LOGO PCR TRONG CHUẨN ĐOÁN PHÂN BIỆT CÁC SUBTYPE AIV TYPE A Phạm Thành Thái Nội dung Giới thiệu về AIV type A Phương pháp chuẩn đoán LOGO Giới thiệu về Avian Influenza Virus Type A  AIV thuộc họ Orthomyxoviridae Có đường kính vỏ 0,08-0,12 μm; nhân là chuỗi RNA đơn Họ Orthomyxoviridae gồm có nhóm virus là:  Nhóm virus type A: gây bệnh cho loài chim, số động vật có vú và người  Nhóm virus cúm type B: gây bệnh cho người  Nhóm virus cúm type C: gây bệnh cho người, lợn  Nhóm Thogotovirus Tên gọi Cấu tạo AIV Các kháng nguyên bên (proreins M1 và NP) là proteins đặc hiệu nhóm dùng để xác định xem virus thuộc type A, B hay C Các kháng nguyên bên ngoài (HA và NA) đa dạng và là kháng nguyên có tính đặc hiệu subtype Jorge Duitama et al, 2009 Phân loại AIV  Cúm gia cầm độc lực thấp (LPAI) xảy tự nhiên ở loài chim Bệnh không biểu triệu chứng rất nhỏ Những dòng virus này gây nguy hiểm cho sức khỏe người Dòng LPAI H5 và H7 có khả biến chủng thành HPAI  Cúm gia cầm độc lực cao (HPAI): sau 10 ngày tiêm nhiễm cho gà, AIV phải làm chết 75-100% phôi gà thực nghiệm Sau phân lập từ gà bệnh, AIV phát triển tốt và gây bệnh tích tế bào mơi trường ni cấy khơng có trypsin Đối với chủng H5 và H7 nếu mọc tốt môi trường không có trypsin, trình tự acidamine trùng với trình tự acidamine của chủng độc lực cao thì xác định là chủng độc lực cao Tái tổ hợp gene ở AIV Nếu chủng virus cúm đồng thời xâm nhiễm tế bào thì có thể xảy tượng tái tổ hợp gene (genetic recombination); đó tạo virus có kháng nguyên kết hợp Sự thay đổi genotype của H5N1 từ phát vào năm 1997 đến năm 2001 Tám đoạn gene của AIV xếp theo thứ tự từ xuống PB2, PB1, PA, HA, NP, M, và NS Các chủng virus: H9N2; H6N1; H5N1; H9N2/ Y280; và H5N11/97 (?) là genotype AIV chưa phân lập từ gia cầm ở Hong Kong Y Guan, 2002 LOGO RT-PCR Thu mẫu bệnh phẩm • Cơ quan mơ (não, khí quản, phởi,…) • Các loại dịch (phởi, họng, mũi,…) • Huyết Tách chiết RNA • Sử dụng Kit như: NucleoSpin RNA II, Rneasy MiniKit,… Chuẩn bị mẫu chạy RT-PCR • PCR buffer, MgCl2, dNTP, Primer, Rtase,… Chạy RT-PCR • Tùy theo primer sử dụng mà có chu trình nhiệt khác Đọc kết • Trên gel agrose, real time,… Chuẩn đoán H5N1 WHO, 2007 rRT-PCR Một nghiên cứu nhằm xác định subtype H5 và H7, tác giả đã sử dụng cặp primer và probe sau Đây là phương pháp rất nhanh, 28 mẩu bệnh phẩm đã kiểm tra khoảng 3h Giới hạn phát của cặp M primer là 103 gene copies Cả hai cặp primer H5 và H7 đều có giới hạn phát là 103 đến 104 gene copies Erica Spackman et al, 2002 rRT-PCR Một nghiên cứu khác subtype H5, H7 và H9 G Cattoli, I Monne 2008 rRT-PCR G Cattoli, I Monne 2008 mRT-PCR  Trong nghiên cứu này, Pitirat Boonsuk và cs (2008) đã phát triển kỹ thuật Multiplex RT-PCR việc phát subtype H1, H3 và H5 của AIV type A mRT-PCR  A.Kết điện di gel agarose với mẫu H1, H3 và H5; Mix và chứng âm (N)  B.Kết kiểm tra độ nhạy phương pháp mRT-PCR  Kết kiểm tra độ chuyên biệt Multiplex RT – nested PCR  Phương pháp này nghiên cứu để phát AIV type A subtype H1N1 và subtype H3N2 và AIV type B Multiplex RT – nested PCR  Độ nhạy của phương pháp: H1N1 thì giới hạn phát là 200pfu/ml, H3N2 là 14 pfu/ml và AIV type B là 4,5 pfu/ml Trong đó độ nhạy của phương pháp one-step PCR là 1,1-2,1x103 LOGO Tài liệu tham khảo          Erica Spakman et al, 2002 Development of a Real-Time Reverse Transcriptase PCR Assay for A Influenza Virus and the Avian H5 and H7 Hemagglutinin Subtupes Journal of Clinical Microbiology, Vol 40 (9): 3256-3260 Giovanni Cattoli, Isabella Monne, 2009 Ilaria Capua, Dennis J Alexander(Ed) In: Avian Influenza and Newcastle Disease – A Field and Laboratory Manual Milan, Italy 87-112 Jorge Duitama et al, 2009 PrimerHunter: a primer design tool for PCR-based virus subtype indentification Nucleic Acids Research, Vol 37 (8): 2483-2492 Pitirat Boonsuk et al., 2008 Detection of Influenza Virus Types A and B and Type A subtypes (H1, H3, and H5) by Multiplex Polymerase Chainzreaction Tohoku J.Exp Med., 215, 247-255 Patrick J Gavin, Richard B Thomson, Jr 2003 Review of Rapid Diagnostic Tests for Influenza Clinical and Applied Immunology Reviews, (2003), 151 – 172 Song, Man Ki, Jun Chang, Yeongjin Hong, Sunghoi Hong, and Suhng Wook Kim 2009 Direct Multiplex Reverse Transcription-Nested PCR Detection of Influenza Viruses Without RNA Purification J Microbiol Biotechnol G Cattoli, I Monne, 2008 Real time RT-PCR (rRT-PCR) Detection of Avian Influenza subtype H5, H7, H9 Validation Dossier WHO 2007 Recommendations and laboratory procedures for detection of avian influenza A (H5N1) virus in specimens from suspected human cases Y Guan et al, 2002 Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR PNAS Vol 99 (3): 8950-8955 LOGO ... Monne, 2009 Ilaria Capua, Dennis J Alexander(Ed) In: Avian Influenza and Newcastle Disease – A Field and Laboratory Manual Milan, Italy 87-112 Jorge Duitama et al, 2009 PrimerHunter: a primer design... Dòng LPAI H5 và H7 có khả biến chủng thành HPAI  Cúm gia cầm độc lực cao (HPAI): sau 10 ngày tiêm nhiễm cho gà, AIV phải làm chết 75-100% phôi gà thực nghiệm Sau phân lập từ gà bệnh,... Transcriptase PCR Assay for A Influenza Virus and the Avian H5 and H7 Hemagglutinin Subtupes Journal of Clinical Microbiology, Vol 40 (9): 3256-3260 Giovanni Cattoli, Isabella Monne, 2009 Ilaria