KT QU HOT NG BO TN QU GEN VI SINH VT TRNG TRT GIAI ON 2006-2010 Nguyn Thu H 1 SUMMARY Agriculture culture collection at soils and fertilizers research institute (Period 2006-2010) The establishment of an agriculture culture collection plays an important role to significantly support for biotechnological development. The main activities of agriculture culture collection are preserving, collect, isolate, evaluate, taxonomy, document and research on application ability of microbes. 673 strains from foreign and domestic including bacteria, yeasts and filamentous fungi were collected, isolated and preserved. Slant agar, sterile distilled water, liquid paraffin, freeze-drying, methylcellulose, or liquid nitrogen freezing was used to preserve cultures to maintain the existent capacity and active biology of them. 49 strains have been screened based on biological activity. 88/183 evaluated strains (48,09%) of agriculture culture collection have multi functional biological activity (nitrogen fixing, phosphorous solubilizing, cellulose degradation, plant growth promoting, tolerant to high temperature, anti pathogenic bacteria, fungi and etc). Bergeys key taxonomy, Kit API 20E, API 20NE, API 50CH, BIOLOG or sequence analysis of 16S rRNA genes was used for microbial taxonomy. Microbes have been researched, evaluated and utilized in agriculture such as micro-biofertilizer or microbial inoculant. 50 strains have been introduced to produce micro-biofertilizer or microbial inoculants. Keyword: Strain, collect, isolate, preserve, evaluate, utilize, biological activity, micro-biofertilizer and microbial inoculant. I. ĐặT VấN Đề Ngun gen vi sinh vt cú vai trũ vụ cựng quan trng trong chin lc phỏt trin cụng ngh sinh hc. õy l ngun vt liu khi u cho cỏc k thut di truyn, cụng ngh vi sinh v cụng ngh lờn men. Cụng tỏc lu gi v bo tn ngun gen vi sinh vt cú mt ý ngha ln trong mi phũng nghiờn cu v trong cụng ngh vi sinh. T nm 1994, Vin Khoa hc K thut Nụng nghip Vit Nam trc õy, nay l Vin Th nhng Nụng húa c giao nhim v bo tn qu gen vi sinh vt trng trt. Nhim v ca cụng tỏc bo tn qu gen vi sinh vt trng trt l bo qun, thu thp, tuyn chn, ỏnh giỏ, phõn loi, t liu húa, nghiờn cu khai thỏc v s dng cú hiu qu ngun gen vi sinh vt phc v phỏt trin bn vng [2, 3, 4]. II. VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 1. Vt liu nghiờn cu Ngun gen vi sinh vt. 2. Phng phỏp nghiờn cu: 1. Bo qun cỏc chng vi sinh vt bng phng phỏp bo qun thch nghiờng, trong nc ct kh trựng, trong cỏt, parafin, lnh sõu, methylcellulose (MC), ụng khụ v nit lng, v.v [1, 4, 5] 2. Phng phỏp ly mu theo TCVN v TCN; mu t, r c thu thp theo i tng cõy trng (rau, u, lc ) v theo vựng sinh thỏi. 1 Vin Th nhng Nụng hoỏ 3. Phân lp, tuyn chn, xác nh mt s c im sinh hc và nh hưng ca iu kin nuôi cy n hot tính sinh hc ca các chng vi sinh vt ưc xác nh theo các phương pháp nghiên cu vi sinh vt thông thưng. 4. Phương pháp xác nh mt  vi sinh vt theo TCVN 4884:2005 [9]. 5. Phương pháp xác nh hot tính i kháng vi khuNn, nm gây bnh theo 10 TCN 714:2006 [11], 10 TCN 867:2006 [12]. 6. Kh năng sinh tng hp IAA thô ưc xác nh theo phương pháp Salkowsky ci tin. 7. Kh năng hình thành nt sn ưc xác nh bng phương pháp trng cây trong nhà lưi, trên cát vô trùng, thí nghim ưc b trí ngu nhiên, 4 ln nhc. Ch tiêu theo dõi: N t sn tng s. 8. Kh năng c nh nitơ ưc xác nh theo 10 TCN 299:97 [10]. 9. Kh năng phân gii xenlulo ưc xác nh theo TCVN 6168:2002 [8]. 10. Kh năng phân gii pht phát khó tan ưc xác nh theo TCVN 6167:1996 [7]. 11. Kh năng chuyn hóa nitrat ca các chng vi sinh vt ưc xác nh bng cách o hàm lưng N O 2 - trên máy quang ph k da vào phn ng vi thuc th Griss. 12. Phương pháp phân loi các chng vi sinh vt: - Xác nh tên vi sinh vt theo khóa phân loi ca Bergey [6]. - Xác nh tên vi sinh vt bng Kit API 20E, API 20N E, API 50CH hoc máy BIOLOG: Da trên phn ng sinh hóa ca chng vi sinh vt i vi 20, 50 hoc 95 ngun các bon khác nhau. - Xác nh tên vi sinh vt bng phương pháp phân loi hc phân t da trên cơ s gii trình t on gen 16s ARN riboxom ca các chng vi khuNn nghiên cu, so sánh vi các trình t có sn trong ngân hàng gen quc t EMBL bng phương pháp FASTA 33  nh loi n loài các chng vi sinh vt. 3. Phương pháp x lý s liu theo chương trình thng kê IRRISTAT. III. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN 1. Bảo quản nguồn gen vi sinh vật Qu gen vi sinh vt nông nghip hin lưu gi 673 chng vi sinh vt. Các chng vi sinh vt bo qun ưc nh kỳ cy chuyn sau thi gian thích hp (1, 3, 6 hay 12 tháng), tùy thuc vào tng nhóm chng ging. Nhiu phương pháp khác nhau ưc s dng trong bo qun ngun gen vi sinh vt (thch nghiêng, nitơ lng, lnh sâu (- 20 0 C), Methylcellulose (MC), v.v S lưng, chng loi, ngun gc và phương pháp bo qun ngun gen vi sinh vt trng trt ưc trình bày trong bng 1. Bảng 1. Số lượng, chủng loại, nguồn gốc và phương pháp bảo quản nguồn gen vi sinh vật trồng trọt TT Đối tượng Nguồn gốc Số lượng Hoạt tính sinh học Phương pháp bảo quản 1 Vi khuẩn: Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Bradyrhizobium (cho đậu tương, đậu xanh, đậu đen, lạc), Enterobacter, Pseudomonas, Burkholderia, Lactobacterium, Việt Nam Nhập nội 487 101 Cố định nitơ, phân gi ải lân, kích thích sinh trư ởng, sinh polysacharit, ức chế vi khuẩn-n ấm gây bệnh héo xanh, th ối rễ, phân giải xenllulo, sinh axit amin, Thạch nghiêng, Thạch bán lỏng, Methylcellulose, Lạnh sâu (-20 O C), Nitơ lỏng, Flavobacteria, Klebsiella v.v chuyển hóa nitrat, v.v Đông khô 2 Xạ khuẩn: Streptomyces Việt Nam Nhập nội 54 1 Phân giải xenlluloza Thạch nghiêng 3 Nấm men: Candida, Rhodotorula, Saccharomyces, Pichia Việt Nam Nhập nội 11 1 Lên men sinh kh ối, sinh carotenoit, lên men rượu, ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh Thạch nghiêng 4 Nấm sợi: Aspergilus, Fusarium, Penicilium, Rhizoctonia, Chetomium, Penicilium Việt Nam Nhập nội 12 6 Phân gi ải lân, gây bệnh th ực vật, phân giải xenluloza Thạch nghiêng Tổng 673 2. Thu thập, phân lập làm giàu nguồn gen Thu thp, phân lp làm giàu ngun gen là mt trong các nhim v ca bo tn qu gen vi sinh vt trng trt. Giai on 2006- 2010, qu gen vi sinh vt ã tin hành phân lp, tuyn chn ưc 49 ngun gen vi sinh vt t các mu t, mu r, cây lc, u tương, rau, ngô, khoai tây, h tiêu, cà phê, v.v thu thp t Hà Ni, Bc Giang, Sơn La, Hưng Yên, Nam nh, Ngh An, Thanh Hóa, Qung Tr, v.v 3. Đánh giá nguồn gen Phc v cho công tác tư liu hoá, bo qun và khai thác s dng ngun gen vi sinh vt, các chng vi sinh vt mi phân lp ưc ánh giá c im vi sinh vt hc (c im hình thái, t bào), hot tính sinh hc (c nh nitơ cng sinh, c nh nitơ t do, kích thích sinh trưng thc vt, sinh polysacharit, phân gii tinh bt, phân gii xenlulo, phân gii pht phát khó tan và c ch nm-vi khuNn gây bnh vùng r cây trng, v.v ). Cùng vi s phát trin ca khoa hc công ngh, nhiu nghiên cu trong thi gian gn ây ã cho thy nhiu vi sinh vt có kh năng a hot tính. Vì vy, vic ánh giá tính a chc năng ca ngun gen vi sinh vt ang lưu gi là mt trong các ni dung ca qu gen vi sinh vt trng trt. Kt qu ánh giá 183 ngun gen vi sinh vt (thuc Agrobacterium, Athrobacter, Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas và x khuNn) có 88 ngun gen a hot tính (chim 48,09%); c bit nhiu chng trong s ó có trên 3 hot tính sinh hc. ây là ngun gen có giá tr, nu ưc nghiên cu khai thác s dng hp lý. Kt qu ánh giá hot tính sinh hc ca ngun gen vi sinh vt ưc th hin trong bng 2. Bảng 2. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của nguồn gen vi sinh vật TT Nhóm vi sinh vật Số lượng Chỉ tiêu đánh giá Kết quả đánh giá 1 Agrobacterium 8 - Khả năng sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật (sinh IAA) - Khả năng sinh polysacharit - 2/8 nguồn gen Agrobacterium được đánh giá (chi ếm 25%) có 2 hoạt tính sinh học; Nguồn gen Agrobacterium được đánh giá có hàm lượng IAA hình thành đ ạt cao nhất sau 9 ngày nuôi cấy (46,08-180,0 µg/ml), trừ ngu ồn gen Ag 06 đạt cao nhất sau 3 ngày nuôi cấy. - 2/8 nguồn gen Agrobacterium được đánh giá có kh ả năng sinh polysacharit (hàm lượng polysacharit h ình thành đạt 18,5 và 49,5 g/l. TT Nhóm vi sinh vật Số lượng Chỉ tiêu đánh giá Kết quả đánh giá 2 Athrobacter 5 - Khả năng sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật (sinh IAA) - Khả năng sinh polysacharit - 1/5 nguồn gen Athrobacter được đánh giá (chiếm 20%) có 2 hoạt tính sinh học. Nguồn gen Athrobacter được đánh giá có hàm lượng IAA hình thành đ ạt cao nhất sau 7-9 ngày nuôi cấy (16,94-134,8 µg/ml). - 1/5 nguồn gen Athrobacter được đánh giá có khả năng sinh polysacharit (hàm lượng polysacharit hình thành đạt 6,8 g/l). 3 Azotobacter 50 - Khả năng cố định nitơ - Khả năng sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật - Khả năng sinh polysacharit - 16/50 chủng Azotobacter được đánh giá (chiếm 32%) có 3 hoạt tính sinh học (cố định nitơ, sinh ho ạt chất kích thích trưởng sinh thực vật và sinh polysacharit); 24 ch ủng (chiếm 48%) có 2 hoạt tính sinh học và 10 chủng (chiếm 20%) có 1 hoạt tính sinh học. - 43/50 chủng Azotobacter được đánh giá có khả năng c ố định nitơ. Hàm lượng etylen hình thành đạt từ 4,5 - 4327,6 nmol/ml/ngày; trong đó 24 chủng có hàm lượng etylen hình thành đạt >2000 nmol/ml/ngày; - 45/50 chủng Azotobacter được đánh giá có khả nă ng sinh chất kích thích sinh trưởng. Hàm lượng IAA h ình thành đạt từ 7,61 - 95,16 µg/ml; - 18/50 chủng Azotobacter được đánh giá có khả nă ng sinh polysacharit. Hàm lượng polysacharit hình thành đ ạt 28 - 489 g/l. 4 Bacillus 46 - Khả năng sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật (sinh IAA thô) - Khả năng phân giải kitin - Khả năng phân giải xenlluloza, bột giấy - Khả năng phân giải phốt phát khó tan - Khả năng ức chế nấm, vi khuẩn gây bệnh vùng rễ cây trồng - 44/46 chủng Bacillus (chiếm 95,65%) có khả nă ng sinh IAA thô; trong đó 9 chủng (chiếm 19,57%) có khả nă ng sinh IAA thô trên 300 µg/ml. - 34/46 chủng Bacillus (chiếm 73,91%) có kh ả năng phân giải kitin; trong đó có 14 chủng Bacillus (chiếm 30,44%) có khả năng phân giải kitin trên 30mm. - 3/46 chủng Bacillus (chi ếm 6,5%) có khả năng phân giải phốt phát canxi. - 32 chủng Bacillus (chiếm 69,57%) có khả năng phân giải bột xenlulo và bột giấy; trong đó có 13 chủng Bacillus (chiếm 28,26%) có đường kính vòng phân giải trên 30 mm. - 24/46 chủng Bacillus (chiếm 52,17%) không hoặc ức chế VKHX yếu, 22 chủng Bacillus (chi ếm 47,83%) có khả năng ức chế 1, 2, 3 hoặc 4 nguồn VKHX; t rong đó có 6 chủng Bacillus (chiếm 13,04%) có khả năng ức chế cả 4 nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh. 5 Pseudomonas 40 - Khả năng sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng - Khả năng phân giải lân - Khả năng ức chế nấm, vi khuẩn gây bệnh vùng rễ - 40/40 chủng Pseudomonas (chiếm 100%) có khả nă ng sinh chất kích thích sinh trưởng; tuy nhiên hàm lượng IAA hình thành không cao; hàm lượng IAA hình thành đ ạt từ 3,58 - 73,55 µg/ml. - 8/40 chủng Pseudomonas (chiếm 20%) có khả nă ng phân giải phốt phát canxi; đường kính vòng phân giải đ ạt 3,0 - 14 mm. Trong đó có 2 chủng có đường kính v òng phân giải đạt 14 và 12 mm. - 5/40 chủng Pseudomonas (chiếm 12,5%) có khả nă ng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh cây lạc ( Rastonia solanacearum). 7/40 chủng Pseudomonas (chiếm 17,5%) có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh thối h ành (Erunia). - 2/40 chủng Pseudomonas (chiếm 5%) có khả năng ức chế nấm Fusarium. 7/40 chủng Pseudomonas (chiếm 17,5%) có khả năng ức chế nấm Aspergillus niger và 4/40 chủng Pseudomonas (chiếm 10%) có khả năng ức chế nấm Macrophomia. TT Nhóm vi sinh vật Số lượng Chỉ tiêu đánh giá Kết quả đánh giá 6 Xạ khuẩn 34 - Khả năng phân giải xenllulo - Khả năng ức chế nấm, vi khuẩn gây bệnh vùng rễ cây trồng - Khả năng phân giải phốt phát khó tan - Khả năng chịu nhiệt 60 O C. - 34/34 chủng xạ khuẩn (chiếm 100%) có khả nă ng phân giải xenlulo với đường kính vòng phân giải từ 1,0-5,2 cm. Trong đó có 16 ch ủng xạ khuẩn (chiếm 47,06%) có đường kính vòng phân giải xenlulo trên 3,0 cm. - 5/34 chủng xạ khuẩn (chiếm 14,71%) có khả nă ng phân giải phốt phát canxi. Tuy nhiên khả năng phân gi ải phốt phát canxi của các chủng xạ khuẩn hiện lưu gi ữ không cao, đường kính vòng phân giải đạt 0,5-0,8 cm. - 9 chủng xạ khuẩn (chiếm 26,47%) có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh cây lạc. Trong đó có 3 ch ủng có đường kính vòng ức chế trên 2,1 cm. - 23/34 chủng xạ khuẩn (chiếm 67,65%) có khả năng ch ịu nhiệt (sinh trưởng, phát triển trong được đi ều kiện nhiệt độ 60 O C). Tổng số 183 4. Phân loại nguồn gen Ngun gen vi sinh vt hin có ưc phân loi ch yu da trên khóa phân loi (c im t bào, khuNn lc, c im sinh hóa và ngun gc phân lp); kt qu phân loi do vy ch  mc  sơ khi ban u, chưa chính xác.  m bo tính chính xác ca ngun gen vi sinh vt,  án ã tin hành phân loi ngun gen vi sinh vt bng các k thut mi. Kt qu phân loi ngun gen vi sinh vt ưc trình bày trong bng 3. Bảng 3. Kết quả phân loại nguồn gen vi sinh vật STT Phương pháp phân loại Số lượng chủng vi sinh vật được phân loại giai đoạn 2006-2010 1 Khóa phân loại (đặc điểm tế bào, khuẩn lạc, nguồn gốc ) 49 2 Máy định danh vi khuẩn, nấm (BIOLOG) 4 3 16S ARN riboxom 45 Phân loi vi sinh vt là công vic cn nhiu kinh phí và thi gian.  có  cơ s khoa hc cho vic khai thác s dng ngun gen vi sinh vt phc v sn xut, trong thi gian ti  án phi có nhim v phân loi toàn b ngun gen vi sinh vt có tim năng s dng. 5. Tư liệu và thông tin Tư liu hóa ngun gen vi sinh vt là mt trong nhng ni dung quan trng ca bo tn qu gen vi sinh vt. Cơ s d liu ngun gen vi sinh vt hin lưu gi ưc lp lý lch theo mu quy nh và ưc lưu gi trong máy tính. 6. Khai thác sử dụng nguồn gen  có th khuyn cáo cho các ơn v s dng ngun gen,  án ã tin hành nghiên cu iu kin sinh trưng phát trin và ánh giá nh hưng i vi cây trng; t ó  xut và gii thiu ngun gen vi sinh vt có tim năng cho sn xut nông nghip. T các ngun gen vi sinh vt ưc bo qun ti qu gen vi sinh vt trng trt,  án ã kt hp vi các  tài, d án nghiên cu ng dng các chng vi sinh vt có hot tính cao cho sn xut phân bón vi sinh vt ca các ơn v nghiên cu trin khai trong và ngoài Vin (xưng sn xut th nghim vi sinh vt, s Khoa hc Công ngh k Lk, công ty c phn Thiên sinh, Công ty Sn xut và Thương mi Thiên Phúc, công ty trách nhim hu hn Hu Cơ, Vin Bo v thc vt, v.v ); ng thi qu gen vi sinh vt trng trt cũng là ngun cung cp vt liu khi u cho các nghiên cu ca sinh viên lun văn thc tp (trưng i hc Khoa hc t nhiên, i hc Bách Khoa, i hc Nông nghip Hà Ni, v.v ). N hiu sn phNm khoa hc ưc công nhn là tin b k thut (phân bón vi sinh vt N itragin, Azogin, phân lân vi sinh, thuc dit chut MIROCA, phân hu cơ vi sinh vt, phân bón vi sinh vt chc năng) ã và ang ưc s dng rng rãi ti nhiu a phương trong c nưc, ưc  án Qu gen vi sinh vt trng trt cung cp chng ging gc. S lưng ngun gen vi sinh vt ang khai thác s dng ưc trình bày trong bng 4. Bảng 4. Số lượng và mục đích khai thác sử dụng nguồn gen vi sinh vật STT Mục đích sử dụng Số lượng 1 Sản xuất phân bón vi sinh vật 15 2 Xử lý phế thải hữu cơ rắn làm phân bón sinh học 7 3 Sử dụng trong kiểm soát bệnh, dịch hại cây trồng 8 4 Kiểm định 10 5 Giảng dạy, luận văn thực tập của sinh viên tại các trường đại học (Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Nông nghiệp Hà Nội) 10 Tổng cộng: 50 IV. KÕT LUËN Bo tn qu gen vi sinh vt ã hoàn thành tt các nhim v t ra; áp ng mc tiêu ánh giá, lưu gi, bo tn, phát trin, khai thác và s dng có hiu qu ngun gen vi sinh vt trng trt phc v phát trin nông nghip bn vng. C th như sau: 1. Lưu gi, bo qun thưng xuyên 673 ngun gen vi sinh vt m bo  sng sót và hot tính sinh hc. 2. Thu thp phân lp làm giàu thêm cho gen vi sinh vt trng trt 49 ngun gen vi sinh vt có kh năng c nh nitơ cng sinh, c nh nitơ t do, phân gii xenlulo, phân gii kitin, kích thích sinh trưng thc vt, sinh polysacharit, phân gii tinh bt, c ch vi khuNn - nm gây bnh héo xanh và chu nhit. 3. ánh giá và xác nh ưc mc  a hot tính sinh hc ca 183 ngun gen vi sinh vt ang lưu gi; trong ó ã phát hin 48,09% ngun gen vi sinh vt có a hot tính sinh hc. iu này có ý nghĩa trong sn xut nông nghip. 4. ã tin hành phân loi n loài ưc 49 ngun gen vi sinh vt da theo khóa phân loi, BIOLOG và gii trình t gen 16S ARN riboxom. 5. Công tác tư liu hóa ngun gen ưc tip tc hoàn thin và cp nht các thông tin theo mu quy nh. 6. Qu gen vi sinh vt trng trt là ngun vt liu khi u cho công tác nghiên cu, trin khai. 50 ngun gen vi sinh vt ang ưc gii thiu cho sn xut phân bón và ch phNm vi sinh vt; phc v phát trin nông-lâm nghip bn vng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyn Thu Hà và CTV. 2005. Nghiên cu la chn phương pháp bo qun thích hp cho mt s chng vi sinh vt, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, trang 94-98. 2. Nguyên Ngc Quyên và CTV. 1999. Qu gen vi sinh vt nông nghip, Tạp chí ông nghiệp và công nghiệp thực phm, 451, trang 29-30. 3. Nguyn Ngc Quyên và CTV. 2002. Kt qu hot ng ca  án lưu gi ngun gen vi sinh vt nông nghip, Kết quả bảo tồn tài nguyên di truyền nông nghiệp, Nhà xut bn Nông nghip, trang 182-188. 4. Phm Văn Ton và CTV. 2005. Lưu gi, bo tn ngun gen vi sinh vt nông nghip, Báo cáo tại hội thảo về công tác thu thập, bảo tồn và khai thác sử dụng nguồn gen vi sinh vật nông nghiệp, Hà ội 21/12/2005. 5. Khursheed Ahmad Malik. 1991. Maintenance of Microorganisms by simple methods. Maintenance of Microorganisms 2nd Edn ISB 012-410351-0, pp 121-132. 6. Peter H.A.Sneath, Nicholas S.Mair, John G. Holt. 1989. Bergey’s manual of systematic bacteriology. 7. TCVN 6167:1996. Phân bón vi sinh vt phân gii hp cht photphat khó tan. 8. TCVN 6168:2002. Ch phNm vi sinh vt phân gii xenlulo. 9. TCVN 4884:2005. Vi sinh vt trong thc phNm và thc ăn chăn nuôi. Phương pháp nh lưng vi sinh vt trên ĩa thch. K thut m khuNn lc  30 o C. 10. 10 TCN 299:97. Phân bón vi sinh vt c nh nitơ - Phương pháp xác nh hot tính 11. 10 TCN 714:2006. Vi sinh vt - Phương pháp ánh giá hot tính i kháng vi khuNn gây bnh héo xanh cây trng cn Rastonia solanacearum Smith. 12. 10 TCN 867:2006. Vi sinh vt - Phương pháp ánh giá hot tính i kháng nm gây bnh vùng r cây trng cn. Người phản biện: TS. Hồ Quang Đức . tính sinh hc ca ngun gen vi sinh vt ưc th hin trong bng 2. Bảng 2. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của nguồn gen vi sinh vật TT Nhóm vi. bng 3. Bảng 3. Kết quả phân loại nguồn gen vi sinh vật STT Phương pháp phân loại Số lượng chủng vi sinh vật được phân loại giai đoạn 2006-2010 1 Khóa