TCNCYH 38 (5) - 2005 CHIẾT XUẤT, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA CÁC MẪU BỘT CHIẾT LÁ DÂU Phạm Thiện Ngọc, Lê Ngọc Liễn Bộ môn Hoá sinh - Trường Đại học Y Hà Nội . t l Đã có một số nghiên cứu trên thế giới đánh giá về tác dụng quý có thể áp dụng trong sinh y học của lá dâu. Cây dâu được trồng phổ biến ở nước ta để lấy lá nuôi tằm, nhưng chưa có nghiên cứu khoa học nào về chiết xuất, xác định lượng polyphenol, tác dụng chống oxy hoá của lá dâu. Mục tiêu: (1) Chiết xuất và xác định hàm lượng polyphenol lá dâu. (2) Đánh giá khả năng chố ng oxy hoá của các mẫu bột chiết lá dâu. Đối tượng và phương pháp: Dùng 5 loại dung môi methanol 100%, methanol 75%, n - hexan 100%, ethylacetat 100% để chiết xuất tạo bột lá dâu. Hàm lượng polyphenol trong các mẫu bột chiết được xác định bằng phương pháp đo quang đơn giản dùng ferrous sulphate. Sử dụng acid linoleic đánh giá khả năng chống oxy hoá in vitro của các mẫu chiết xuất. Kết quả: (1) Methanol 75% cho hiệu xuất chiết xuất bột lá dâu cao nhất (3,9%), trong đó lượng polyphenol chiếm 2,62%. Xác định hàm l ượng polyphenol trong mẫu chiết xuất bằng phương pháp Ferrous sulphat cho kết quả chính xác hơn phương pháp dùng thuốc thử folin (2) Ở ngày thứ 7 và 12, acid linoleic với sự có mặt của các mẫu bột chiết lá dâu chỉ bị peroxy hoá từ 15% tới 42,2%, trong khi ở mẫu đối chứng bị peroxy hoá là 100%. Kết luận: (1) Lá dâu có chứa polyphenol và Ferrous sulpha là phương pháp đơn giản, tin cậy để xác định hàm lượng polyphenol trong mẫu chiết xuất. (2) Bột chiết lá dâu từ 5 loại dung môi trên đều có khả năng chống oxy hoá và tốt nhất là bột chiết bằng methanol 75%. Từ khoá: Lá dâu, polyphenol, acid linoleic, peroxy hoá. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây dâu được trồng khá phổ biến ở nước ta để lấy lá nuôi tằm, lấy tơ dệt vải. Lá dâu và các bộ phận khác của cây dâu còn được dùng để chữa một số bệnh, làm mỹ phẩm bảo vệ và làm đẹp da [5,6]. Trái dâu ngâm rượu làm thức uống khai vị kích thích ăn ngon. Lá dâu là loại thảo dược dễ tìm, giá thành rẻ, không độc, rất phù hợp với đời sống kinh tế và nhu cầu chữa bệ nh của người dân nước ta [1]. Gần đây các công trình nghiên cứu của một số tác giả Nhật Bản, Trung Quốc cũng chứng minh lá dâu có nhiều tác dụng quí có thể áp dụng trong sinh y học như: làm hạ Glucose máu, chống oxy hóa [3], hạn chế rối loạn lipid máu [2]. Hiện nay ở nước ta chưa có nghiên cứu nào về lá dâu, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm mục tiêu: 1. Chiết xuất và xác định hàm lượng polypheno từ lá dâu sử dụng một số dung môi khác nhau. 2. Đánh giá khả năng chống oxy hoá của các mẫu dịch chiết lá dâu. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng 1.1. Chất liệu Nguyên liệu nghiên cứu là lá dâu (Morus alba L. thuộc họ Moraceae) được thu hái vào cuối tháng 11 năm 2004 tại xã Tam Giang, huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh. 1.2. Hóa chất - Ethylgallate, ferrous sulfate, postasium sodium tartrate tetratrydrat, phosphate buffer sodium, acid linoleic, polyphenol chè xanh, folin ciocalteau phenol. - n - hexan, aceton, ethylacetat, methanol, ethanol. - Acid linoleic (Nhật bản). - Sunphenon 100S của công ty Taiyokagaku (Nhật Bản) chứa 68,5% polyphenol - Acid galic. 1 TCNCYH 38 (5) - 2005 i ị l ị 1.3. Trang th ết bị - Bộ cất quay chân không của hãng Buchi (Thụy Sĩ). - Quang kế photometer 4010 (Đức) - Quang phổ kế Optizen 2120 UV (Hàn Quốc) 2. Phương pháp nghiên cứu. 2.1. Chiết xuất tạo d ch chiết cô đặc Lá dâu sau khi thu hái được xử lý sơ bộ và được chiết xuất các thành phần có hoạt tính bằng 5 loại dung môi. Mẫu 1: 50g bột lá dâu + 200ml n - Hexan 100%. Mẫu 2: 50g bột lá dâu + 200ml Ethyl axetat 100%. Mẫu 3: 50g bột lá dâu + 200ml Aceton 100%. Mẫu 4: 50g bột lá dâu + 200ml Methanol 100%. Mẫu 5: 50g bột lá dâu + 200ml Methanol 75%. Chiết xuất 2 lần và dịch chiết của các mẫu được cô đặc ở áp suất và nhiệt độ thấp. 2.2. Định lượng polypheno d ch chiết Polyphenol dịch chiết lá dâu được xác định bằng 2 phương pháp Ferrous sulphate và phương pháp dùng thuốc thử Follin. Biểu đồ chuẩn được xây dựng bằng acid galic [5]. Nồng độ polyphenol trong các mẫu chiết xuất được tính toán theo nồng độ polyphenol chuẩn có trong sản phẩm sunphenon 100S. 2.3. Đánh giá khả năng chống oxy hóa của các mẫu chiết lá dâu Khả năng chống oxy hoá của các mẫu chiết lá dâu được xác định qua việc bảo vệ acid linoleic khỏi bị tác động oxy hoá [4] qua thực nghiệm sau. - Tạo các nhóm hỗn hợp ủ: quá trình peroxy hóa acid linoleic được thực hiện trong 7 ống nghiệm (kể cả ống chứng). Mỗi ống chứa 0,8 ml acid linoleic 2,5% ; 1,6 ml đệm phosphat pH 7,0 ; 0,8 ml nước cất và 1,8 ml mỗi mẫu dịch chiết 0,001% (ống chứng được thay bằng 1,8 ml ethanol 96 o . Các ống nghiệm được nút kín, tránh ánh sáng, ở 40 0 C. - Thực hiện phản ứng xác định mức độ peroxy hoá của các mẫu ở các thời điểm: Trước khi tạo hỗn hợp phản ứng, ngày thứ 7, ngày thứ 12 sau khi tạo hỗn hợp phản ứng. Mức độ peroxy hoá acid linoleic được xác định bằng phản ứng màu với hỗn hợp sau: dịch các ống nghiệm ở trên (0,05ml), Ethanol 75 0 (4,85ml), NH 4 SCN 30% (0,05ml), FeCl 2 0,02M/HCl 3,5% (0,05ml). Lắc đều, đúng 3 phút sau đo mật độ quang học các mẫu thí nghiệm so với ống trắng (Ethanol 75 0 ) ở bước sóng 500nm. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Kết quả chiết xuất tạo dịch chiết cô đặc Từ 50g lá dâu khô chiết xuất bằng 5 loại dung môi khác nhau, kết quả như sau: Chiết bằng n - Hexan 100% Lượng bột thu được: 0,09g Chiết bằng Ethylacetate 100% 1,56g Chiết bằng Aceton 100% 0,72g Chiết bằng Methanol 100% 1,75g Chiết bằng Methanol 75% 1,94g Như vậy lượng bột chiết thô thu được khi chiết bằng Methanol 75% là lớn nhất. 2. Hàm lượng polyphenol trong lá dâu Qua mẫu polyphenol chuẩn, chúng tôi thấy phương pháp xác định hàm lượ ng polyphenol trong dịch chiết bằng thuốc thử ferrous sulphate có độ xác thực cao hơn hẳn phương pháp folin ( kết quả định lượng bằng phương pháp folin không trình bày ở đây). Vì vậy kết quả về hàm lượng polyphenol ở các mẫu dịch chiết ở bảng 1 là dựa theo phương pháp ferrous sulphate. 2 TCNCYH 38 (5) - 2005 Bảng 1. Hàm lượng polyphenol ở các mẫu chiết cô đặc thu được sau chiết xuất Lượng polyphenol Mẫu chiết xuất Hàm lượng (mg) Tỷ lệ % trong bột chiết Mẫu 1 0,04 0,04% Mẫu 2 5,30 0,34% Mẫu 3 3,17 0,44% Mẫu 4 17,50 1,01% Mẫu 5 50,83 2,62% Nhận xét: Trong 50g bột lá dâu khô lượng polyphenol chiết xuất được bằng dung môi methanol 75% (mẫu 5) là cao nhất và chiết xuất bằng n - hexan là thấp nhất (mẫu 1) . 3. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu chiết lá dâu bằng cách sử dụng acid linoleic Hoạt tính chống oxy hoá của 5 loại bột chiết lá dâu dựa theo ống chứng có so sánh với mẫu chè xanh có cùng hàm lượng polyphenol được trình bày ở bảng 2 và minh hoạ ở biểu đồ 1. Bảng 2. MĐQH và mức độ peroxy hoá acid linoleic (POL) của các mẫu thí nghiệm ở các thời gian Thời điểm Trước khi ủ Ngày 7 sau ủ Ngày 12 sau ủ Polyphenol (0,01%) MĐQH POL(%) ) MĐQH POL(% MĐQH POL(%) Mẫu 1 0,020 1,57 0,148 11,60 0,376 29,47 Mẫu 2 0,023 1,80 0,216 16,93 0,536 42,01 Mẫu 3 0,031 2,43 0,174 13,64 0,420 32,92 Mẫu 4 0,025 1,96 0,146 11,44 0,232 18,18 Mẫu 5 0,018 1,41 0,179 14,03 0,191 14,97 Chè xanh 0,027 2,12 0,194 15,20 0,207 16,22 Chứng 0,018 1,41 1,271 99,61 1,276 100,00 Nhận xét: Tất cả các mẫu bột chiết lá dâu có tác dụng hạn chế quá trình peroxy hóa lipid in vitro và tác dụng mạnh nhất là ở mẫu bột lá dâu 5 tương đương với mãu chè xanh. Chúng tôi coi toàn bộ lượng acid linoleic có trong ống nghiệm ở thời điểm 12 ngày sau ủ đã bị oxy hoá hết và có MĐQH là 1,276. Biểu đồ 1. Mức độ peroxy hoá acid linoleic của các mẫu thí nghiệm với sự có mặt của các loại bột chiết lá dâu 3 TCNCYH 38 (5) - 2005 IV. BÀN LUẬN 1. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol Hàm lượng polyphenol trong các mẫu chiết xuất được xác định bằng phương pháp Ferrous sulphate chính xác hơn dùng thuốc thử Follin. Cả 2 phương pháp đều dùng acid gallic là chất chuẩn để dựng biểu đồ chuẩn. Kết quả định lượng polyphenol bằng phương pháp Ferrous sulphate trên cơ sở phản ứng màu của polyphenol với ion Fe 2+ . Mặc dù phương pháp này có thể có sai số thừa vì các monophenol (nếu có) trong mẫu chiết xuất có thể phản ứng với ion Fe 2+ và làm tăng MĐQH, ảnh hưởng đến kết quả định lượng. Tuy nhiên đây là phương pháp đơn giản cũng cho phép xác định sơ bộ hàm lượng polyphenol trong dịch chiết trên cơ sở mẫu chuẩn, cho kết quả phân tích khá chính xác. Theo tài liệu tham khảo mà chúng tôi có, trong lá dâu hầu như không chứa monophenol [1][4]. Do vậy lượng polyphenol định lượng được trong dịch chiết bằng phương pháp sử dụng thuốc thử Ferrous sulphate có độ xác thực cao h ơn, kết quả định lượng được như sau: Hàm lượng polyphenol dịch chiết lá dâu (từ 50g bột lá dâu khô) cao nhất ở mẫu chiết bằng Methanol 75% (50,8mg), tiếp đến là mẫu chiết bằng Methanol 100% (17,5mg), sau đó là mẫu chiết bằng Ethylacetate 100% (5,36mg), mẫu chiết bằng Aceton 100% (3,17mg) và thấp nhất là mẫu chiết bằng n - Hexan 100% (0,04mg). Sự khác nhau về lượng dịch chiết thô thu được cũng như hàm lượng polyphenol dịch chiết ở đây phụ thuộc hoàn toàn vào dung môi dùng để chiết xuất. Vì các mẫu chiết xuất trên cùng một lượng 50g bột lá dâu khô (lá dâu cùng loại), qui trình và điều kiện chiết xuất giống nhau. Tỷ lệ polyphenol trong dịch chiết ở các mẫu đánh giá chất lượng dịch chiết thu được ở mỗi mẫu chiết bằng các dung môi khác nhau. Tỷ lệ này cao nhất ở mẫu chiết bằng Methanol 75% (2,62%), tiếp theo là mẫu chiết b ằng Methanol 100% (1,01%), sau đó là mẫu chiết bằng Aceton 100% (0,44%), mẫu chiết bằng Ethylacetate 100% (0,34%), thấp nhất ở mẫu chiết bằng n - Hexan 100% (0,04%). 2. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu chiết bằng cách sử dụng acid linoleic Trong thí nghiệm này chung tôi đánh giá tác dụng chống oxy hoá của các polyphenol trong các mẫu chiết (ở nồng độ 0,01%) thông qua lượng acid linoleic bị peroxy hoá (POL) theo thời gian ủ ở 40 0 C. Lượng acid linoleic bị peroxy hóa ở thời điểm 7 ngày sau ủ nhỏ hơn lượng acid linoleic bị peroxy hóa ở thời điểm 12 ngày sau ủ. Mức độ chênh lệch này ở các thí nghiệm là khác nhau: Mẫu chứng (100% - 100%), Mẫu bột lá dâu 1 (11,6% - 29,6%), Mẫu bột lá dâu 2 (17% - 42%), Mẫu bột lá dâu 3 (13,7% - 33%), Mẫu bột lá dâu 4 (11,5% - 18,3%), Mẫu bột lá dâu 5 (14,1% - 15%), Mẫu chè xanh (15,3% - 16,3%). Kết quả thực nghiệm cho thấy ở các nhóm thí nghiệm ủ với polyphenol thì lượng acid linoleic bị peroxy hóa giảm so với nhóm chứng. Lượng acid linoleic bị peroxy hóa tỷ lệ nghịch với tác dụng chống oxy hóa của các polyphenol. Polyphenol các mẫu chiết đều có tác dụng hạn chế quá trình peroxy hóa acid linoleic nhưng ở mức độ khác nhau: - Ngày 7 sau ủ: Polyphenol Mẫu 4 có tác dụng chống peroxy hóa tốt nhất, sau đó là polyphenol Mẫu 3, tiếp theo là polyphenol Mẫu 5, polyphenol Mẫu 1, polyphenol Mẫu chè xanh và thấp nhất là polyphenol Mẫu 2. - Ngày 12 sau ủ: Polyphenol Mẫu 5 có tác dụng chống oxy hóa tốt nhất, sau đó là polyphenol Mẫu chè xanh, tiếp theo là polyphenol Mẫu 4, polyphenol Mẫu 1, polyphenol Mẫu 3 và thấp nhất polyphenol Mẫu 3. Sự khác nhau về hoạt tính chống oxy hóa của các polyphenol ở các mẫu chiết có thể do thành phần và lượng polyphenol. Hay nói cách khác, dùng các dung môi chiết xuất khác nhau có thể thu được các polyphenol có phẩm chất khác nhau. Ta thấy polyphenol Mẫu 1 (chiết bằng Methanol 75%) có khả năng chống peroxy hóa tốt và tác dụng này được kéo dài theo thời gian . V. KẾT LUẬN 1. Lá dâu chiết bằng dung môi methanol 75% thu được lượng bột lớn nhất (3,9%); trong đó hàm lượng polyphenol cũng nhiều nhất (2,62%). 4 TCNCYH 38 (5) - 2005 2. Các mẫu chiết xuất lá dâu đều có khả năng chống oxy hóa, mẫu chiết bằng methanol 75% có khả năng chống oxy hóa cao nhất, tiếp đến là mẫu chiết bằng methanol 100%, mẫu chiết bằng dung môi n - hexan 100%, mẫu chiết bằng dung môi aceton 100% và thấp nhất là mẫu chiết bằng dung môi ethylacetate 100%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đỗ Tất Lợi (2001), Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật , tr 252 - 253, 498 - 499, 721 - 723, 734 - 735, 820 - 821. 2. Alan R.L. (1994), "Cholesterol and triglyceride", Free Radical, Biology of Medicin. 3. Gow - Chin Yen, She - Ching - Wu and Pin - Der Duh, Extraction and identification of antioxidant components from the leaves of mulberry (Morus alba L.), J. Agre Food Chen: 1996, 44, 1687 - 1690. 4. Husain S.R, Cillard J, cillard P. (1987), "Hydroxyl radical scavenging activity of flavonoids", Phytochemistry, (26), pp. 2489 - 2491. 5. Kayo Dol, Takashi Kojima, and Yasuo Fujimoto (2000), Mulberry leaf extract inhibits the oxidative modification of rabbit and human low density lipoprotein, Biol, Pharm, Bull 23 (9), 106 - 1071. 6. Vijavan K, Srivastava PP, Awasthi AK. Analysis of phylogenetic relationship among five mulberry (Morus) species using molecular markers. Genome 2004; 47: 439 - 48. Summary EXTRACTION, DETERMINATION OF POLYPHENOL CONCENTRATION AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF MULBERRY LEAF EXTRACT POWDERS It has been being some studyes on biomedical effects of mulberry leaves in the world. Mulberry trees are widly cultivated in VietNam to take leaves for fed of silkworm. However, it has not been a study on extraction, determination and antioxidation of mulberry leaves in VietNam. Objectives: extraction and determination of polyphenol from mulberry leaves. Evaluation of antioxidant capacities of mulberry leaf extract powders. Methods: Mulberry leaf extract powder were extracted from mulberry leaves by five solvens: methanol 100%, methanol 75%, n - hexan 100%, ethylacetat 100%. Polyphenol concentration of the extracts are determined by ferrous sulphate and follin reagent assay. Antioxidant capacities of the powders are based on peroxidation of linoleic acid at 40oC. Results: Among five solvens, the extract by methanol 75% from 50g dryed leaves is best. The powder is 1,94g with 2,62% of polyphenol. Polyphenol concentraion of the extract powders are determined by two methods: ferrous sulphate and follin reagent. The result with ferrous sulphate method is more accurate than follin reagent method. The mulberry leave extract powders inhibited linoleic acid peroxidation at the 7 th and 12 th of reaction (only 15,5 % to 42,2% linoleic acid peroxidated) in comparison with control (100% linoleic acid peroxidated). Conclusions: Polyphenol from mulberry leaves was extracted by some solvens. Among them extraction of polyphenol by methanol 75% is best. Polyphenol concentration of extract powders can be dedermined by ferrous sulphat. The extract powders from mulberry leaves exhibited antioxidant capacities in vitro. The extract powder by methanol 75% showed highest antioxidant capacitiy. Keywords: mulberry leaf, polyphenol, linoleic acid peroxidation. 5 . nào về chiết xuất, xác định lượng polyphenol, tác dụng chống oxy hoá của lá dâu. Mục tiêu: (1) Chiết xuất và xác định hàm lượng polyphenol lá dâu. (2) Đánh giá. 2005 CHIẾT XUẤT, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HOÁ CỦA CÁC MẪU BỘT CHIẾT LÁ DÂU Phạm Thiện Ngọc, Lê Ngọc Liễn Bộ môn Hoá