Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 270-277 Trường Đại học Cần Thơ 270 ỨNG DỤNG QUI TRÌNH PCR THỜI GIAN THẬT PHÁT HIỆN VI KHUẨN Aeromonas hydrophila NHIỄM TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Đặng Thị Hoàng Oanh 1 và Đỗ Xuân Hoa 1 ABSTRACT A Syber green realtime-PCR protocol to detect Aeromonas hydrophila bacteria which causes haemorhagic disease in striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) was set up and optimized. Forward and reverse primers from Panagala et al. (2007) were used to amplified a 209 bp unique sequence of aerolysin gene of A. hydrophila. The optimized protocol can detect DNA from A. hydrophila as low as 100 pg. The specificity of the protocol were tested with other common bacteria in aquaculture including Vibrio harveyi, V. anguillarum, V. alginolyticus, Aeromonas carviae, Edwardsiella ictaluri, Pseudomonas putida, Escherichia coli and Bacillus subtilis. The result showed that optimized realtime PCR protocol can be applied for specific, rapid and sensitive detection of A. hydrophila infection in striped catfish in seed selection and effective prevention and treatment of bacterial disease in catfish. Keywords: Striped catfish, Aeromonas hydrophila, realtime PCR. Title: Study on the application of realtime PCR protocol to detect Aeromonas hydrophila bacterial infection on the striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) TÓM TẮT Qui trình realtime-PCR sử dụng Syber green phát hiện vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) được thực hiện và chuẩn hóa. Cặp mồi AeroFd và AeroRs được sử dụng để khuếch đại đoạn gen aerolysin đặc hiệu của vi khuẩn A. hydrophila với sản phẩm PCR là 209 bp (Panagala et al., 2007). Qui trình được thực hiện có khả năng phát hiện DNA vi khuẩn với hàm lượng thấp nhất là 100 pg. Tính đặc hiệu của qui trình được kiểm tra với các loài vi khuẩn phổ biế n trong thuỷ sản là Vibrio harveyi, V. anguillarum, V. alginolyticus, Edwardsiella ictaluri, Aeromonas carviae, Pseudomonas putida, Escherichia coli và Bacillus subtilis. Kết quả cho thấy có thể sử dụng qui trình để phát hiện nhanh, nhạy và đặc hiệu 1 Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 270-277 Trường Đại học Cần Thơ 271 vi khuẩn A. hydrophila nhiễm trên cá tra nhằm làm cơ sở cho việc chọn giống cũng như đề xuất giải pháp hiệu quả trong phòng và trị bệnh xuất huyết ở cá tra. Từ khóa: Cá tra, Aeromonas hydrophila, realtime PCR. 1 GIỚI THIỆU Nghề nuôi cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) đang phát triển rất mạnh và tự phát vượt ngoài tầm kiểm soát của các nhà quản lý, dẫn đến các vấn đề về ô nhiễm môi trườ ng và dịch bệnh ngày càng nhiều. Trong đó, vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng, là trở lực kìm hãm sự phát triển và mở rộng sản xuất trong nuôi trồng thủy sản. Bệnh xuất huyết do vi khuẩn Aeromonas hydrophila là một trong những bệnh phổ biến và xuất hiện hầu như quanh năm ở ao nuôi cá tra (Lý Thị Thanh Loan, 2009). Có nhiều phương pháp để phát hiện vi khuẩn A. hydrophila nhiễm trên cá tra. Các phương pháp được sử d ụng phổ biến hiện nay là phương pháp xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kít API 20E. Phương pháp PCR cũng được ứng dụng để phát hiện vi khuẩn A. hydrophila trực tiếp từ mô thận cá tra (Nguyễn Hà Giang và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2010). Tuy nhiên thời gian phát hiện mầm bệnh của các phương pháp vẫn này còn dài và định tính. Việc ứng dụng một phương pháp xác định nhanh, chính xác hơn và định lượng mầm bệnh vi khu ẩn A. hydrophila ở cá tra là nhu cầu cấp thiết trong việc quản lý dịch bệnh xuất huyết ở cá tra. Trong nghiên cứu này kỹ thuật PCR thời gian thật (realtime-PCR/qPCR) chẩn đoán bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila gây ra trên cá tra được thực hiện, chuẩn hóa và ứng dụng nhằm rút ngắn thời gian phát hiện cũng như xác định mức độ nhiễm vi khuẩn A. hydrophila trên cá tra, góp phần vào việc chọn giống, phòng ngừa và quản lý bệnh này. 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Chủng vi khuẩn được chọn để nghiên cứu là A. hydrophila CA.1.2T thuộc bộ sưu tập vi khuẩn, Khoa Thủy sản. Chủng vi khuẩn này được phân lập từ cá tra có dấu hiệu bệnh xuất huyết, vi khuẩn được nuôi trong môi trường nutrient broth (NB) có bổ sung 25% glycerol và giữ ở -80°C. Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường Trypton soya agar (TSA) và ủ ở 28 °C trong vòng 24 giờ. Sau đó chọn một khuẩn lạc rời từ đĩa cấy thuần cấy lên môi trường aeromonas agar, ủ ở 28°C trong vòng 24 giờ, sau đó nuôi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường NB. Vi khuẩn được kiểm tra bằng phương pháp PCR (Nguyễn Hà Giang và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2010) để được xác định là A. hydrophila trước khi sử dụng để thực hiện và chuẩn hóa qui trình qPCR. Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 270-277 Trường Đại học Cần Thơ 272 2.2 Chiết tách DNA vi khuẩn Vi khuẩn được nuôi tăng sinh (48 giờ) trong ống nghiệm có chứa 5 ml môi trường NB ở nhiệt độ 28ºC và được chiết tách theo phương pháp của Bartie và ctv (2006). 1,5 ml dung dịch vi khuẩn được cho vào ống ly tâm cùng với 100 µl TE (10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 8,0). Hỗn hợp được đun nóng ở 95ºC trong 15 phút, rồi được làm lạnh trong nước đá và ly tâm 2 phút ở vận tốc 14.000 vòng/phút để tách dung dịch DNA và trữ ở -20 ºC cho đến khi sử dụng. 2.3 Phản ứng Realtime PCR Mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng để chuẩn hóa qui trình qPCR là AeroFd và Aero Rv (Pannagala et al., 2007) được sử dụng để khuếch đại đoạn gen aerolysin đặc hiệu của vi khuẩn A. hydrophila với sản phẩm PCR là 209 bp. Thành phần hóa chất thực hiện phản ứng realtime PCR (6 μl/phản ứng) gồm SYBR green PCR master mix (Applied Biosystems) 2X, 0,25 μM mồi AeroFd, 0,25 μM mồi Aero Rv, DNA mẫu có hàm lượng 100 ng, 10 ng, 1 ng và 0,1 ng và nước. Chu kỳ nhiệt thực hiện phản ứng gồm giai đoạn 1: 50 o C trong 2 phút; giai đoạn 2: 95 o C trong 10 phút; giai đoạn 3: 95 o C trong 15 giây. Lặp lại 40 lần. Sau đó là 60 o C trong 1 phút. Kết quả được xác định bằng phần mềm hệ thống Realtime PCR 7500 (Applied Biosystem). Các kết quả hiển thị sau khi kết thúc phản ứng. Giá trị lớn hơn ngưỡng (threshold) thể hiện hàm lượng vi khuẩn mà hệ thống có thể phát hiện được. Phần mềm Microsoft excel được sử dụng để vẽ đường chuẩn dựa trên kết quả chu kỳ ngưỡng (Ct) (chọn 3 kết quả có giá trị gầ n nhau nhất để vẽ đường chuẩn). Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu của qui trình PCR được thực hiện với các loài vi khuẩn phổ biến trong thủy sản là Vibrio harveyi, V. anguillarum, V. alginolyticus, Edwardsiella ictaluri, A. carviae, Pseudomonas putida, Eschericchia coli và Bacillus subtilis. Sản phẩm qPCR được điện di trên gel 2% agarose trong dung dịch TAE 0,5X để xác định mức độ khuếch đại và trọng lượng phân tử đoạn DNA của vi khuẩn A. hydrophila cần phát hiện là 209 bp dựa vào thang DNA 1 kb plus (Invitrogen). 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thiết lập đường chuẩn phát hiện vi khuẩn A. hydrophila Vi khuẩn A. hydrophila sau khi được phục hồi trên môi trường TSA, tiếp tục được nuôi tăng sinh trong môi trường NB, sau đó chiết tách DNA và pha loãng về các hàm lượng 0,1, 1, 10 và 100 ng/μl để thực hiện phản ứng qPCR. Kết quả cho thấy qui trình qPCR cho kết quả khuếch đại dương tính với vi khuẩn A. hydrophila ở tất cả các hàm lượng DNA thử nghiệm (Hình 1). Trong khi đó đối với mẫu đối chứng âm (nước) thì không có sản phẩm PCR. Chu kỳ phát hiện của mẫu có hàm lượng 100 ng khoảng 24, mẫu có hàm lượng 10 ng có chu kỳ Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 270-277 Trường Đại học Cần Thơ 273 phát hiện khoảng 27, mẫu có hàm lượng 1 ng có chu kỳ phát hiện khoảng 30, mẫu có hàm lượng 0,1 ng có chu kỳ phát hiện khoảng 34. Hình 1: Sơ đồ khuếch đại của sản phẩm PCR phát hiện A. hydrophila từ DNA vi khuẩn 1: mẫu DNA vi khuẩn có hàm lượng 100ng; 2: mẫu DNA vi khuẩn có hàm lượng 10ng; 3: mẫu DNA vi khuẩn có hàm lượng 1ng; 4: mẫu DNA vi khuẩn có hàm lượng 0,1 ng. Như vậy, số bản sao đích ban đầu càng cao thì chu kỳ phát hiện càng sớm và độ tăng huỳnh quang đáng kể; qua đó, cho thấy qui trình qPCR có thể phát hiện vi khuẩn A. hydrophila ở hàm lượng cao nhất là 100 ng và hàm lượng thấp nhất là 0,1 ng (100 pg). Như vậy trong giới hạn hàm lượng DNA thích hợp thì khi hàm lượng DNA càng cao thì chu kỳ phát hiện càng sớm. Giá trị Ct tương ứng với các nồng độ DNA được trình bày ở bảng 1. Qui trình qPCR có thể phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn A. hydrophila ở hàm lượng DNA thấp hơn so với qui trình PCR truyền thống (0,1 ng/µl) (Nguyễn Hà Giang và Đặng Thị Hoàng Oanh, 2010). Thời gian thực hiện qui trình cũng được rút ngắn hơn do không phải điện di sản phẩm của quá trình khuếch đại và trong khi phản ứng đang diễn ra có thể đọc kết quả trực tiếp từ màn hình máy vi tính kết nối với hệ thống qPCR. Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 270-277 Trường Đại học Cần Thơ 274 Bảng 1. Kết quả phản ứng qPCR đối với mẫu DNA của vi khuẩn A. hydrophila Hàm lượng DNA (ng/µl) Giá trị Ct Gía trị Ct trung bình 100 23,64 23,74 23,60 23,98 10 26,54 26,55 26,50 26,62 1 29,99 29,87 29,49 30,14 0.1 33,15 33,32 32,68 33,38 Đối chứng âm (nước) Không xác định Không xác định Không xác định Không xác định Dựa vào giá trị Ct trung bình (Bảng 1) cho thấy mẫu có hàm lượng DNA gấp 10 lần độ pha loãng hàm lượng DNA mẫu kế tiếp có chu kỳ phát hiện sớm hơn khoảng 3,3 chu kỳ. Kết quả trên phù hợp với kết quả của Hunt (2007). Tính trung bình 3 giá trị Ct gần nhất ở 4 lần lặp lại của cùng 1 mẫu và thiết lập phương trình đường chuẩn biểu hiện mối tương quan giữa giá trị Ct và hàm lượng DNA vi khuẩn A. hydrophila thì được biểu đồ đường chuẩn ở hình 2. Hệ số tương quan bình phương thu được là R 2 =0, 9919 chứng tỏ mối tương quan giữa Log 10 (hàm lượng DNA) và giá trị Ct cao và tuân theo phương trình y= -3,238x+30,144. Từ phương trình đường chuẩn này có thể ứng dụng cho việc định lượng bằng cách tính hàm lượng DNA vi khuẩn A. hydrophila ban đầu dựa vào giá trị Ct trung bình. Sản phẩm của phản ứng qPCR được điện di trên gel 2% agarose nhằm kiểm tra kích thước sản phẩm PCR và hàm lượng DNA trên mẫu (Hình 3). Kết quả điện di cho thấy sản phẩm qPCR là 209 bp phù hợp với vị trí của mồi được thiết kế để phát hiện gen aerolysin của vi khuẩn A. hydrophila (Panagala et al., 2007). Thêm vào đó, độ sáng của vạch giảm dần thể hiện hàm lượng DNA ban đầu của mẫu phía trước gấp 10 lần độ pha loãng hàm lượng DNA ban đầu của mẫu kế tiếp. Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 270-277 Trường Đại học Cần Thơ 275 Hình 2. Đường chuẩn qui trình qPCR biểu thị mối tương quan giữa giá trị Ct và Log10 (hàm lượng DNA chiết tách từ E. ictaluri) phát hiện vi khuẩn A. hydrophila. Pannagala et al., (2007) đã thực hiện qui trình PCR đa mồi trong đó sử dụng mồi AeFd và AeRv phát hiện vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) với sản phẩm PCR là 209 bp. Qui trình qPCR trong nghiên cứu này cũng sử dụng cặp mồi của AeFd và AeRv phát hiện vi khuẩn A. hydrophila nhưng sử dụng chất phát màu Syber green. Kết quả phát hiện vi khuẩn A. hydrophila với sản phẩm PCR là 209 bp ở hàm lượng DNA chiết tách từ vi khuẩn nuôi tăng sinh trong môi trường NB là từ 0.1-100 ng/µl. Hình 3. Sản phẩm qPCR điện di trên gel 2% agarose phát hiện vi khuẩn A. hydrophila. Giếng M: thang DNA 100 bp (Promega). Giếng 1: đối chứng âm (nước). Giếng 2: mẫu có hàm lượng DNA 100 ng/ μ l. Giếng 3: mẫu có hàm lượng DNA 10 ng/ μ l. Giếng 4: mẫu có hàm lượng DNA 1 ng/ μ l. Giếng 5: mẫu có hàm lượng DNA 0,1 ng/ μ l. y = -3.238x + 30.144 R 2 = 0.9919 20 22 24 26 28 30 32 34 36 -1 0 1 2 Log 10 (hàm lượng DNA vi khuẩn) giá trị Ct Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 270-277 Trường Đại học Cần Thơ 276 3.2 Tính đặc hiệu của qui trình qPCR phát hiện A. hydrophila Qui trình qPCR phát hiện vi khuẩn A. hydrophila được kiểm tra tính đặc hiệu bằng cách sử dụng qui trình để phát hiện các loại vi khuẩn thường gặp trong thủy sản nước ngọt và nước lợ là Aeromonas sp, A. carviae, Bacillus subtilis, Eschericchia coli, Edwardsiella ictaluri, Pseudomonas putida, Vibrio harveyi, V. aginolyticus, V. anguillarum. Sơ đồ huỳnh quang (Hình 4) cho thấy chỉ đường huỳnh quang của A. hydrophila tăng lên đáng kể chứng tỏ gen mục tiêu của vi khuẩn A. hydrophila được sự khuếch đại, các mẫu còn lại đều cho kết quả không xác định ở 4 lần lặp lại, đồng nghĩa với không có sự khuếch đại DNA xảy ra ở các mẫu này. Từ kết quả này đã nói lên được tính đặc hiệu của các thành phần phản ứng, đoạn mồi và chu kỳ nhiệt của qui trình qPCR phát hiện đặ c hiệu vi khuẩn A. hydrophila. Cặp mồi sử dụng cho qui trình đã được Panagala et al., (2007) xác định là phát hiện đặc hiệu vi khuẩn A. hydrophila và cho kết quả âm tính với Flavobacterium columnare, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda, Eschericchia coli, Acinetobacter iwoffii, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Serriatia odorrifera và Proteus vulgaris. Hình 4. Biểu đồ khuếch đại vi khuẩn A. hydrophila và các vi khuẩn Aeromonas sp, A. carviae, Bacillus subtilis, Eschericchia coli, Edwardsiella ictaluri, Pseudomonas putida, Vibrio harveyi, V. aginolyticus, V. Anguillarum 1: A. hydrophila; 2: các vi khuẩn khác. Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 270-277 Trường Đại học Cần Thơ 277 4 KẾT LUẬN Qui trình realtime PCR có thể phát hiện vi khuẩn A. hydrophila ở hàm lượng DNA thấp hơn qui trình PCR truyền thống (0,1 ng/µl). Qui trình qPCR phát hiện vi khuẩn A. hydrophila nhiễm ở cá tra với thời gian chẩn đoán ngắn, độ nhạy cao và đặc hiệu giúp phát hiện và phân biệt mẫu nhiễm A. hydrophila với các loài vi khuẩn phổ biến trong thủy sản. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bartie, K., D. T. H. Oanh, G. Huys, C. Dickson, M. Cnockaert, J. Swings, N. T. Phương và A. Teale. (2006). Ứng dụng REP-PCR và PFGE để định tuýp vi khuẩn kháng chloramphenicol phân lập tại các trại nuôi thủy sản ở Đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí công nghệ sinh học. 4 (1): 31-40. Hunt, R. (2007). Real-time PCR. The Board of Trustees of the University South Carolina http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/realtime-home.htm, truy cập ngày 22/2/2010. Loan T. T. L., D. N. Nguyen, P. H. Vo, C. V. Doan. (2009). Hemorrhage Disease of Cultured Tra Catfish (Pangasianodon hypophthalmus) in Mekong Delta (Vietnam). The Israeli Journal of Aquaculture - Bamidgeh 61(3). Nguyễn Hà Giang, Trương Quỳnh Như, Lê Hữu Thôi và Đặng Thị Hoàng Oanh (2010). Nghiên cứu ứng dụng qui trình PCR chẩn đoán vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên thận cá tra (Pangasianodon hypopthalmus) bệnh xuất huyết. Tạp chí Khoa học, Đại họ c Cần Thơ. 16a: 136- 142. Pananagala V. S., C. A. Shoemaker, V. L. van Santen, K. Dybvig, P. H. Klesius. (2007). Multiplex-PCR for simultaneous detection of 3 bacterial fish pathogen, Flavobacterium columnare, Edwardsiella ictaluri, and Aeromonas hydrophila. Diseases of aquatic organisms, 74: 199-208. . học Cần Thơ 270 ỨNG DỤNG QUI TRÌNH PCR THỜI GIAN THẬT PHÁT HIỆN VI KHUẨN Aeromonas hydrophila NHIỄM TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Đặng. hiện A. hydrophila Qui trình qPCR phát hiện vi khuẩn A. hydrophila được kiểm tra tính đặc hiệu bằng cách sử dụng qui trình để phát hiện các loại vi khuẩn