Nhóm 10 | Tách chất | April 21, 2013 Capsaicin từ cây Ớt CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP Nhóm 10 | Tách chất P A G E | 1 I. Lời mở đầu Nước ta có nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Với xu hướng trở về với thiên nhiên, con người đã bắt tay vào khai thác nguồn tài nguyên này bằng những kĩ thuật đa dạng. Một trong số các hợp chất được quan tâm nhiều nhất ngày nay là alkaloid. Đây là một nhóm hợp chất rất phổ biến, là thành phần hợp chính trong hầu hết các nhóm thực vật và đặc biệt có nhiều ứng dụng trong y học. Ớt có nhiều ứng dụng thực tế, nó không chỉ được dùng làm thực phẩm mà còn có tác dụng chữa bệnh. Có thể nói Ớt là một dược liệu quý, có giá trị kinh tế cao. Với mục đích góp phần nâng cao hiểu biết về Dược liệu, nhóm chúng tôi chọn đề tài: “Chiết xuất và phân lập Capsaicin từ cây Ớt”. Nhóm 10 | Tách chất P A G E | 2 II. Giới thiệu 1. ĐỊNH DANH DƯỢC LIỆU  Tên khoa học: Capsicum frutescens (L.) Bail  Tên thường gọi: Ớt  Tên khác: Lạt tiêu, Lạt tử, Ngưu giác tiêu, Hải tiêu  Họ: Cà (Solanaceae) 2. MÔ TẢ CÂY Cây ớt thuộc loại thân thảo, mọc hàng năm ở các nước ôn đới, sống lâu năm và thân phía dưới hóa gỗ ở các nước nhiệt đới. Cây có nhiều cành, nhẵn. Lá mọc so le, mềm, hình thuôn dài, đầu nhọn, phiến lá dài 2 - 4 cm, rộng 1.5 – 2cm. Hình 1 Cây ớt Hình 2 Lá ớt Nhóm 10 | Tách chất P A G E | 3 Hoa màu trắng, mọc đơn mộc ở kẽ lá, mùa hoa gần như quanh năm nhưng nhiều nhất vào tháng 5-6. Qủa mọc rủ xuống hay quay lên trời (chỉ thiên), hình dáng quả thay đổi, có thứ tròn, có thứ dài, khi chín có màu đỏ, vàng hay tím. Trong chứa nhiều hạt dẹt trắng. 3. THÀNH PHẦN HÓA HỌC Trong quả ớt có 0.04 – 1.5% dẫn chất benzylamin, vị cay, trong đó thành phần chính là capsaicin (chiếm tới 70%), phần lớn tập trung ở biểu bì giá noãn, khi tán bột giá noãn, nhỏ một giọt nước lên rồi soi kính sẽ thấy các tinh thể hình vuông của capsaicin vị rất cay, pha loãng tới nồng độ 1/10 triệu còn cảm thấy vị cay. Hình 3 Hoa ớt Hình 4 Quả ớt Nhóm 10 | Tách chất P A G E | 4 Ngoài ra, còn có một số chất khác như dihydrocapsaicin (khoảng 20%), nordihydro- capsaicin (7%), homocapsaicin và homodihydrocapsaicin.  Các chất carotenoid: chất chính là capsaithin có màu đỏ; ngoài ra còn có capsorubin, krytoxanthin, zeaxanthin, lutein, α và β carotene.  Capsicosid là một saponin steroid có tác dụng kháng sinh.  Flavonoid (apiin và luteolin-7-glucozid).  Vitamin C, tỷ lệ chừng 0.8%-1.8% trong ớt của ta (bộ môn dược liệu định lượng năm 1957). Có những tác giả nghiên cứu ớt ở Châu Phi, Hungary thấy hàm lượng vitamin C lên tới 4.89%.  Chất đường tới 7%.  Ngoài ra còn có các acid hữu cơ như acid citric, acid malic… 4. PHÂN BỐ VÀ SINH THÁI Cây ớt có nguồn gốc Nam Mĩ, bắt nguồn từ một số loài hoang dại, được thuần hóa và trồng ở Châu Âu, Ấn Độ cách đây hơn 500 năm. Nhóm 10 | Tách chất P A G E | 5 Christopher Columbus đã là một trong những người châu Âu đầu tiên thấy ớt (ở Caribe), và gọi chúng là "tiêu" vì chúng có vị cay tương tự (không phải bề ngoài giống nhau). Ớt đã được trồng khắp nơi trên thế giới sau thời Columbus. Diego Álvarez Chanca, một thầy thuốc trong chuyến đi thứ hai của Columbus đến Đông Ấn Độ năm 1493, đã mang những hạt ớt đầu tiên về Tây Ban Nha, và đã lần đầu viết về các tác dụng dược lý của chúng vào năm 1494. Tuy nhiên ở nước ta chưa phát triển lắm. Tại nhiều nước như Nhật Bản, Indonexia, Ấn Độ, nhất là Hungari người ta trồng hàng nghìn hecta, mỗi năm xuất cảng từ 2.500 đến 3000 tấn ớt khô. Hiện nay, Ấn Độ là nước sản xuất ớt lớn nhất thế giới với khoảng 1 triệu tấn mỗi năm. Được trồng khắp nơi ở Việt Nam. Có những cây mọc hoang, nhưng có lẽ do nhà gần đấy trồng trước sau đó bỏ đi nơi khác còn sống sót lại. Ớt có biên độ thời vụ rộng, những vùng chuyên canh có thể gieo trồng vào 2 thời vụ chính:  Vụ đông xuân: gieo hạt tháng 10-12, trồng tháng 12-2.  Vụ hè thu: gieo hạt tháng 6-7, trồng tháng 8-9. 5. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA ỚT a. Y học cổ truyền  Ớt có vị cay, nóng.  Tác dụng khoan trung, tán hàn, kiện tỳ, tiêu thực, chỉ thống (giảm đau), kháng nham (chữa ung thư )  Nhân dân thường dùng để chữa đau bụng do lạnh, tiêu hóa kém, đau khớp, dùng ngoài chữa rắn rết cắn  Một số bài thuốc Nam thông dụng có ớt.  Chữa rụng tóc do hóa trị liệu, giảm đau do ung thư, đau khớp. Chữa ăn uống kém tiêu do ung thư.  Chữa đau thắt ngực, đau dạ dày do lạnh.  Chữa viêm khớp mãn tính, chữa bệnh chàm, chữa bệnh vẩy nến.  Chữa rắn rết cắn.  Đau bụng kinh niên, đau lưng, đau khớp.  Chữa mụn nhọt. Nhóm 10 | Tách chất P A G E | 6 b. Y học hiện đại Nghiên cứu của y học hiện đại cũng thống nhất với y học cổ truyền về tác dụng chữa bệnh của ớt. Kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc cho thấy quả ớt có rất nhiều ích lợi cho sức khỏe. Trong ớt có chứa một số hoạt chất sau: Capsicain là một Alkaloid chiếm tỷ lệ khoảng 0.05 – 2%, là hoạt chất gây đỏ, nóng, chỉ xuất hiện khi quả ớt chín. Một điều lý thú là Capsaicin có tác dụng kích thích não bộ sản xuất ra chất Endorphin, một chất Morphin nội sinh, có đặc tính như những thuốc giảm đau, đặc biệt có ích cho những bệnh nhân bị viêm khớp mạn tính và các bệnh ung thư. Ngoài ra, ớt còn giúp ngăn ngừa bệnh tim do chứa một số hoạt chất giúp máu lưu thông tốt, tránh được tình trạng đông vón tiểu cầu dễ gây tai biến tim mạch. Ớt còn có tác dụng ngăn ngừa tình trạng huyết áp tăng cao. Một số nghiên cứu cho thấy, những loại ớt vỏ xanh, trái nhỏ có hàm lượng capsaicin nhiều hơn. Ngoài ra, trong quả ớt còn chứa nhiều loại vitamin như vitamin C, B1, B2, acid citric, acid malic, beta caroten III. Thực nghiệm A. Phương pháp 1: Chiết xuất capsaicinoid toàn phần, sau đó phân lập và tinh khiết hóa capsacin. 1. CHIẾT XUẤT CAPSACINOID TOÀN PHẦN: Chuẩn bị: Trái ớt được mua từ một chợ ở địa phương trong huyện Mae Chan, Chiangrai, Thái Lan ở dạng ớt khô. Dược liệu được đóng gói trong túi nhựa đã được tẩy với nitơ, và được lưu trữ ở 40C trước khi sử dụng. a. Ngâm 25g bột dược liệu được ngấm kiệt với 200ml ethanol 95% trong bình chứa dung tích 250ml. Tiến hành ở 450C, 250 vòng/phút trong 15h. b. Chiết bằng Soxhlet: Nhóm 10 | Tách chất P A G E | 7 Chuẩn bị dung cụ chiết:  Soxhlet dung tích 250ml: làm 1 túi bằng giấy lọc hình trụ có kích thước vừa với thân Soxhlet, đầu trên của túi không thấp hơn đầu trên của ống dẫn dung môi (ống nhỏ) và không cao hơn lỗ thông của ống dẫn hơi dung môi (ống lớn).  Cân khoảng 25g dược liệu. Nghiền nhỏ dược liệu trong cối sứ, có thể thêm cát trung tính để tăng độ xốp, nếu dược liệu có độ ẩm cao thì nên nghiền với Na 2 SO 4 khan.  Cho dược liệu đã nghiền nhỏ vào túi giấy, dùng bông gòn tẩm dung môi lau sạch cối và cho lên phía trên lớp dược liệu. Phủ lên trên mặt dược liệu một lớp giấy lọc ngăn không cho dược liệu nổi lên trên và rơi xuống bình chiết (có thể thêm vài viên bi thủy tinh dằn lên trên miếng giấy lọc). Hình 5 Bộ dụng cụ chiết Soxhlet Nhóm 10 | Tách chất P A G E | 8  Lắp dụng cụ trên bếp cách thủy, dùng phễu rót ethanol 95% qua sinh hàn (khoảng 200ml).  Kiểm tra lần cuối toàn bộ dụng cụ, nước sinh hàn. Khống chế nhiệt độ ở 78.1 0 C. Đun trên bếp cách thủy trong 5h.  Thu dịch chiết. c. Chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm Thử nghiệm được tiến hành 3 lần trong bồn siêu âm với tần số 35 kHz với mức năng lượng là 600W (Bandelin Sonorex Super RK 1050), nhiệt độ 45°C trong 3h. Bình chứa hình chữ nhật (50cm: 60cm: 20cm) phối hợp với bồn điều nhiệt (Polyscience 9610, USA). Erlen 250ml gồm 25g dược liệu với kích cỡ 3mm cùng với dung môi (ethanol 95%) được nhúng chìm vào bồn siêu âm được kiểm soát theo mức nước khoảng 10 mm từ dưới đáy bồn. Kích cỡ dược liệu đóng vai trò quan trọng trong quá trình chiết xuất, nếu kích cỡ nhỏ hơn 3mm sẽ gây bất tiện khi lọc. d. Phương pháp phân tích capsaicinoid Nồng độ của capsaicinoid được xác định theo các phương pháp của Hiệp hội các cộng đồng phân tích (AOAC: Association of Official Agricultural Chemists), phương pháp sử dụng một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC: High Performance Liquid Chromatography); thiết bị phân tách sản phẩm Thermo Separation Product (TSP) bao gồm các hệ thống phân phối dung môi Spectra P1000 và đầu dò UV-6000LP, UV – Vis (Thermo Separation Product, Hoa Kỳ). Một cột (150 x 4,6 mm ID) được nạp với pha tĩnh C18 kích thước hạt 5 µm, pha động chạy đẳng dòng acetonitrile 40% trong 1% acetic acid (v/v) với tốc độ dòng 1,5 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu là 20 µl và bước sóng là 280nm. Nồng độ của capsaicinoid gồm nồng độ capsaicin, dihydrocapsaicin và nordihydrocapsacin. Thời gian lưu và diện tích peak phải đặc trưng cho 3 lần tiêm mẫu. Nồng độ capsaicinoid được định lượng trên cơ sở một đường cong hiệu chuẩn tương ứng bằng cách sử dụng các chất chuẩn. Để xác định trọng lượng khô, 2 g mẫu cho vào một khay nhôm nhỏ được đặt trong một lò chân không tại một áp suất 90 mbar và 105°C trong 4 giờ và sau đó cân. e. Kết quả và nhận xét Hiệu quả và thời gian chiết bằng siêu âm Nhóm 10 | Tách chất P A G E | 9 Hiệu quả của siêu âm và thời gian chiết xuất trong việc thu hồi capsaicinoid được thể hiện trong hình 1: Tốc độ chiết capsaicinoid rất cao trong thời gian 5 phút đầu tiên. Sau đó, việc thu hồi capsaicinoid tăng dần với thời gian chiết xuất. PHƯƠNG PHÁP THỜI GIAN NHIỆT ĐỘ ( 0 C) DƯỢC LIỆU: DUNG MÔI TỶ LỆ PHỤC HỒI (%) NGÂM 15h 45.0 1:8 79.4 SOXHLET 5h 78.1 1:8 92.0 UAE 3h 45.0 1:8 87.4 UAE 3h 45.0 1:6 84.5 UAE 3h 45.0 1:5 84.3 Thu hồi Capsaicinoid bằng UAE (Ultrasound Assisted Extraction ) trong 3 giờ được so với ngâm (15 h) và Soxhlet (5 h). Phần trăm thu hồi capsaicinoid tương ứng bởi ngâm, Soxhlet và UAE là 79.4, 92.0 và 87.4. UAE đã thu hồi hơn 8% capsaicinoid so với phương pháp ngâm nhưng thấp hơn Hình 1 Liên hệ giữa sóng siêu âm và thời gian chiết ở 45°C [...]... môi và năng lượng tiêu thụ Do đó, tỷ lệ trọng lượng khô của bột ớt với ethanol 95% được chọn 01:05 2 PHÂN LẬP CAPSAICIN TỪ CAPSAICINOIDS Nhồi cột với 300g silicagel, nạp mẫu và tiến hành rửa giải với 3 dung môi có độ phân cực tăng dần: hexane, EtOH và MeOH Dung môi rửa giải được thu lại và xác định sơ bộ bằng sắc kí lớp mỏng gồm 11 phân đoạn Phân đoạn 5 và 6 tiếp tục chạy sắc kí cột lần lượt với 60g và. .. môi thâm nhập vào tế bào thực vật Tỷ lệ phóng thích capsaicinoid rất cao khi bắt đầu do hiệu ứng của gradient nồng độ capsaicinoid giữa dung môi và dược liệu và dễ dàng để chiết xuất từ phần bên ngoài của các hạt ở giai đoạn sớm Sau đó tỷ lệ phóng thích capsaicinoid giảm đáng kể do gradient nồng độ thấp hơn và vì capsaicinoid còn lại được nằm ở phần bên trong Hiệu quả của nhiệt độ chiết xuất Hiệu quả... trong dung dịch solution trong chiết capsaicinoids ở 30 – 600C Đối với tất cả nhiệt độ kiểm soát, thấy rằng ethanol 50% không hiệu quả cho chiết xuất capsaicinoid Điều này do sự khác biệt trong phân cực giữa các dung môi và các hợp chất chiết xuất Sự phân cực của capsaicinoid là thấp hơn nhiều so với nước, điều đó không tốt khi hòa tan trong ethanol 50% Tại 450C, sự thu hồi capsaicinoid yếu hơn nhiều khi... hợp capsaicin và dihydrocapsaicin (1) Phân lập epoxide -capsaicin: Hòa tan hỗn hợp (1) trong EtOAc (2ml) đã được thêm mCPBA (meta-cloroperoxybenzoic acid (17.2mg, 0.1mmol) ở 00C, dung dịch được khuấy trộn trong 6h và sau đó làm ấm ở nhiệt độ phòng Sau đó thêm nước vào và chiết với EtOAc (3 x 20ml) Lớp hữu cơ được rửa lại với nước và nước muối Lớp hữu cơ này được tinh chế Quá trình tinh khiết hóa capsaicin. .. ta không dùng Quá trình chiết bằng Soxhlet thu được tỷ lệ capsaicinoid cao nhất (92%) vì quá trình chiết xuất được tiến hành ở 78.10C và dung môi luôn được làm mới trong quá trình chiết xuất Quá trình chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm có tỷ lệ capsaicinoid cao hơn phương pháp ngâm 12.6%, nhưng thấp hơn dùng Soxlet khoảng 5% Tuy nhiên ta không thể thực hiện quá trình chiết xuất với sự hỗ trợ của sóng...Nhóm 10 | Tách chất khoảng 5% so với dùng Soxlet Chiết xuất bằng Soxhlet cho việc thu hồi tỷ lệ capsaicinoid cao nhất, vì quá trình chiết xuất được thực hiện tại nhiệt độ sôi (78.10C) và dung môi luôn được làm mới UAE cải thiện đáng kể sản lượng chiết xuất UAE có thể đẩy nhanh sự trương nở và hydrat hóa, gây ra mở rộng lỗ rỗng bên trong các tế bào thực vật Sự phá vỡ các... quả của nhiệt độ chiết xuất Hiệu quả của nhiệt độ trong phóng thích capsaicinoid khi chiết xuất bằng 95% ethanol và acetone làm dung môi được hiển thị tương ứng trong hình 2 và 3 Hình 2 Hiệu quả của nhiệt độ chiết bằng UAE, capsaicinoids 95% Khi dùng ethanol 95% làm dung môi, sự gia tăng nhiệt độ từ 300C đến 450C tăng cường việc thu hồi capsaicinoid P A G E | 10 Nhóm 10 | Tách chất Nhiệt độ ảnh hưởng... G E | 13 Nhóm 10 | Tách chất IV Kết luận Từ cây ớt Capsicum frutescens (L) Bail: bằng thực nghiệm capsaicinoid đã được chiết xuất bằng các phương pháp ngâm, Soxhlet, UAE Kết quả thu được như bảng 1 Phương pháp ngâm thời gian tiến hành lâu nhất (15h) và tỷ lệ phục hồi capsaicinoid thấp nhất (79.4%) do quá trình ngâm để tự nhiên cho quá trình thẩm thấu, hòa tan và khuếch tan diễn ra hoàn toàn mà không... 11 Nhóm 10 | Tách chất so với ethanol và nước, do đó nhiều bọt nhưng hiệu quả phá vỡ không cao, đặc biệt là ở nhiệt độ chiết xuất Do đó, việc tăng cường hiệu quả chiết xuất bởi hiệu ứng tại khoang sử dụng aceton thấp hơn so với ethanol hoặc nước Hiệu lực của tỷ lệ của nước trong ethanol Tỷ lệ nước trong dung môi ethanol có một ảnh hưởng quan trọng trong chiết xuất capsaicinoid (hình 4) Hình 4: Tỷ lệ... chất cần chiết ra khỏi dược liệu nhanh hơn Sau đó, bằng sắc ký cột cổ điển đã phân lập được capsaicin P A G E | 14 Nhóm 10 | Tách chất V Các chế phẩm có chứa capsaicin P A G E | 15 Nhóm 10 | Tách chất VI Tài liệu tham khảo 1 Bosland, P., 1996 "Capsicums: Innovative uses of an ancient crop" 2 Chi, V V., 1997 Từ điển cây thuốc Việt Nam NXB Y Học 3 G.F Barbero, Ultrasound-assisted extraction of capsaicinoids . Capsaicin từ cây Ớt CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP Nhóm 10 | Tách chất P A G E | 1 I. Lời mở đầu Nước ta có nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú và. 1: Chiết xuất capsaicinoid toàn phần, sau đó phân lập và tinh khiết hóa capsacin. 1. CHIẾT XUẤT CAPSACINOID TOÀN PHẦN: Chuẩn bị: Trái ớt được mua từ