PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ ISOLATES VI KHUẨN GÂY BỆNH HÉO XANH HẠI LẠC (Ralstonia solanacearum Smith) VÀ TUYỂN CHỌN GIỐNG KHÁNG BỆNH Nguyn Th Vân, Nguyn Th Bình, Nguyn Huy Chung, Lê Tun Tú, Nguyn Mnh Hùng, inh Th Phòng,  Tin Phát Summary Analyzing genetic polymorphism of isolates of groundnut bacterial wilt disease agent Ralstonia solanacearum Smith and selection of varieties resistant to disease A number of plant pathogenic isolates of R. solanacearum Smith derived from various groundnut growing provinces in Northern Vietnam have been identified and analyzed. Of 11 isolates analyzing their DNA polymorphism there are 10 primers gave the better characterization data at molecular basis. Primary result of the DNA analysis has showed significant polymorphism of plant pathogen R. solanacearum Smith indicating wider host plant range and will serve as the scientific platform for further breeding and selection of disease resistant cultivars. The genetic similarity index of those strains of bacterium R. solanacearum Smith showed a certain molecular variation between them, ranging from 2% to 34%. It has been screened 94 groundnut lines/varieties against bacterial wilt and selected 2 varieties with highly resistance; 3 with moderate resistance and 10 with a little susceptible to bacterial wilt disease. Among those tested lines/varieties of groundnut, the promising variety TK 10 has showed the best performance in disease resistance, grain yield, good adaptation, and seed quality compared to common variety MD7. Key word: Groundnut, Ralstonia solanacearum, PCR - RADP, polymorphism analysis, plant resistance I. T VN  Bnh héo xanh hi lc ưc xác nh là do vi khuNn Ralstonia solanacearum Smith gây ra, là mt trong nhng bnh gây tn tht khá ln cho các vùng sn xut lc  hu ht các nưc trên th gii.  Vit N am bnh có th làm gim năng sut t 5% - 80%,  Trung Quc bnh có th làm mt năng sut hoàn toàn,  Indonesia t 5% - 65%, Thái Lan trên 50%. Do mc  nguy hi ca bnh nên nhiu cơ quan như Vin Khoa hc K thut N ông nghip Vit N am, Vin Bo v thc vt, Vin Di truyn N ông nghip, Trưng i hc N ông nghip I Hà N i và Vin Công ngh sinh hc ã nghiên cu nh hưng ca bnh n năng sut lc, tuyn chn ngun gen kháng, nghiên cu a dng di truyn ca ngun ký sinh gây bnh  mt s vùng trng im sn xut lc  Vit N am. Trong nhng năm gn ây B môn Min dch thc vt Vin Bo v thc vt ã tin hành phân tích a dng di truyn ca mt s isolates vi khuNn héo xanh lc thu thp t nhiu vùng sinh thái khác nhau, da trên cơ s ó tuyn chn gen kháng bnh phc v cho chn to ging kháng bnh. II. VT LIU VÀ PHƯƠN G PHÁP N GHIÊN CU 1. Vật liệu - Mu vi khuNn: Bao gm 11 isolates vi khuNn Ralstonia solanacearum Smith gây bnh héo xanh lc ưc phân lp ti Vin Bo v thc vt. Các mu bnh ưc thu thp t Hà Tây, Bc Giang, Hi Phòng, Ninh Bình, Hòa Bình và Ngh An. - Hoá chất và thiết bị máy móc: máy o quang ph Diod Array Spectrophotometer (M), máy ly tâm Avanti TM 30, máy PCR - Thermal Cycler PTC 100, Tag ADNpolymeraza (Perkin - Elmer) và các hoá cht nghiên cu sinh hc phân t khác. - Các mồi sử dụng trong phản ứng RADP: Trình t ca 10 mi s dng trong phn ng RADP ưc th hin trong bng 1. Bảng 1. Trình tự các nucleotide của 10 mồi được sử dụng trong nghiên cứu. Tên mồi Trình tự mồi Tên mồi Trình tự mồi 1.OPF10 5’GGAAGCTTGG3’ 6.OPQ13 5’GGAGTGGACA3’ 2.OPH04 5’GGAAGTCGCC3’ 7.RA142 5’CAATCGCCGT3’ 3.OPN05 5’ACTGAACGCC3’ 8.RA143 5’TCGGCGATAG3’ 4.OPP15 5’GGAAGCCAAC3’ 9.RA31 5’AACCGACGGG3’ 5.OPP19 5’GGGAAGGACA3’ 10.RA46 5’CCAGACCCTG3’ 94 mu ging lc ánh giá kh năng kháng bnh HXVK ưc cung cp t Trung tâm Tài nguyên di truyn thc vt, t ngun ging nhp ni và mt s ging ang phát trin trong sn xut. 2. Phương pháp nghiên cứu - Phân tích a dng di truyn các isolates vi khuNn bng phương pháp RADP. Tách chit ADN tng s da theo phương pháp ca Murray và Thompson, 1980 có ci tin. Phân tích s liu theo qui ưc: 1 = phân on ADN xut hin, 0 = phân on ADN không xut hin, khi in di sn phNm RAPD vi các on mi ngu nhiên. Xác nh h s di truyn ging nhau theo phương pháp ca Nei và Li 1979 (h s di truyn Jacar). 2a Sij 2a b c = + + Trong ó: S ij: H s ging nhau gia hai cá th i và j; a: S phân on ADN xut hin  c cá th i và j; b: S phân on ADN xut hin  i và không xut hin  j; c: S phân on ADN xut hin  j và không xut hin  i. - Phân tích ánh giá h s tương quan kiu hình theo 3 phương pháp: SM, Dice và Jaccard và 4 phương pháp phân nhóm: UPGMA (phân tích các nhóm phân t không cùng trng lưng), WPGMA (các nhóm phân t có cùng trng lưng), liên kt hoàn toàn (complete linkage), liên kt ơn l (single linkage). Lp biu  hình cây da vào giá tr phân tích ca tương quan kiu hình cao nht trong chương trình NTSYS * Hàm lượng thông tin tính đa hình (Polymorphism Information Content = PIC) của mỗi cặp mồi xác định theo công thức: PIC i = 1 - ΣP ij 2 Trong ó: Pij là tn s allen th j ca kiu gen i ưc kim tra. - ánh giá kh năng kháng nhim bnh trên nn Sicplot theo phương pháp nhim ht nt nanh. i chng là ging chuNn nhim quc t: ICGV 3704 và ging chuNn kháng là MD7 ti nhà lưi - Vin Bo v thc vt. ánh giá kh năng kháng nhim bnh HXVK ca các mu ging theo thang im 6 cp, t kháng cao n nhim nng. III. KT QU VÀ THO LUN 1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái vi khun gây bệnh héo xanh c im ca khuNn lc vi khuNn gây bnh héo xanh trên môi trưng TZC là có dng tròn không u, màu hng, tâm màu . Trên môi trưng SPA u có khuNn lc màu trng sa. Nhit  thích hp nht cho khuNn lc phát trin t 28 - 30 0 C. Hình 1. KhuNn lc vi khuNn héo xanh trên môi trưng TZC Căn c vào c im hình thái ca khuNn lc có th kt lun 11 isolates vi khuNn này là vi khuNn héo xanh hi lc Ralstonia solanacearum. 2. Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền các isolates vi khun héo xanh lạc ADN ca 11 issolates vi khuNn ã ưc phân tích vi 10 mi ngu nhiên. ánh giá tính a hình thông qua giá tr PIC (giá tr PIC càng ln thì tính a hình ca cp mi ó càng cao), khong cách di truyn gia các isolates ưc xác nh thông qua h s tương ng và sơ  hình cây. Tng s phân on ADN ca 11 isolates vi khuNn khi phân tích vi 10 mi ngu nhiên là 83 phân on. Trong ó s phân on a hình là 41 phân on (chim 49%) và không a hình là 42 phân on (51%). Mi OPF10 cho tính a hình cao nht (100%), hai mi OPQ13 và RA143 không cho tính a hình (0%). Kt qu này cũng phù hp khi phân tích hàm lưng thông tin a hình bng giá tr PIC (bng 2): Giá tr PIC ca mi OPQ13 và RA143 là 0 (không a hình) và giá tr PIC ca mi OPF10 là 0,74 (a hình cao nht). Bảng 2. Hàm lượng thông tin tính đa hình (PIC) của 11 isolates vi khun STT Tên mồi PIC STT Tên mồi PIC 1 OPF10 0,74 6 OPQ13 0,00 2 OPH04 0,37 7 RA142 0,37 3 OPN05 0,44 8 RA143 0,00 4 OPP15 0,45 9 RA31 0,48 5 OPP19 0,46 10 RA46 0,32 Kt qu cho thy phn ln các mi u cho tính a hình không cao (PIC < 0,5) mc dù vy vi 10 cp mi RAPD ngu nhiên này cũng ã cho thy tính a hình ADN ca 11 isolates vi khuNn Ralstonia solanacearum mà chúng tôi nghiên cu. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 OPP19 400bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 OPH04 1500bp 250bp 1500bp M. Thang AD chun 1000bp; thứ tự từ 1 - 11 ứng với các chủng P1 - P11 Hình 2. Kết quả điện di sản phm RAPD của các isolates vi khun với mồi OPP19, OPH04, OPF10 và RA46 Các s liu phân tích PCR - RAPD ưc x lý và phân tích trong chương trình NTSYSpc version 2.0 nhm tìm ra khong cách di truyn gia các mu khuNn nghiên cu thông qua h s tương ng di truyn và biu  hình cây (hình 2).  kim tra phương pháp phân nhóm, chúng tôi ã tin hành xác nh giá tr tương quan kiu hình theo ba phương pháp tính h s di truyn ging nhau (phương pháp ca Jaccard, ca N ei & Li, ca Sokal) vi bn kiu phân nhóm (WPGMA, UPGMA, liên kt hoàn toàn và liên kt ơn l) (bng 3). Biu  hình cây ưc thit lp da trên giá tr tương quan cao nht vi các giá tr khi r ≥ 0,9: Tương quan rt cht, r = 0,8 - 0,9: Tương quan cht, r = 0,7 - 0,8: Tương quan tương i cht, r≤0,7: Tương quan không cht. Bảng 3. Giá trị tương quan kiểu hình (r) UPGMA WPGMA Liên kết hoàn toàn Liên kết đơn lẻ SM 0.97723 0.97207 0.97390 0.97437 Dice 0.97677 0.96398 0.96398 0.97412 Jaccard 0.97982 0.97390 0.96624 0.97704 Kt qu cho thy, vi ba cách tính h s di truyn ging nhau và bn kiu phân nhóm u phn ánh mi tương quan kiu hình ca 11 mu vi khuNn héo xanh lc là rt cht (h s r t t 0.96398 ti 0.97982). Trong ó giá tr tương quan kiu hình (r) ln nht 0.97982 khi tính theo h s di truyn Jaccard và kiu phân nhóm UPGMA. Vì vy, sơ  hình cây ưc thit lp theo h s di truyn ging nhau Jaccard và kiu phân nhóm UPGMA. Các s liu phân tích PCR - RAPD ưc x lý và phân tích trong chương trình NTSYSpc version 2.0 nhm tìm ra khong cách di truyn gia các mu khuNn nghiên cu thông qua h s tương ng di truyn và biu  hình cây (hình 2). Hình 3. Biểu đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của các isolates vi khun theo hệ số của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA. Phân tích s sai khác v h s di truyn ca 11 isolates vi khuNn vi 10 mi ngu nhiên chia thành 2 nhánh cây chính: N hánh 1 ch có mt isolates P1, có s sai khác so vi 10 isolates vi khuNn còn li là 34%. N hánh còn li bao gm 10 isolates P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10 và P11, trong ó bn isolates (P2, P6, P7, P9) không có s khác nhau v mt di truyn, 6 mu còn li có s sai khác di truyn t 2% (P5) ti 18% (P4). 3. Đánh giá tính kháng bệnh héo xanh vi khun của các giống lạc Kt qu nghiên cu 94 dòng ging lc cho thy ch có 2 ging kháng t 2,1% (TK10, LH3 - 1 - 1); Kháng trung bình có 3 ging chim 3,2% (Sen N gh An ), còn li ch yu là các ging nhim 50 ging chim 53,2% và nhim nng 29 ging chim 36,9%. Da vào kt qu ánh giá trên chúng tôi ã tuyn chn, ánh giá ging lc TK10 có ngun gc nhp ni t Trung Quc và sn xut th nghim vi din tích 2 ha nơi thưng xuyên din ra dch hi ti hp tác xã Sơn ông - Th xã Sơn Tây - Hà Tây. Bưc u cho thy dòng ưc tuyn chn t ging TK10 có c tính nông hc tt, có kh năng kháng bnh HXVK trên vùng t chuyên canh gò i có ngun bnh HXVK nng trong v xuân và v thu ông 2007 tương ương ging MD7 và hơn hn ging a phương, ưc nông dân ánh giá cao, N ăng sut trung bình v xuân t 26 - 33 t/ha. IV. KT LUN 1. Kt qu phân tích a dng di truyn ca 11 isolates vi khuNn héo xanh cho thy ã có tính a hình  mc  phân t. Các mu isolates P1 thu thp  ông Phương Yên - Hà Tây có s khác bit di truyn rõ rt so vi 10 chng còn li. Bn isolates P2, P6, P7, P9 không có s sai khác v mt di truyn khi phân tích bng 10 mi ngu nhiên trong nghiên cu này. 2. ã ánh giá ưc kh năng kháng bnh HXVK ca 94 dòng ging lc trong ó có 2 ging kháng (TK10, LH3 - 1 - 1), 3 ging kháng trung bình (Sen N gh An ), 10 ging nhim trung bình, 50 ging nhim, 29 ging nhim nng. 3. Ging lc TK10 nhp ni t Trung Quc có tim năng năng sut cao, kháng bnh HXVK, bưc u ã ưc sn xut th nghim trên vùng dch bnh t năng sut t 26 - 33 t/ha, cn nhân rng ra sn xut phc v cho nhiu vùng dch bnh khác hin ang s dng ging nhim bnh. TÀI LIU THAM KHO 1 Đỗ Tấn Dũng, 1999. Nghiên cu bnh héo xanh vi khuNn hi mt s cây trng cn  ngoi thành Hà N i và vùng ph cn, Lun án Tin sĩ khoa hc N ông nghip, Trưng HN N I, Hà N i. 2 Đoàn Thị Thanh, guyễn Xuân Hồng, Vũ Triệu Mân. 1995. N ghiên cu vi khuNn Pseudomonas solanacearum trên mt s cây ký ch  min Bc - Vit N am. Tuyn tp công trình nghiên cu ca nghiên cu sinh, Quyn 5, N XB N ông nghip, Hà N i. 3 Lê Lương Tề, 1997. Bnh héo xanh vi khuNn Ralstonia solanacearum Smith. Tp chí BVTV s 6, tr 45 - 46. 4 Hazarika, D.K, Das, K.K, 1999. Incidence of bacterial wilt of Sesamum in relation to diffeirent sowing dates and varieties. Plant Disease Reseach, 14: 2, 130 - 135. 5 .W.Schaad, J.B.Jones and W. Chun, 1999. Plant Pathogenic Bacteria gười phản biện: guyễn Văn Tuất T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 7 . PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ ISOLATES VI KHUẨN GÂY BỆNH HÉO XANH HẠI LẠC (Ralstonia solanacearum Smith) VÀ TUYỂN CHỌN GIỐNG KHÁNG BỆNH Nguyn. Ralstonia solanacearum. 2. Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền các isolates vi khun héo xanh lạc ADN ca 11 issolates vi khuNn ã ưc phân tích vi