 35 3.5.4 Phân loại trứng trƣớc khi nuôi 35 3.5.5 Nuôi trứng 36 3.5.6 Thu nhận và đánh giá trứng sau khi nuôi 36 3.5.6.1 Thu nhận trứng sau khi nuôi 36 3.5.6.2 Đánh giá trứng sau khi nuôi 37 3.5.7 Nhuộm trứng 38 3.5.8 Thu nhận tinh hoàn tại lò mổ 39 3.5.9 Thu tinh trùng và hoạt hóa tinh trùng 39 3.5.9.1 Quy trình thu nhận và hoạt hóa tinh trùng 39 3.5.9.2 Các chỉ tiêu đánh giá tinh trùng trong thụ tinh in vitro: 39 ix 3.5.10 Phƣơng pháp thụ tinh 40 3.5.10.1 Thụ tinh bằng môi trƣờng Fert-TALP 41 3.5.10.2 Thụ tinh bằng môi trƣờng TYH 42 3.6 Xử lý số liệu 42 Chƣơng 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 43 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát hiệu quả nuôi trứng khi bổ sung các nồng độ β-mercaptoethanol 43 4.2 Thí nghiệm 2 : Khảo sát nồng độ orcein phù hợp cho quy trình nhuộm trứng 44 4.3 Thí nghiệm 3 : So sánh hiệu quả thụ tinh trong môi trƣờng TYH và Fert - TALP 47 4.4 Một số kinh nghiệm trong IVF 48 4.4.1 Lấy mẫu 48 4.4.2 Thao tác trong phòng thí nghiệm 49 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 5.1 Kết luận 50 5.2 Đề nghị 50 x DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A Anaphase Kỳ sau BAS Bovine adult serum Huyết thanh bò trƣởng thành BSA Bovine serum albumine Albumine huyết thanh bò cm centimet COC Cumulus oocyte complex Phức hợp trứng - cumulus Ctv Cộng tác viên ECS Estrous cow serum Huyết thanh bò lên giống EGF Epidermal growth factor Nhân tố tăng trƣởng biểu mô Et al Cộng sự FCS Fetal calf serum Huyết thanh thai bò FSH Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang noãn GSH Glutathione GV Germinal vesicle Túi mầm GVBD Germinal vesicle break down Phá vỡ túi mầm In vitro Trong ống nghiệm In vivo Trong cơ thể sống UI Unit international Đơn vị quốc tế IVC In vitro culture Nuôi cấy trong ống nghiệm IVF In vitro fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm IVM In vitro maturation Trƣởng thành trong ống nghiệm LH Luteinizing hormone Hormone kích thích thể vàng M Metaphase Kỳ giữa mm milimet NCSU North Carolina State University T Telophase Kỳ cuối [...]... thành công trên chuột, heo, bò, nhƣng vẫn chƣa thực hiện trên chó Vì những lý do trên mà đề tài “Bƣớc đầu thụ tinh trong ống nghiệm trên chó đƣợc tiến hành 2 1.2 Mục tiêu Bƣớc đầu tìm quy trình thụ tinh trong ống nghiệm phù hợp trên chó 1.3 Yêu cầu - Nuôi chín trứng chó trong ống nghiệm - Hoạt hóa tinh trùng - Thụ tinh trứng chó trong ống nghiệm 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Buồng trứng 2.1.1... Chức năng Làm tinh trùng thành thục và dự trữ tinh trùng: Những giọt bào tƣơng còn sót lại trên cổ tinh trùng tụt dần xuống các phần tận cùng của đoạn giữa tinh trùng, hoạt lực tinh trùng tăng lên khi tinh trùng đi vào thân phó tinh hoàn Tại đuôi phó tinh hoàn, tinh trùng đƣợc cung cấp những yếu tố làm tăng khả năng thụ tinh, tinh trùng ở đuôi phó tinh hoàn có khả năng thụ tinh cao hơn tinh trùng ở... Ngày 25 tháng 7 năm 1978, lần đầu tiên trong lịch sử nhân loại, bé gái Louise Brown ra đời bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm tại một bệnh viện ở Anh Năm 1982, bé gái thứ hai Amadine ra đời bằng công nghệ này ở Pháp Những năm 80 của thế kỷ XX, kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm phát triển mạnh Singapore đƣợc ghi nhận là nơi thực hiện thành công thụ tinh trong ống nghiệm đàu tiên ở châu Á vào năm... năng thụ tinh mà không cần bổ sung chất bài tiết của các tuyến phụ Những bất bình thƣờng về hình thái tinh trùng trong tinh dịch có thể làm tăng lên trong quá trình tinh trùng đi qua và thành thục trong phó tinh hoàn (Hoàng Văn Tiến và ctv, 2005) Trong phó tinh hoàn, tinh trùng đƣợc bao bởi một màng glycoprotein giúp tinh trùng vận động tiến thẳng, thể đỉnh thành thục (Nguyễn Quang Mai và ctv, 2005) Tinh. .. với nồng độ trung bình là 105 tinh trùng di động/giếng Sự gắn tinh trùng vào màng trong suốt xảy ra sau 1-3 giờ thụ tinh, do đó sau 3h trứng có thể đƣợc rửa lại để loại bỏ tinh trùng thừa Thụ tinh trong ống mao quản và cọng rạ: Ƣu điểm là tiết kiệm trứng cũng nhƣ tinh trùng Phƣơng pháp này còn đƣợc gọi là nuôi cấy trong âm đạo Tỷ lệ thụ tinh tốt nhất đạt đƣợc trong các ống mao quản và cọng rạ với thể... bao quanh tinh trùng làm tinh trùng mang điện tích âm nên không bị ngƣng kết với nhau, hoàn chỉnh khả năng thụ tinh, tinh trùng sống trong phó tinh hoàn 7-10 ngày, tối đa 2 tháng (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005) Bảng 2.1 Lƣợng tinh trùng dữ trữ trong các phần của phó tinh hoàn (Nguồn: Davol, 2000) Trọng lƣợng (kg) Đầu phó tinh hoàn (109 tế bào/ml) Thân phó tinh hoàn (109 tế bào/ml) Đuôi phó tinh hoàn... hoạt động của tinh trùng Nồng độ tinh trùng đƣợc quyết định do số lƣợng tinh trùng và dung tích của vi giọt môi trƣờng thụ tinh Thƣờng thì nồng độ tinh trùng trong giọt thụ tinh là 105 tinh trùng bình thƣờng/ml, nếu các tinh trùng thiếu các tiêu chuẩn về độ di động và hình thái thì nồng độ thụ tinh phải cao hơn Nồng độ tinh trùng dƣới 5.104/ml thì kết quả IVF không tốt, tuy nhiên nếu nồng độ tinh trùng... kiện khác (khí, nhiệt độ, độ ẩm môi trƣờng…) Thụ tinh trong ống nghiệm 5 ml: Thích hợp nhất là ống ly tâm nhựa 5 ml với nắp mở đƣợc vặn lỏng, giúp kiểm soát tốt pH và áp suất thẩm thấu Thông thƣờng, tỷ lệ thụ tinh tối ƣu là 1 phức hợp trứng với tế bào cumulus (cumulus oocyte complex-COC)/ ống nghiệm trong 0,5 ml môi trƣờng và 5.104 tinh trùng di động Thụ tinh trong đĩa một hay bốn giếng: Thêm một thể... dƣỡng, nuôi các tiền tinh trùng (tinh tử) cho đến khi thành tinh trùng (Nguyễn Tƣờng Anh, 2002) Chỉ sau khi sự biệt hóa hoàn chỉnh, các tinh trùng mới đƣợc giải phóng vào ống tinh Cuối cùng tinh trùng vào mào tinh (mào tinh là những ống tinh cuộn lại, nằm sát tinh hoàn) và tiếp tục trƣởng thành trong một khoảng thời gian nhất định 2.5.3 Cấu tạo Tinh trùng có cấu tạo gồm 3 phần: đầu, cổ và đuôi ( Thái... tinh hoàn là đặc điểm có thể thấy đƣợc ở gia súc còn sống Bên ngoài là lớp màng sợi, trong là các ống sinh tinh Ở đầu trên khoảng 1520 ống từ tinh hoàn đi lên, chúng uốn lƣợn, gấp đi gấp lại tập trung thành 6-10 ống ở phần thân, đi xuống đuôi chỉ còn 2-3 ống, cuối cùng còn 1 ống dẫn ra khỏi đuôi phó tinh hoàn (Nguyễn Đình Nhung và ctv, 2005) Phó tinh hoàn có 2 loại tế bào (Nguyễn Quang Mai và ctv, 2005) . thụ tinh trong ống nghiệm phù hợp trên chó 1.3 Yêu cầu - Nuôi chín trứng chó trong ống nghiệm - Hoạt hóa tinh trùng - Thụ tinh trứng chó trong ống nghiệm. hiện trên chó. Vì những lý do trên mà đề tài “Bƣớc đầu thụ tinh trong ống nghiệm trên chó đƣợc tiến hành. 2 1.2 Mục tiêu Bƣớc đầu tìm quy trình thụ