TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN QUẢNG THỊ MỸ DUYÊN SO SÁNH KẾT QUẢ PHÁT HIỆN MONODON BACULOVIRUS TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MALACHITE GREEN, NHUỘM HAEMATOXYLIN VÀ EOSIN, POLYMERASE CHAIN REACTION LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com i LỜI CẢM TẠ Ø Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến Cô Đặng Thị Hoàng Oanh, Chị Trần Việt Tiên đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Ø Tôi xin cảm ơn đến tất cả các thầy, cô, anh chị cán bộ khoa Thủy Sản- Trường Đại học Cần Thơ đã tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận văn này. Ø Tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến các bạn lớp Bênh Học Thủy Sản K31 và các bạn bè xung quanh đã quan tâm, giúp đở tôi trong suốt thời gian học tập tại đây. Ø Cuối cùng, tôi xin chân thành biết ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình đã hết lòng quan tâm, chăm sóc và động viên tôi trong suốt thời gian qua. Cần Thơ, ngày 14 tháng 05 năm 2009 Quảng Thị Mỹ Duyên PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ii TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm so sánh kết quả phát hiện Monodon Baculovirus trên mẫu tôm giống và tôm thịt bằng 3 phương pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin, Polymerase Chain Reaction. Đối với 30 mẫu tôm giống được phân tích bằng 3 phương pháp này thì có 8/30 mẫu (chiếm 27%) cho kết quả dương tính ở cả 3 phương pháp và 22/30 mẫu (chiếm 73%) có sự khác biệt ở 3 phương pháp. Đối với 11 mẫu tôm thịt thì có 3/11 mẫu cho kết quả dương tính ở 2 phương pháp nhuộm Malachite Green và Polymerase Chain Reaction. Riêng ở phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin thì 11/11 mẫu đều cho kết quả tế bào gan tụy bình thường. Qua kết quả này cho thấy ở phương pháp Polymerase Chain Reaction thì tiện lợi hơn phương pháp nhuộm Malachite Green và nhuộm Haematoxylin và Eosin trong việc phát hiện mầm bệnh trong bất kỳ giai đoạn nào. Trong khi đó, ở phương pháp nhuộm Malachite Green và nhuộm Haematoxylin và Eosin thì lại có ý nghĩa trong việc chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh, nhưng ở phương pháp nhuộm Malachite Green thì thời gian thực hiện ngắn và đơn giản nên cho kết quả chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh ở cơ quan đích nhanh hơn nhuộm Haematoxylin và Eosin. Do đó, tùy mục đích nghiên cứu mà chọn phương pháp phát hiện bệnh cho phù hợp. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC . iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH SÁCH BẢNG vi DANH SÁCH HÌNH vii CHƯƠNG1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1.1 Giới thiệu 1 1.2 Mục tiêu 2 1.3 Nội dung 2 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới 3 2.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam 3 2.3 Tình hình dịch bệnh trên tôm và tác hại của nó 4 2.4 Bệnh MBV 7 2.4.1 Tác nhân gây bệnh 7 2.4.2 Dấu hiệu bệnh lý 8 2.4.3 Phân bố 8 2.4.4 Loài và giai đoạn cảm nhiễm 9 2.4.5 Phương thức lây nhiễm 9 2.4.6 Chẩn đoán bệnh 9 2.4.7 Phòng bệnh 10 2.5 Phương pháp nhuộm Malachite Green 10 2.6 Phương pháp mô học (nhuộm Haematoxylin và Eosin) 10 2.6.1 Sơ lược về nghiên cứu mô học 10 2.6.2 Ứng dụng mô học bệnh học trong thủy sản 11 2.7 Phương pháp PCR 12 2.7.1 Sơ lược về PCR 12 2.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 13 2.7.3 Ứng dụng của phương pháp PCR trong thủy sản 14 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iv CHƯƠNG 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu 15 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 3.2.2 Dụng cụ dùng trong nghiên cứu 15 3.2.2.1 Dụng cụ dùng trong phương pháp nhuộm Malachite Green 15 3.2.2.2 Dụng cụ dùng trong phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin . 15 3.2.2.3 Dụng cụ dùng trong phương pháp PCR 15 3.2.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu 16 3.2.3.1 Phương pháp nhuộm Malachite Green 16 3.2.3.2 Phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin 16 3.2.3.3 Phương pháp PCR 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Phương pháp thu mẫu 16 3.3.2 Phương pháp phân tích 17 3.3.2.1 Phương pháp nhuộm Malachite Green 17 3.3.2.2 Phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin 17 3.3.2.3 Phương pháp PCR 20 3.4 Phương pháp xữ lý số liệu 20 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm giống bằng phương pháp nhuộm MG, nhuộmH&E và PCR. 23 4.1.1 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp nhuộm MG 23 4.1.2 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp nhuộm H&E 25 4.1.3 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp PCR. 26 4.2 So sánh kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm giống và tôm thịt bằng phương pháp nhuộm MG, nhuộm H&E và PCR 28 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32 5.1 Kết luận 32 5.2 Đề xuất 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC 36 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL Đồng Bằng sông cửu Long NTTS Nuôi Trồng Thủy Sản NCTS Nghiên Cứu Thủy Sản PL Postlarvae MBV Monodon Baculovirus WSSV White Spot Syndrome Virus MG Malachite Green H&E Haematoxylin và Eosin PCR Polymerase Chain Reaction PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com vi DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.1: Thành phần và thể tích của dung dich Davidson ’ s AFA 17 Bảng 3.2: Hóa chất sử dụng trong quy trình xử lý mẫu 18 Bảng 3.3: Các hóa chất sử dụng trong quy trình nhuộm mẫu 19 Bảng 4.1: Kết quả phát hiện nhiễm MBV trên tôm giống bằng phương pháp nhuộm MG, H&E và PCR 30 Bảng 4.2: Kết quả phát hiện nhiễm MBV trên tôm thịt bằng phương pháp pháp nhuộm MG, H&E và PCR 31 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com vii DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 4.1: Tôm giống bị nhiễm bệnh MBV có kích cở không đều nhau 23 Hình 4.2: Cường độ nhiễm MBV trên tôm giống khi phát hiện bằng phương pháp nhuộm MG 23 Hình 4.3: Tôm thịt bị nhiễm bệnh MBV 24 Hình 4.4: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng MG 24 Hình 4.5: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng MG 25 Hình 4.6: Cường độ nhiễm MBV trên tôm giống khi phát hiện bằng phương pháp nhuộm H&E 26 Hình 4.7: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp nhuộm H&E 26 Hình 4.8: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp nhuộm H&E 26 Hình 4.9: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp PCR 27 Hình 4.10: Kết quả điện di phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp PCR 27 Hình 4.11: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp PCR 28 Hình 4.12: Kết quả điện di phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp PCR 28 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 1 CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Ngày nay, thủy sản là một trong những ngành có vai trò quan trọng và đem lại hiệu quả kinh tế đáng kể cho đất nước. Trong đó, nuôi trồng thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm trên 70% sản lượng nuôi trồng và trên 60% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả nước (Nguyễn Chu Hồi, 2008). Trong các đối tượng nuôi chính thì tôm sú là đối tượng nuôi đã đem lại hiệu quả kinh tế rất cao trong công tác xóa đói giảm nghèo và góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cho người dân của vùng. Phong trào nuôi tôm sú thương phẩm ở ĐBSCL phát triển rầm rộ từ năm 2000 khi chính phủ ban hành nghị quyết 09. Diện tích tôm nuôi hiện nay đã tăng gấp đôi so với năm 2000 (từ 250.000 ha lên 540.000 ha và chủ yếu là tôm sú (538.800 ha) tập trung ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang, Trà Vinh, Tiền Giang, Bến Tre (Bộ NN&PTNN, 2008). Song song với việc gia tăng diện tích, sản lượng tôm nuôi thì tình hình dịch bệnh cũng đang diễn biến phức tạp và gây ra những tổn thất nghiêm trọng cho người nuôi. Những bệnh chính thường xuất hiện trên tôm sú nuôi ở ĐBSCL gồm bệnh do vi khuẩn như bệnh phát sáng, bệnh đen mang, nghiêm trọng hơn là các bệnh do virus như White Spot Syndrome Virus (WSSV), Monodon Baculovirus (MBV), Yellow Head Disease (YHD),… Trong đó, Monodon Baculovirus là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên tôm sú, đặc biệt là gây tỷ lệ chết cao cho ấu trùng, đối với tôm trưởng thành sự nhiễm ít nghiêm trọng hơn. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của Monodon Baculovirus còn tùy thuộc vào độc lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau (Liao et al., 1992 được trích dẫn từ Nguyễn Văn Hảo, 1997). Do hiện nay chưa có thuốc đặc trị nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là điều rất cần thiết. Các phương pháp như nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin giúp cho việc chẩn đoán bệnh dựa trên những biến đổi bệnh lý dưới mức độ vi thể của tổ chức cơ quan. Bên cạnh đó, phương pháp Polymerase Chain Reaction chẩn đoán bệnh ở cấp độ phân tử, giúp phát hiện kịp thời nhằm hạn chế rũi ro do dịch bệnh ở mức thấp nhất. Do đó đề tài “So sánh kết quả phát hiện Monodon Baculovirus trên tôm sú (Penaeus monodon) bằng phương pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin và Polymerase Chain Reaction” được thực hiện. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2 1.2 Mục tiêu So sánh kết quả phát hiện Monodon Baculovirus trên tôm sú bằng 3 phương pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin và Polymerase Chain Reaction. 1.3 Nội dung Đề tài được thực hiện với các nội dung sau: (i) Phát hiện Monodon Baculovirus trên mẫu tôm giống bằng phương pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin, Polymerase Chain Reaction. (ii) Phát hiện Monodon Baculovirus trên mẫu tôm thịt bằng phương pháp nhuộm Malachite Green, nhuộm Haematoxylin và Eosin, Polymerase Chain Reaction. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com [...]... nặng (++++): 60-80% tế bào gan tôm bị nhiễm thể ẩn của virus 22 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm giống và tôm thịt bằng phương pháp nhuộm MG, nhuộm H&E và PCR 4.1.1 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp nhuộm MG Bằng phương pháp nhuộm MG kiểm tra 30 mẫu tôm sú giống nhiễm MBV (Hình 4.1)... phương pháp PCR Hình 4.12: Kết quả điện di phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp PCR Ghi chú: Giếng M: Thang đo Giếng 1: Đối chứng âm Giếng 2: Đối chứng dương Giếng 3 đến giếng 13: Mẫu tôm thịt 4.2 So sánh kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm giống và tôm thịt bằng phương pháp nhuộm MG, nhuộm H&E và PCR So sánh kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm giống 28 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro... với tôm giống khi kiểm tra 30 bằng phương pháp PCR có 23/30 mẫu dương tính (chiếm 77%) và 7/30 mẫu âm tính (chiếm 23%) (Hình 4.10 và Hình 4.11) Còn đối với tôm thịt kết quả kiểm tra bằng PCR có 3/11 dương tính (chiếm 27%) và 8/11 mẫu âm tính (chiếm 73%) (Hình 4.12 và Hình 4.13) Hình 4.9: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp PCR Hình 4.10: Kết quả điện di phát hiện MBV trên tôm giống bằng. .. hiện bình thường (Hình 4.8) Hình 4.7: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng phương pháp nhuộm H&E (mũi tên chỉ các thể ẩn MBV dạng chùm bắt màu hồng của thuốc nhuộm Eosin) (ở vật kính 40X) Hình 4.8: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp nhuộm H&E (mũi tên chỉ tế bào gan tụy bình thường (ở vật kính 40X) 4.1.3 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp PCR 26 PDF created with FinePrint... nhiễm MBV trên tôm giống khi phát hiện bằng phương pháp nhuộm H&E 25 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Các mẫu tôm giống phát hiện nhiễm MBV ở phương pháp nhuộm H&E đều có các thể ẩn bắt màu hồng của Eosin phù hợp với kết quả nhuộm H&E của Lightner, 1996 (Hình 4.7) Đối với tôm thịt kết quả kiểm tra qua 11 mẫu đều thấy tế bào gan tụy có biểu hiện bình thường... xanh của thuốc nhuộm Malachite Green (Hình 4.4, Hình 4.5 và Hình 4.6) phù hợp với kết quả nhuộm MG của Lightner, 1996 Hình 4.3: Tôm thịt bị nhiễm bệnh MBV Hình 4.4: Kết quả phát hiện MBV trên tôm giống bằng MG (mũi tên chỉ thể ẩn MBV dạng chùm) (ở vật kính 40X) 24 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Hình 4.5: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng MG (mũi... dụng phương pháp mô học và PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm giống và tôm thịt Theo Nguyễn Anh Tuấn và ctv (2003) thì phương pháp này là một kỹ thuật rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trường hợp chỉ có thể chẩn đoán được bệnh bằng phương pháp này Tuy nhiên, nó cũng có những hạn chế là thao tác tương đối chậm và chỉ phát hiện bệnh khi tôm đã nhiễm nặng Đồng thời khi sử dụng phương pháp. .. quang học và điện tử Kế đến năm 1998, Sudha et al bằng phương pháp mô học đã xác định mối quan hệ giữa các loài virus gây nhiễm trên các loài tôm biển ở Ấn Độ (trích dẫn từ Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003) Ở Việt Nam, năm 1999 Nguyễn Văn Hảo nghiên cứu bệnh tôm trên tôm sú nuôi tại Trà Vinh bằng phương pháp mô học và PCR và năm 2000 ông cũng ứng dụng tiếp 2 phương pháp này trong nghiên cứu đề tài: “Nghiên... vật kính 40X) 4.1.2 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp nhuộm H&E Đối với tôm giống qua kiểm tra bằng phương pháp nhuộm H&E ở 30 mẫu này có 1 mẫu nhiễm trung bình chiếm 3% (nhiễm ++), 7 mẫu nhiễm nhẹ chiếm 23% (nhiễm +), 16 mẫu không thấy nhiễm MBV chiếm 54% và 6 mẫu không đọc được kết quả chiếm 20% (Hình 4.6) 3% 20% 23% Nhiễm trung bình Nhiễm nhẹ Không nhiễm Không đọc được kết quả 54% Hình 4.6:... phương pháp PCR Ghi chú: Lược trên và lược dưới (tương tự) có: Giếng M: Thang đo Giếng 1 : Đối chứng âm Giếng 2 : Đối chứng dương Giếng 3 đến giếng 17: Mẫu tôm giống 27 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 27% Mẫu nhiễm virus MBV Mẫu không nhiễm virus 73% Hình 4.11: Kết quả phát hiện MBV trên tôm thịt bằng phương pháp PCR Hình 4.12: Kết quả điện di phát hiện . QUẢNG THỊ MỸ DUYÊN SO SÁNH KẾT QUẢ PHÁT HIỆN MONODON BACULOVIRUS TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MALACHITE GREEN, NHUỘM. 4.1.3 Kết quả phát hiện MBV bằng phương pháp PCR. 26 4.2 So sánh kết quả phát hiện MBV trên mẫu tôm giống và tôm thịt bằng phương pháp nhuộm MG, nhuộm