Valued Gateway Customer Producing Transgenic Plants Kỹ thuật chuyển gien trên thục vật Hiện nay, diện tích GMO trên thế giới khoảng 215 triệu acres Cây trồng chuyển gien (GMO) Valued Gateway Customer Producing Transgenic Plants Gien là 1 đoạn ADN mã hóa 1 loại protein chuyen biệt  biểu hiện 1 tính trạng. mRNA protein trait transcription translation expression Cây trồng chuyển gien là gì ? • Thuật ngữ ‘chuyển gien’ (Transgenic) dùng để chỉ việc đưa gien vào 1 đối tượng SV nào đó bằng KT ADN tai tổ hợp. Gien được chuyển từ các loài khác hay trong cùng 1 loài. • Từ đồng nghĩa (Synonym): Genetically modified organism (GMO) Genetically engineered organism (GEO) Valued Gateway Customer Producing Transgenic Plants Những cây trồng nào được phát triển từ các loài này ? Bắp (corn) Cà rốt (carrot) cải salade (lettuce) Những cây trồng nào được phát triển từ các loài này ? Valued Gateway Customer Producing Transgenic Plants Teosinte Bắp (maize) Sinapis Cabbage Valued Gateway Customer Producing Transgenic Plants Từloài hoang dại trở thành loài trồng • Mất khả năng phát tán hạt tự nhiên (rụng, lông, gai ) • Nảy mầm nhanh • Hạt lớn • Chín đồng loạt • Mất khả nang tự baro vệ trong môi trường tự nhiên • Màu sắc thay đổi • Không còn chất độc hoặc vị đắng Source: Damania, 2008 Thuần hóa (Domestication) Quá trình chọn giống gồm 2 bước cơ bản I. Tạo ra (hoặc nhận diện) các dạng biến dị. • Thu thập từ nơi hoang dại hay ruộng nông dân • Lai tạo (lai giữa 2 hay nhiều cây) • Gây đột biến, hoặc đa bội II. Chọn lựa các tính trạng mong muốn. Các đặc tính đầu tiên được nhà chọn giống quan tâm trong quá trình thuần hóa là: hạt to, không bị ngủ đông, và không bị rụng hạt. Valued Gateway Customer Producing Transgenic Plants Công tác lai tạo có thể thực hiện từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau Nguồn gien sơ cấp (trong cùng loài) • Các giống ưu việt • Giống địa phương (primitive cultivars) • Giống hoang dại của cùng loài Nguồn gien thứ cấp (khác loài) • Giống trồng, giống địa phương, hoặc cây hoang dại của các loài khác (species) hoặc giống khác (genera)  lai xa Lai xa và xử lý đột biến không được sử dụng phổ biến • Cây ngũ cốc triticale là sản phNm lai xa gia lúa mì (Triticum) và lúa mch en (Secale). • TAM107, ging lúa mì có cha 1 cánh N ST ca lúa mch en, à ging chng chu stress ưc trng ph bin  Colorado (M). • Ging lúa mì ‘Clearfield’, mang gien kháng thuc tr c, ưc to ra do x lý t bin, sp ưc ưa ra th trưng. Valued Gateway Customer Producing Transgenic Plants KT chuyn gien có phi là bưc m rng ca PP chn ging truyn thng hay là s phát trin nhy vt hoàn toàn mi ? • KT chuyn gien cho phép khai thác các bin d di truyn trong th gii SV, thay vì ch giưi hn trong cùng loài hay cùng ging trong h thng phân loi. • Gien ưc chuyn vi mc  chính xác rt cao so vi các PP trưc ây. • N hưng 2 bưc cơ bn ca qui trình chn ging vn phi m bo: to bin d và chn la tính trng mong mun. Qui trình to cây chuyn gien • Phân lp và nhân dòng (cloning) gien cn chuyn • Gn thêm vào gien các on khi ng và iu hòa hot ng ca gien • Gm thêm marker chn lc (selectable marker) • ưa cu trúc ưc thit k (cassette) và TB ca cây (chuyn gien - transformation) • Chn lc các Tb hay mô mang gien chuyn • Tái to li Regenerate whole plants Valued Gateway Customer Producing Transgenic Plants Xác nh và nhân dòng (cloning) gien cn chuyn • ây là bưc àu tiên, và cũng là gii hn ca thành t v chuyn gien. • Các phòng thí nghim quc gia cũng như tư nhân ang tp trung rt nhiu công sc vào vic xác nh , nh v, kháo sát tính cht và nhân dòng nhng gien kim soát các tính trng nông hc quan trng (chiu cao, tr hoa, s trái, s ht, năng sut ). Bước 1: Arabidopsis thaliana • Vic gii mã trình t bô gien hoàn tt vào tháng 12/2000: b gien cha khong ~120 Mb (ADN ), và có khong 25.000 gien. • ‘D oán’ chc năng ca gien ưc thc hin cho khong 70% các gien. • N hng vùng lp chim khong 58% b gien, dưng như do s nhân ôi ca toàn b gien xy ra vào khong 100 triu năm v trưc. Valued Gateway Customer Producing Transgenic Plants Thông tin có ưc t nghiên cu trên Arabidopsis • Có nhiu loi gien huc nhom Protein-kinase hơn d oán. iu này co thy tm quan trng trong cơ ch truyn phát tín hiu trong TB. • N hũng gien kim soát các hot ng cơ bn ca TB ưc bo tn trong quá trình tin hóa (có t l ging nhau cao gia ngưi và Arabidopsis). N gưc li, các gien kim soát s trao i thông tin ca TB thì rt thay i, bao gm: ♦ Các gien kim soát các chc năng cơ bn ca TB tn ti  thi t tiên. ♦ N hưng khi n giai on a bào thì tin hóa theo hưng khác nhau gia V và TV. Các dng t bin trên Arabidopsis ưc to ra bng KT chuyn gien (t bin “knock-out”) cho phép phát hin chc năng ca các gien. (C (C á á c đ c đ ộ ộ t bi t bi ế ế n liên quan n liên quan đế đế n n c c ấ ấ u t u t ạ ạ o hoa) o hoa) Valued Gateway Customer Producing Transgenic Plants Mc tiêu tương lai trong nghiên cu b gien TV • Xác nh chc năng ca tt c các gien trên Arabidopsis (2010) • Gii mã trình t b gien ca cây lúa (b gien nh nht trong nhóm ngũ cc). • Gii mã trình t ca cây c 3 lá (Medicago truncatula) (i din cho nhóm cây h u). • Gii mã trình t nhũng vùng mang nhiu gien (gene-rich regions) ca nhóm cây ngũ cc vi b gien ln, VD: bp, lúa mì • Bào t ca csc VK t Bacillus thuringiensis (Bt) có cha các tinh th (crystalline - Cry) protein. Tromg h thng tiêu hóa ca côn trùng, các tinh th này b phá v và gii phóng ra các c t  liên kt và làm thng ưng rut ca côn trùng. • 1 on ca gien Cry ưc s dng trong chuyn gien  to ra các ging cây trng Bt. Gien Bt on mã hóa cho c t on không cn thit cho c tính Bước 2: [...]... chất, gien vir được kích hoạt và điều khiển chuỗi tiến trình chuyển T-DN A (của VK) vào TB TV PP chuyển gien sử dụng Agrobacterium T-DN A (mang gien chuyển) Agrobacterium tumefaciens N ST của VK Gien chuyển (Ti) plasmid mang gien chuyển Chuyển gien vào TB TV N ST của TV Source: Monsanto Producing Transgenic Plants Valued Gateway Customer Cơ chế chuyển gien bằng Agrobacterium Trong cơ chế chuyển gien. .. vào bộ gien của TB TV Producing Transgenic Plants Valued Gateway Customer Dòng mang chuyển gien (Transgenic “event”) Event = Là những dòng nhận gien chuyển một cách thành công Các dòng mang chuyển gien sẽ khác nhau ở thành phần gien chuyển nhận được và ở vị trí mà gien gắn vào trên bộ gien của TB nhận Bắp có 10 N ST, bất cứ N ST nào cũng có thể nhận gien chuyển có thể có nhiều dòng mang chuyển gien khác... hiện của cây chuyển gien • Kiểm tra sự hiện diện của gien chuyển và hoạt động của chúng • Khảo sát ảnh hưởng của gien chuyển trên sự sinh trưởng phát triển của cây nhận • Khảo sát ảnh hưởng của gien chuyển đến môi trường • Khảo sát tính an toàn của gien chuyern khi được sử dụng làm thứ ăn cho người hay gia súc Kiểm tra sự hiện diện và hoạt động của gien chuyển trên cây nhận (cây chuyển gien) • KT lai... nhận được gien chuyển bằng cách sử dụng môi trường chọn lọc Cá thể đã nhận được gien chuyển Producing Transgenic Plants Môi trường chọn lọc (chứa kháng sinh, thuốc trừ cỏ ) Valued Gateway Customer Bước 6: Tái tạo lại cây bằng phương pháp nuôi cấy mô (in vitro) Ngu n: USDA Tương lai của KT chuyển gien trên thực vật N hững kỹ thuật mới sẽ được ngày càn hoàn thiện để nâng cao hiệu quả chuyển gien và khắc... (Backcross) để đưa gien chuyển từ các cây chuyển gien vào các giống ưu tú đang phổ biến trong SX • Đối với hầu hết các loài TV, chỉ có 1 vài dòng/giống cho hiệu quả chuyển gien cao, tuy nhiên các dòng/giống này thường mang các đặc tính nông học và chất lượng không cao • Vì vậy, sau khi tạo được các cây chuyển gien đầu tiên, cần sử dụng PP hồi giao nhiều lần để đưa gien chuyển từ các cây chuyển gien vào các... khỏe và môi trường, cụ thể là: • • Định hướng chính xác vị trí gắn của gien chuyển • Kiểm soát tốt hơn biểu hiện của gien chuyển trong cơ thể nhận (định hướng được thời gian và vị trí biểu hiện của gien chuyển) • Có tể chuyển gien vào lục lạp (chloroplasts) thay vì chuyển gien vào trong nhân Sử dụng các marker chọn lọc mới tay cho các gien kháng với kháng sinh đang được sử dụng phổ biến hiện nay Producing... tissue), từ đó tái tạo lại cây Trên Arabidopsis, PP chuyển gien có thể thực hiện đơn giản bằng cách phun ddịch có chứ gien cần chuyển + vector lên trên các chồi Producing Transgenic Plants Valued Gateway Customer PP sử dụng súng bắn gien (“Gene gun” method) DN A pellets TB TV Gien cần chuyển N ST của TV Source: Monsanto PP sử dụng súng bắn gien (“Gene gun” method) Đây là PP vật lý: • Các hạt kim loại (vàng... Transgenic Plants Bt gene Termination sequence Valued Gateway Customer Bước 4: Chuyển thiết kế gien vào TB TV (chuyển gien - Transformation) • Súng bắn gien (Gene gun = biolistics, microprojectile bombardment) • Chuyển gien bằng VK Agrobacterium Các loại mô TV được sử dụng trong chuyển gien Việc chọn lựa các mô TV để chuyển gien tùy thuộc vào từng loại cây trồng, thường là các phôi chưa trưởng thành... marker chọn lọc (Selectable markers • Bởi vì hiệu quả chuyển gien rất thấp (từ 1 - 5% TB nhận được gien chuyển) , do đó cần phải có PP để nhận diện các TB đã nhận được gien chuyển để tiếp tục • Hiện nay, các gien kháng vói kháng sinh (antibiotic) hoặc với thuốc trừ cỏ thường được sử dung làm marker nhận diện Thiết kế gien Bt (cassete) cho chuyển gien Antibiotic or herbicide resistance gene Promoter... động của nhiều gien vir (nằm trên T-DN A): + N hân bản sao T-DN A + Gắn 1 sản phNm vào bản sao T-DN A như là yếu tố dẫn đường (leader) + Gắn protein dọc theo chiều dài sợi T-DN A tác động bảo vệ + Mở kênh vận chuyển trên màng TB VK để chuyển T-DN A ra khỏi TB VK Cơ chế chuyển gien bằng Agrobacterium + T-DN A đi vào bên trong TB TV qua vết thương, sau đó di chuyển vào nhân và gắn vào bộ gien của TB TV . Transgenic Plants Kỹ thuật chuyển gien trên thục vật Hiện nay, diện tích GMO trên thế giới khoảng 215 triệu acres Cây trồng chuyển gien (GMO) Valued Gateway. chuyển gien là gì ? • Thuật ngữ chuyển gien (Transgenic) dùng để chỉ việc đưa gien vào 1 đối tượng SV nào đó bằng KT ADN tai tổ hợp. Gien được chuyển