B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I *** NGUY N XUÂN THÀNH (Ch biên) VŨ TH HOÀN NGUY N TH BÌNH - ðINH H NG DUYÊN Ch biên & hi u đính PGS.TS NGUY N XN THÀNH TH C T P VI SINH V T Chuyên ngành Hà N i - 2007 Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………1 M CL C N i dung Trang Bài s 1: Trang thi t b c n thi t nghiên c u vi sinh v t Bài s 2: Phương pháp c ñ nh tiêu b n nhu m t bào vi sinh v t 12 Bài s 3: Chu n b d ng c môi trư ng nuôi c y vi sinh v t 16 Bài s 4: Nuôi c y vi sinh v t 26 Bài s 5: Phương pháp l y m u ñ phân tích vi sinh v t 31 Bài s 6: Phương pháp phân tích vi sinh v t 33 Bài s 7: ðánh giá đ c tính sinh h c c a vi sinh v t 37 Bài s 8: Phân l p n ch n Azotobacter t ñ t 40 Bài s 9: Phương pháp l y m u phân l p n ch n vi khu n 42 Rhizobium Bài s 10: Phương pháp xác ñ nh nhanh trao ñ i ch t vi sinh v t 46 Bài s 11: Vi sinh v t môi trư ng 50 Bài s 12: Phương pháp xác ñ nh n m men, n m m c, t o 53 nguyên sinh ñ ng v t Bài s 13: Q trình chuy n hố nitơ dư i tác d ng c a vi sinh v t 60 Bài s 14: Chuy n hoá lưu huỳnh dư i tác d ng c a vi sinh v t 63 Bài s 15: Vi sinh v t phân gi i lân (phospho) 65 Bài s 16: Enzym q trình trao đ i nitơ, phospho, lưu huỳnh 67 Bài s 17: Xác ñ nh sinh kh i vi sinh v t ñ t 75 Bài s 18: Sinh trư ng c a vi sinh v t 83 Bài s 19: Thăm quan ki n t p v vi sinh v t 86 Ph l c 88 Tài li u tham kh o 91 Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………2 Bài s TRANG THI T B C N THI T TRONG NGHIÊN C U VI SINH V T M c đích u c u: + N m đư c nh ng máy móc, trang thi t b c n thi t nghiên c u v vi sinh v t + Bi t s d ng thành th o m t s máy móc thơng d ng c a phịng nghiên c u + Hi u đư c t m quan tr ng c a công tác tiêu ñ c, kh trùng + S d ng thành th o kính hi n vi + Phân bi t d ng hình thái c a vi sinh v t N i dung : + Gi i thi u nh ng trang thi t b c n thi t phòng nghiên c u vi sinh v t + Gi i thi u d ng c nguyên li u c n thi t ñ nghiên c u vi sinh v t: d ng c l c, kh trùng, d ng c quang h c, d ng c ño lư ng, môi trư ng nuôi c y + Thao tác v n hành s d ng trang thi t b phòng nghiên c u vi sinh v t + C u t o s d ng, b o qu n kính hi n vi + Quan sát hình thái vi sinh v t I MÁY MĨC T ni c y vi sinh v t (Incubator) T ni c y hay cịn g i t đ nh ơn thi t b quan tr ng dùng công tác nghiên c u vi sinh v t, nhi t đ t có th thay ñ i t 00 – 900 C tuỳ theo ý mu n c a ngư i nghiên c u nhi t ñ t sau ñã ñư c xác đ nh ln ln tr ng thái n đ nh su t th i gian ni c y 1.1 C u t o C u t o v t ni c y có l p: l p kim lo i d n nhi t ñ gi nhi t ñ bên c a t , l p kim lo i dày đư c b c phía b i m t ch t cách nhi t (amiant) Gi a l p l p kho ng tr ng ñ gi cho nhi t ñ t b bi n đ i Trong t có b ph n c m nhi t ñ báo nhi t ñ lên xu ng cho rơ-le ho t ñ ng qu t gió đư c l p ph n gi a thân đ u hồ nhi t đ bên Ph n ngồi t ni có h th ng b ng ñi n t ñ ñi u ch nh nhi t ñ theo yêu c u c a nghiên c u Phía t đư c l p van an tồn, n u nhi t đ t vư t dao ñ ng biên ñ , van an toàn s t ng t 1.2 Cách s d ng ðóng m ch n, b m nút m cơng t c t (có th gi vài giây đ n xu t hi n ñèn báo b ng n t ) Sau b m nút ñ t nhi t ñ th i gian (set up) theo u c u ni c y, u ch nh nhi t ñ th i gian b ng n nút tương Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………1 ng mũi tên lên ho c xu ng Nhi t ñ t m tăng d n ñ t t i nhi t ñ ñã xác ñ nh Nhi t đ s đư c trì su t th i gian ni c y đ nh s n Trên b ng n t ln xu t hi n ch s báo nhi t ñ th c t t Khi đ th i gian ni c y, t s phát ti ng báo hi u rơ le t ng t ñ t ñ ng t t ch ñ làm vi c N u mu n nuôi c y liên t c lâu dài có th khơng c n đ t ch đ th i gian, ch ñ t nhi t ñ Khi mu n k t thúc b m nút t t công t c ngu n 1.3 Khi s d ng máy c n ý nh ng ñi m sau ñây + Hi u ch nh thi t b trư c s d ng + Ph i n i t v i dây ñ t ki m tra ñi n th c a máy v i ñi n th nơi ñ t máy xem có gi ng không, trư ng h p không gi ng ph i dùng bi n th + Khi s d ng t m l n ñ u, ph i ki m tra b ph n ñi u ch nh nhi t đ xem có xác khơng, nhi t đ t có đ u khơng + C a t ln ln ph i đóng kín, tr l y ho c cho nguyên li u vào nuôi c y khơng đư c m c a t r ng lâu + Luôn ph i ñ m b o cho t m ñư c khô ráo, s ch s , ph i cho t ho t ñ ng thư ng xuyên nh t nh ng hơm tr i m Khi làm đ ch t d ch nuôi c y ho c làm b n t , ph i lau chùi sát trùng + Nên ñ t t c c nư c vơ trùng q trình ni c y đ giúp cho qu t gió ho t đ ng t t + Khi không dùng, t t công t c n rút phích c m n T s y khô (Drying oven) 2.1 Tác d ng Dùng t s y khơ đ kh trùng d ng c th y tinh, ñ s ng nghi m, xi lanh, h p l ng, c c, ph u, c i ch y s , đ kim khí dao, kéo, panh d ng c khác khơng có nư c khác bông, băng, v i Tr v t li u làm t cao su môi trư ng nuôi c y khơng đư c kh trùng b ng t s y khô Nguyên lý c u t o c a t s y khô g n gi ng t m, ch khác có th ti t trùng nhi t ñ 175 - 200o C 2.2 Cách s d ng t s y khô Các d ng c ph i r a s ch, đ khơ, bao gói c n th n trư c cho vào t , sau s p x p th vào t r i đóng kín c a đóng l thơng khí B t cơng t c n, ñ t ch ñ làm vi c cho t (ñi u ch nh nhi t ñ th i gian gi ng v i t đ nh ơn) Thông thư ng d ng c nuôi c y phân tích vi sinh v t đư c kh trùng 160-180oC gi V i d ng c , như: pipét, xi lanh,… khơng đư c s y q 60oC nhi t đ cao làm giãn n thu tinh d n ñ n m t ñ xác c a d ng c Lưu ý s y khơng nên đ t d ng c sát thành t đ y nhi t đ thư ng cao Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………2 nhi u d làm cháy gi y gói ho c nút bông, không nên x p d ng c khít đ khơng khí có th lưu thơng đư c làm nóng đ u v t c n kh trùng Sau ng t m ch ñi n, ch nhi t ñ h d n xu ng b ng nhi t đ phịng m i đu c m c a t ñ l y d ng c s y D ng c l y ph i ñ giá g , gi y ho c v i, khơng đư c đ g ch men, sàn g ch ho c sàn xi măng d ng c nóng g p l nh s d v làm nh hư ng ñ n tính vơ trùng c a d ng c N i h p nư c cao áp (Autoclave) 3.1 Nguyên lý N i h p nư c cao áp (hình 1) làm b ng kim lo i ch u đư c nhi t đ cao (ít nh t 135o C) có th dùng n, dùng c i ho c dùng than ñun cho nư c sôi, nư c s nén d n l i n i n u ti p t c đ cho nư c sơi áp l c n i s tăng d n, áp l c tăng nhi t đ c a nư c n i cao, v y gi a nhi t ñ t0 c a nư c áp l c P c a có liên quan v i nhau, không ph i theo m t t l ñư ng th ng (xem ñ th ) Khi áp l c k ch s có nghĩa là: áp l c P n i h p = áp l c P khơng khí Cho nên áp l c k ch 1kg/cm2 ch hi u s gi a áp l c bên v i áp l c khơng khí t n t i n i 1kg/cm2 = P (trong n i) - P (khơng khí n i) Do áp l c P n i không phù h p v i P áp l c k hay nói m t cách khác, nhi t ñ n i khơng tương ng v i nhi t đ c a áp l c k Vì v y mu n cho nhi t ñ n i phù h p v i áp l c k ph i lo i b h t khơng khí n i (1kg/cm2 = 1atm = phoud) B ng So sánh m i liên quan gi a áp su t ghi áp k c a n i h p bi u th b ng atmosphere nhi t ñ n i lo i h t khơng khí Áp su t (atm) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 Nhi t ñ (oC) 100,0 102,5 105,0 107,5 110,0 Áp su t (atm) 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Nhi t ñ (oC) 112,5 114,5 116, 117,0 119,0 Áp su t (atm) 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 Nhi t ñ (oC) 121,0 129,9 124,0 125,0 126,0 Áp su t (atm) 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 Nhi t ñ (oC) 127,0 128,0 129,0 130,0 131,0 132,0 Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………3 Hình Sơ đ n i h p áp l c ð lo i b h t khơng khí n i có cách: a) ðóng khóa ñ tăng áp l c n i lên ñ n kho ng 0,3 atm r i xì cho h t ra, sau khóa l i cho tăng áp l c b) M khóa ñun cho ñ n nư c b t đ u thành m t lu ng tr ng m nh, ñ u đóng l i cho tăng áp l c 3.2 Cách s d ng n i h p cao áp - ð nư c vào n i h p v i lư ng v a ñ (xem v ch ngang ghi ng th y tinh ho c bình ch a l p bên n i h p) Chú ý nư c ph i ng p dây may so n i n u n i h p xách tay - Các d ng c ñem h p ph i đư c bao gói k , đ i v i bình ng mơi trư ng có nút bơng ph i b c b ng gi y d u ho c gi y nhơm đ tránh nư c ñ ng làm t nút - Khi s p x p d ng c vào n i h p khơng nên đ sát q, đ v t n ng xu ng dư i v t nh lên - ð y n p, khóa ch t c theo t ng đơi đ i x ng ñ kh i vênh, kh i h , tháo khóa ph i làm v y ðóng van u áp van x - M m ch ñi n ho c ñ t nhiên li u ñ cung c p nhi t cho n i, n nút m công t c n i (nút on), ñ t ch ñ làm vi c (nhi t ñ th i gian h p) cho n i Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………4 b ng cách ñi u ch nh mũi tên lên xu ng Ch ñ làm vi c th hi n b ng ghi ñi n t Sau h p ñ theo nhi t ñ th i gian ñ nh s n, rơ le s t ng t, n i phát ti ng kêu báo hi u trình h p ñã k t thúc V i n i h p xách tay ph i ln ln có m t ñ theo dõi kim ch áp l c ñ ng h áp l c k h p, lo i h t khơng khí n i theo phương pháp ñã nêu Khi ñ t t i m c c n thi t u ch nh ngu n nhi t đ trì áp l c khơng đ i m t kho ng th i gian c n thi t Nhi t ñ th i gian h p kh trùng ph thu c vào v t ñem kh trùng m c đích nghiên c u Ngư i ta thư ng h p nhi t ñ 121oC kho ng 20 phút nha bào c a m t s lo i vi khu n s b tiêu di t - Khi ñ t t i th i gian c n thi t ng t n ( n nút off) ho c rút h t nhiên li u ñ i cho áp l c h d n xu ng 0o C, nhi t ñ n i gi m h n r i m i ñư c m n p l y d ng c ñã kh trùng Chú ý tránh h áp l c ñ t ng t b ng cách m van xì m nh s làm r n n t ho c v d ng c Cũng không nên ñ n i h p ngu i l nh m i l y d ng c ra, lúc n p n i s mút ch t vào mi ng đ m cao su r t khó m - Các d ng c l y không ñư c ñ n n g ch men, n n ñá, n n xi măng (vì d ng c ñang nóng g p l nh s v , n t) đ m bào tính vơ trùng cho d ng c T l nh (Freezer) T l nh m t thi t b quan tr ng dùng ñ gi b o qu n gi ng vi khu n, virus b o qu n lo i huy t thanh, lo i vacxin, môi trư ng dùng đ ni c y T l nh 0o- 4o C dùng ñ gi gi ng vi khu n T l nh -15o C ñ n -30o C dùng ñ gi gi ng virus Máy ly tâm (Centrifugal machine) 5.1 Công d ng - T p trung ñáy ng ph n t c n nghiên c u ch a m t b nh ph m hay ch t mang - T p trung vi khu n nuôi c y môi trư ng l ng ñ tách riêng vi khu n - Làm m t ch t l ng ch a nhi u ph n t ñ c v n ñ c - Tách h ng c u riêng v i huy t tương… 5.2 Cách s d ng Máy ly tâm thông thư ng có m t tr c quay trịn, v phía c a tr c có m t hình ñ nh n ng ch a ch t l ng c n ly tâm Các ng ñư c móc vào b ng m t quai Khi quay ng s giãn th ng góc v i tr c quay ñ ng h t l ng xu ng theo ñư ng tr c c a ng d n v phía đáy V i ki u máy này, t c ñ t i ña 4500 - 6000 vòng m t phút Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………5 Các máy ly tâm g n có b ph n thăng b ng t đ ng, có máy đ th i gian t ñ ng, có ñ ng h ch t c ñ v.v , ly tâm ch c n v n nút theo ý mu n Nh ng thi t b c n thi t khác - Máy hút chân khơng (vacuum gauge) - Máy đ m khu n l c (colony counting) - Máy ño pH (pH meter) hay thang ño pH (pH paper set) - Máy c t nư c (Deionizers) - Máy ñánh m u (Mixers) - Máy ñ m t bào (cell counting) - Máy l c (shaker) - Phịng ho c bu ng vơ trùng (clean bench, laminars) II CÁC D NG C VÀ THI T B PHỊNG THÍ NGHI M Thi t b quang h c - Kính hi n vi quang h c (Microscopy) - Kính hi n vi ch p nh - ðèn soi kính hi n vi - T quang n n ñen - Thư c ño v t kính thư c đo th kính - Kính lúp hai m t ñeo trán - Máy projector - Máy Over head - Máy nh - ðèn t ngo i (UV lamp) Thi t b ño lư ng - Cân k thu t (technical balance) - Cân ti u ly có l ng kính - Cân ti u ly xách tay - Cân bàn - Cân phân tích n - Nhi t k treo tư ng lo i nhi t k ño nhi t ñ khác - ð ng h ñi n t ñ m phút, giây Các lo i d ng c khác - Các lo i d ng c th y tinh: Phi n kính, h p l ng, ng nghi m, l , bình, ph u, c c ng đong, xi lanh, pipet, que g t, ñèn c n Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………6 - Các lo i d ng c kim lo i: Dao m lo i, kéo th ng, kéo cong, panh, que c y, đèn xì, h p tiêu ñ c, cưa xương - Các lo i d ng c ñ men, s : Khay men, c i chày s , xoong n i ñ pha ch môi trư ng - Các lo i d ng c cao su, v i, bông, băng: Găng tay ñ m ñ r a d ng c , ng, th m nư c, không th m nư c, v i g c, v i l c, v i - Các lo i hóa ch t ñ ch môi trư ng, r a d ng c th y tinh sát trùng tiêu ñ c - Các lo i thu c nhu m thu c th ph n ng sinh hóa - Các lo i gi ng vi khu n virus, lo i kháng huy t đ ch n đốn, lo i khu n t đ ch n đốn III KÍNH HI N VI Kính hi n vi m t d ng c quang h c r t c n thi t đ nghiên c u hình thái vi sinh v t nghiên c u nh ng v t h t s c nh mà m t thư ng khơng th nhìn th y đư c, có nhi u lo i kính hi n vi khác * C u t o kính hi n vi quang h c Kính hi n vi quang h c g m có b ph n: B ph n h c 1.1 Chân kính hay đ kính Dùng đ đ kính hi n vi tr ng thái cân b ng, c u t o t kim khí đ c bi t 1.2 Thân kính N i li n v i chân kính, đư c t o t lo i kim khí đ c bi t Thân kính đ g n tồn b b ph n c a kính hi n vi 1.3 ng kính Là m t ng kim khí r ng hình tr l p tr kính, ñ u c a ng kính l p th kính, phía dư i c a ng kính bàn xoay dùng đ l p v t kính Tác d ng c a ng kính v t nh đư c phóng đ i l n th nh t b i v t kính, đưa v t nh qua ng kính t i th kính đ phóng v t nh l n th Như v y v t nh ta quan sát th y nh o 1.4 Khay kính hay đĩa kính Có th hình vng hay hình trịn nơi đ t tiêu b n đ quan sát, gi a có l th u quang ñ ñưa ánh sáng t b t quang kính lên tiêu b n Trên khay kính có b ph n k p tiêu b n cho v ng b ph n g i xa ñ di chuy n tiêu b n theo hai chi u khác nhau, t trái sang ph i, t trư c sau ngư c l i đ tìm v t nh Ngồi ra, khay kính cịn có th di chuy n theo chi u b ng cách v n hai c hai bên khay kính 1.5 c u ch nh Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………7 G m có c u ch nh l n ( c sơ c p) c ñi u ch nh nh ( c vi c p) c sơ c p dùng ñ ñi u ch nh tiêu ñi m, c vi c p dùng ñ ñi u ch nh cho nh v t rõ nét B ph n quang h c: 2.1 Gương ph n chi u ð t phía dư i khay kính g m có hai m t, m t m t ph ng m t m t lõm, dùng ñ l y ánh sáng 2.2 T quang kính ðư c l p vào phía dư i khay kính b i m t c c đ nh, dùng ñ t p trung ánh sáng vào tiêu b n 2.3 B ph n ch n sáng Có hình gi ng đ t phía dư i t quang kính có th m r ng hay h p dùng đ u hịa ánh sáng vào tiêu b n 2.4 V t kính Là m t h th ng quang h c r t quan tr ng ph c t p, g m m t s th u kính, tr c ti p phóng đ i nh th t c a v t xem, kh phóng đ i c a v t kính ph thu c vào tiêu c t c ph thu c vào bán kính cong c a th u kính; th u kính cong, tiêu c ng n kh phóng đ i l n V t kính dùng đư c l p vào bàn xoay phía dư i ng kính Có hai lo i v t kính: + V t kính khơ: v t kính có đ phóng đ i th p x8; x20; x40; dùng ñ xem tươi, xem vi khu n di ñ ng, xem khu n l c, hay xem ký sinh trùng ho c xem tiêu b n t ch c + V t kính d u: v t kính có đ phóng đ i cao x 90; x100; x 120…, có m t vịng khác màu đ u v t kính đ phân bi t v i v t kính khơ V t kính khơ v t kính d u khác ch t mà ánh sáng ph i ñi qua tiêu b n (phi n kính) v t kính v t kính khơ ch t qua khơng khí mà ch s khúc x (chi t xu t) c a khơng khí n = r t khác v i ch s khúc x c a th y tinh n = 1,52; tia sáng kh i tiêu b n s b ph n x ph n ngồi c a chùm ánh sáng khơng l t đư c vào v t kính v t kính có đ phóng đ i l n ngư i ta dùng d u b ch hương (huile de cèdre) có ch s khúc x n =1,51 x p x v i ch s khúc x c a th y tinh n = 1,52 ñ t vào gi a tiêu b n v t kính Lúc th y tinh d u b ch hương m t mơi trư ng g n đ ng nh t, nên ánh sáng ñi qua th y tinh s không b khúc x mà chi u th ng vào v t kính Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………8 Cho ba m u đ i ch ng m khơng xơng (50g kh i lư ng khô) vào chai nh a PE dùng 200ml dung d ch kalisunphat ñ chi t * Chi t: ð chi t tách cacbon h u cơ, chuy n m u ñ t vào chai nh a PE th t c n th n, cho thêm 200ml dung d ch kalisunphat, l c chai máy l c n m ngang t c ñ 200 vòng/phút 30 phút ho c máy l c đ ng t c đ 60 vịng/phút 45 phút l c dung môi qua gi y l c Chi t đ i ch ng khơng xơng l c dung môi chi t v y N u khơng phân tích ngay, b o qu n d ch chi t c a m u ñ t xông không xông t ñá gi nhi t ñ t -15oC ñ n -20oC Trư c s d ng làm tan d ch chi t đ n nhi t đ phịng đ ng nh t chúng * Chú thích: Trong b o qu n dung môi chi t thư ng xu t hi n k t t a tr ng (đ c bi t gi nhi t đ đơng l nh) b i chúng thư ng đư c bão hồ v i canxisunphat (CaSO4) Khơng c n hồ tan lư ng canxisunphat dư khơng tác d ng v i b t kỳ hoá ch t trình ti n hành theo phương pháp Các màng t bào c a r non, s ng b nh hư ng qua trình xơng b ng cloroform N u đ t có ch a nhi u r s ng c n ph i ti n hành thêm m t qui trình x lý trư c chi t theo ph l c * Xác ñ nh cacbon d ch chi t Hàm lư ng cacbon c a vi sinh v t m u ñ t ñư c xác đ nh b ng cách phân tích hàm lư ng có th s d ng đ so sánh m u ñ t khác N u c n s li u v sinh kh i vi sinh v t hi n t i, lúc phân tích v y đư c nhân v i h s chuy n ñ i ñư c rút t th c nghi m, tương quan gi a kh i lư ng t bào ñã bi t v i lư ng cacbon sau xông chi t tách T t c h s chuy n ñ i ñã s d ng ñ u tưong quan theo h s ban ñ u Xác ñ nh hàm lư ng cacbon d ch chi t b ng phương pháp oxy hoá dicromat ho c phương pháp phân tích máy 2.2.2 Xác đ nh cacbon sinh kh i vi sinh v t b ng phương pháp oxy hố dicromat Trong mơi trư ng axit m nh ch t h u b oxy hoá Cr (VI) b kh thành Cr(III) Lư ng dicromat cịn l i đư c chu n đ ngư c - Thu c th b sung: + Kalidicromat K2Cr2O7 0.0667 M (19.6125g kalidicromat khô/lit nư c) Do b n ch t nguy h i c a kalidicromat, ph i r t c n th n s d ng th i b + Axit photphoric H3PO4 (p = 1.71 g/ml) + Axit sunfuric H2SO4 (p = 1.84 g/ml) Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………87 + S t (II) amoni sunphat, dung d ch chu n ñ [(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O] = 0.04M: S t (II) amoni sunphat (15.69g)hoà tan nư c c t, thêm 20 ml axit sunfuric, sau cho ti p nư c c t ñ n m c 1000ml + Dung d ch ph c sunphat 1.10 – phenanthrolin 0.025 mol/l + H n h p axit: Hai th tích axit sunfuric tr n v i m t th tích axit photphoric - Thi t b b sung: + Sinh hàn Liebig (Làm l nh b ng nư c) + Bình đáy trịn 250ml, Buret 10ml, chia ñ 0.05ml, Pipet 2ml - Cách ti n hành: Dùng pipet l y 2ml dung d ch kali dicromat (PD) 15 ml h n h p axit cho vào 8ml d ch chi t ñã ñư c l c (PS) bình đáy trịn 250 ml ðun h i lưu nh toàn b h n h p vịng 30 phút, sau làm l nh pha lỗng v i kho ng 20 ml đ n 25ml nư c qua ñư ng sinh hàn ñ tráng Cũng ti n hành tương t v y v i m u tr ng, có ch a ml dung d ch K2SO4 Xác ñ nh lư ng dicromat th a b ng cách chu n ñ ngư c v i mu i kép sunphat s t (II) amoni dùng m t vài gi t dung d ch ph c 1, 10-phenanthrolinsunphat s t (II) làm ch th 2.2.3 Tính tốn k t qu Tính lư ng cacbon h u chi t đư c b ng cơng th c (1) (2) C(g/ml) = [(VH-VS)/VC]x MPD x E x 1000/Ps …(1) Trong đó: VS: Th tích dung d ch chu n ñ ñã dùng ñ chu n m u (ml) VH: Th tích dung d ch chu n ñ ñã dùng ñ chu n m u tr ng h i lưu (ml) VC: Th tích dung d ch chu n ñ ñã dùng ñ chu n m u tr ng không h i lưu (ml) M : K2Cr2O7 (mol /lit) Po: Th tích dung d ch K2CR2O7 b sung (ml) Ps: Th tích dung d ch m u b sung (ml) E: (chuy n ñ i t cacbon h u C[C]thành CO2[C (+ IV)]) C(g/ g đ t khơ) = C(g/ml) x (PK/ Dw + Sw) Trong đó: PK : Dw: …(2) Kh i lư ng dung môi chi t (g) Kh i lư ng ñ t khô (g) Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………88 Sw: Nư c ñ t (g nư c/ g đ t khơ) Tính lư ng cacbon sinh kh i Bc,, theo công th c (3): Bc = Ec/ kEC …(3) Trong đó: Ec= (kh i lư ng cacbon h u chi t ñư c t ñ t xông hơi) – (kh i lư ng cacbon h u chi t đư c t đ t khơng xơng hơi) KEC= 0.38 H s kEC đư c tính tốn t m i liên quan gi a k t qu c a nh ng phương pháp - xông phương pháp chi t-xơng (12 lo i đ t) 2.2.4 Xác ñ nh cacbon sinh kh i vi sinh v t b ng phân tích cacbon theo phương pháp quang ph * Nguyên t c V i s có m t c a kali persunphat (K2S2O8), cacbon h u chi t ñư c c a ñ t b oxy hoá thành cacbon dioxit lư ng cacbon dioxit ñư c ño b ng ph (IR) (UV) - Thu c th b sung + Kali persunphat (K2S2O8.) + Axit photphoric + Natri polyphosphat [(NaPO3)m], r t tinh t - Thu c th Kali persunphat: Hoà tan 20 g kali sunphat 90 ml nư c c t, dùng axit phosphoric ñi u ch nh pH c a dung d ch b ng sau cho nư c c t v a ñ ñ n 1000ml - Thu c th natri polyphosphat: Hoà tan 50 g natri polyphosphat 90 ml nư c c t, dùng axit phosphoric ñi u ch nh pH c a dung d ch đ n sau thêm nư c c t ñ n 1000ml - Thi t b b sung + Máy phân tích cacbon t đ ng v i b phát hi n h ng ngo i ho c v i h th ng dòng liên t c v i ñ u ño so màu Trong tiêu chu n vi c xác ñ nh cacbon sinh kh i vi sinh v t d a s oxy hoá cacbon h u b ng persunphat đư c ho t hố tia c c tím - Cách ti n hành ð i v i phương pháp oxy hố t đ ng b ng persunphat – tia c c tím, tr n 5ml ph n chi t t ñ t b ng dung d ch kali sunphat v i ml thu c th natri polyphosphat B t kỳ k t t a c a CaSO4 đ u đư c hồ tan q trình Thu c th kali persunphat ñư c ñưa m t cách t đ ng vào bu ng oxy hố UV, ñây s oxy hoá thành CO2 ñư c th c hi n b ng tia c c tím CO2 đư c t o thành ñư c ño b ng h p th h ng ngo i hay b ng quang ph UV Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………89 2.2.5 Tính tốn k t qu - Tính lư ng cacbon h u chi t đư c (C) theo cơng th c (4): C (g/g đ t khơ) = [(V x DV) – (B x DV)] x (Pk/ Dw + Sw) …(4) Trong đó: V: C(g/ ml) c a m u B: C(g/ ml) c a m u tr ng DV: ð pha loãng c a m u b ng natri phosphat (ml) DB: ð pha loãng c a m u tr ng b ng natri phosphat (ml) PK : Kh i lư ng dung môi chi t (g) DW: Kh i lư ng đ t khơ (g) SW : Nư c ñ t (g nư c/ g ñ t khơ) - Tính lư ng sinh kh i BC s d ng công th c: (5) BC = Ec/kEC Trong ñó: EC = (cácbon h u chi t ñư c t đ t xơng hơi) – (cácbon h u chi t đư c t đ t khơng xơng hơi) KEC = 0,35 H s KEC đư c tính t m i liên quan gi a k t qu c a phương pháp xông k t qu c a phương pháp chi t – xông (23 lo i đ t) Có th s d ng phương pháp chi t - xông k t h p v i phương pháp nghiên c u phân hu c a ch t h u ñánh d u 14C * Qui trình chi t sơ b v i ñ t có ch a nhi u r s ng Cho ñ t m (25 ñ n 50 g kh i lư ng khơ) vào bình thu tinh 250 ml có ch a 100 ml dung d ch kali sunphat đ chi t vịng 20 phút máy l c sàng (ñ i v i ñ t canh tác kích thư c l 2mm, cịn đ i v i ñ t ñ ng c 3mm) R a th t s ch r (và h t ñá nh ) sàng b ng 75 ml dung d ch kali sunphat b sung thêm s y khô, cân chúng Ly tâm kho ng 500 g huy n phù g m ñ t dung d ch kali sunphat bình thu tinh 15 phút Sau ch t nư c l c phía Cho thêm gi t cloroform vào ñ t ñ xơng Qui trình N u có r s ng đ t nh t thi t ph i s d ng qui trình Hơn n a, qui trình t o cho vi c ño nitơ sinh kh i vi sinh v t d dàng b ng vi c gi m nitơ vơ n n có đ t Nó cịn gi m nh ng khó khăn đo sinh kh i vi sinh v t đ t khơ v y r t ti n l i cho vi c ño s dao ñ ng c a cacbon sinh kh i vi sinh v t ñ t nitơ năm Sinh kh i vi sinh v t ño ñư c không b chi t tách kh i đ t b ng qui trình chi t sơ b Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………90 Xác ñ nh sinh kh i nitơ c a vi sinh v t đ t Sau xơng b ng cloroform, m u ñ t ñư c chi t b ng dung d ch kali sunphat Nitơ t ng s d ch l c ñư c xác ñ nh bi n ñ i sang nitơ sinh kh i (Brookes cs, 1985) Nitơ t ng s ñư c xác ñ nh theo phương pháp Kjeldahl 3.1 V t li u, hoá ch t thu c th Các v t li u, hoá ch t, d ng c thu c th chu n b xác ñ nh cacbon sinh kh i vi sinh v t 3.2 Th t c ti n hành 3.2.1 Chi t - xơng Xơng 150-200g m u đ t m b ng cloroform 24h gi ng phân tích cacbon sinh kh i Sau (ngư c v i k thu t chi t-xông trên, cloroform khơng đư c tách kh i m u), tr n đ t xơng v i dung d ch kali sunphat theo t l 1:4, l c 30 phút l c làm m u phân tích (3 l n l p l i) Ti n hành tương t v i m u đ i ch ng khơng xơng (3 l n l p l i) Ti n hành phân tích lư ng nitơ t ng s d ch l c theo phương pháp Kjeldahl Có th c t gi d ch l c 4oC cho ñ n phân tích 3.2.2 Phân tích nitơ theo phương pháp kjeldahl - D ng c , hoá ch t b sung: + Bình Kjeldahl (250ml), b c t ñ m Kjeldahl + Axit sunfuric H2SO4 (p = 1.84 g/ml) + H2SO4 0,05M + H n h p xúc tác: 100g K2SO4 + 10g CuSO4 + 1g Se, nghi n nh + NaOH 32% (w/v) + Axit boric 2% (w/v) + Dung d ch ch th (ví d xanh bromcresol, ñ metyl) - Ti n hành: Cho 0,5g h n h p xúc tác 20ml H2SO4 ñ c vào bình d ch l c, cơng phá cho đ n thu ñư c dung d ch trong, ñ ngu i nhi t đ phịng Cho 10ml axit boric vài gi t ch th vào bình h ng d ch chưng c t Sau thêm xút dư ti n hành chưng c t 3-20 phút ñ chuy n hồn tồn NH3 vào bình ch a axit boric ch th Xác ñ nh N-NH4 b ng chu n ñ v i H2SO4 0,05M (ñi m chu n ñ dung d ch chuy n t xanh sang h ng Lư ng nitơ m u ñư c tính theo cơng th c sau: (S-C).1,4.100.100 = %N A SW.1000 Trong đó: S: Lư ng axit H2SO4 0,05M dùng cho m u (ml) Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………91 C: Lư ng axit H2SO4 0,05M dùng cho ñ i ch ng (ml) 1,4: H s chuy n ñ i (1ml H2SO4 0,05M tương ng v i 1,4 mgN) 100: Lư ng d ch tiêu th (ml) A: c s d ch tiêu th (ml) SW: Lư ng ñ t ban ñ u 100.1000-1: H s chuy n ñ i (%, w/w) 3.3 Tính k t qu Nitơ sinh kh i vi sinh v t đư c tính theo phương trình: (S-C) = µg N.g-1 dm 0,54 Trong đó: S: Giá tr c a m u (µg N-NH4.g-1dm) C: Giá tr đ i ch ng (µg N-NH4.g-1dm) 0,54: H s KEN (m i quan h gi a nitơ sinh kh i VSV nitơ t ng s ñ t) * Câu h i ôn t p: Bài s 17 Sinh kh i VSV có mơi quan h m t thi t v i s n ph m nuôi c y môi trư ng lên men? Các phương pháp th lo i thu c th , cơng th c tính cho t ng nhóm VSV? Tính tốn k t qu thí nghi m c a t ng lo i sinh kh i cho t ng nhóm VSV chun tính? Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………92 Bài s 18 SINH TRƯ NG C A VI SINH V T M c đích u c u: + Xác ñ nh ñi u ki n nuôi c y cho m i lo i VSV: h o khí, y m khí b t bu c, y m khí khơng b t bu c + Hi u rõ phương pháp nuôi c y vi khu n y m khí + Xác đ nh pha c a ñư ng cong sinh trư ng c a m t vi khu n n hình N i dung ki n t p: + Nuôi c y vi khu n y m khí + ðo đ đ c sinh trư ng c a vi khu n Gi i thích s li u sinh trư ng c a vi khu n ñ th + Xác ñ nh nh hư ng c a nhi t ñ ñ n s sinh trư ng c a VSV Nguyên lý chung Vi sinh v t có nh ng yêu c u v dinh dư ng, lý h c, hoá h c mơi trư ng ph i đư c đáp ng ñ sinh trư ng phát tri n Ki n th c v ñi u ki n c n thi t cho sinh trư ng c a VSV có th giúp d dàng ni c y VSV u n VSV khơng mong mu n Năm 1861, Jean Baptiste Dumas trình bày m t báo cáo t i vi n hàn lâm Pasteur Trong báo này, ơng b t đ u: “ S t n t i c a l p trùng mao có đ c trưng c a men ñáng ý, m t ñ c trưng c n ñư c quan tâm nhi u ñ ng v t nh trùng mao s ng nhân lên vô h n s v ng m t c a lư ng khơng khí nh nh t ho c oxy t do…” Khi nói khơng khí m t u c u sinh trư ng, c n xem xét lư ng oxy khơng khí Hơn th n a, nh c ñ n oxy, thư ng mu n nói đ n oxy phân t (O2) đóng vai trò m t ngu n cung c p n t hơ h p h o khí Các u ki n v t lý mơi trư ng nh hư ng ñ n s sinh trư ng c a VSV nhi t ñ , áp su t th m th u pH Oxy s sinh trư ng c a vi sinh v t S có m t hay v ng m t phân t oxy (O2) có th vơ quan tr ng ñ i v i s sinh trư ng c a VSV M t s VSV g i VSV h o khí địi h i có oxy, VSV khác g i VSV y m khí l i khơng s d ng oxy M t lý n VSV y m khí b t bu c khơng th ch u đư c s có m t c a oxy chúng thi u catalaza k t qu s tích lu hydro peroxyt gây ch t t bào Các lồi h o khí ch u khí có th khơng s d ng oxy ch u đư c kha t t, m c dù s sinh trư ng c a chúng có th ñư c tăng cư ng ñi u ki n vi h o khí h u h t VSV trao ñ i ch t theo ki u lên men Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………93 M t s lo i vi khu n ch u m t ph n sinh trư ng t t nh t khí quy n có n ng đ CO2 tăng (7-10%) n ng ñ O2 th p Chúng s sinh trư ng mơi trư ng đ c ñ sâu mà m t lư ng nh oxy có th t n m n vào ð nuôi c y VSV ch u khí m t ph n ñĩa petri môi trư ng không nghèo ñi, m t bình n n đư c s d ng Các ñĩa ng nghi m x lý ñư c ñ t bình l n v i m t n n sáng Sau ñ y nút, t t n n ñi n ng ñ oxy gi m Các VSV có kh s ng u ki n có ho c khơng có oxy g i VSV m khí khơng b t bu c gi ng vi khu n thi u catalaza Streptococcus, Leucconostoc, Lactobacillus Clostridium Trong Clostridium y m khí b t bu c, cịn gi ng y m khí ch u khí lồi khơng có h th ng xytocrom đ s n sinh hydro peroxyt, khơng c n catalaza Vi c xác đ nh s có hay khơng có m t catalaza r t h u ích đ nh lo i vi khu n Khi m t vài gi t hydro peroxyt 3% ñư c cho vào khu n l c catalaza hi n di n, phân t oxy đư c gi i phóng dư i d ng b t khí Trong phịng thí nghi m, có th ni c y vi khu n y m khí b t bu c ho c khơng b t bu c b ng cách lo i tr oxy t t môi trư ng ho c s d ng mơi trư ng bi n đ i Nhi u phương pháp ni c y VSV y m khí gi i quy t đư c c q trình T t c phương pháp nuôi c y VSV y m khí ch hi u qu n u m u hay VSV ni c y đư c thu th p chuy n ñi theo cách làm gi m thi u s bi u l c a oxy 2.1 V t li u ðĩa petri ch a môi trư ng dinh dư ng ng nghi m ch a mơi trư ng Thioglycolat có ch th Bình y m khí Hydro peroxyt 3% 2.2 D ch ni c y Alcaligenes Clostridium Enterococus Escherichia coli 2.3 Th t c ti n hành - Không l c ng Thioglycolat - Dán nhãn ng canh thang nhi m m i ng m t vòng que c y m t lo i vi khu n ñi u ki n vô trùng - Nuôi 35oC - Ghi l i s xu t hi n sinh trư ng m i ng - Dùng bút ñánh d u dư i ñáy chia m i ñĩa th ch thành ph n Dán nhãn đĩa hào khí đĩa y m khí Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………94 - Ria c y ñư ng ñơn vi khu n m i ph n ñĩa - ð t ngư c đĩa h o khí ni 35oC ðĩa y m khí đư c đ t ngư c bình - Ngư i hư ng d n s ch ng minh làm th đ bình tr thành y m khí 10 ml nư c đư c thêm vào túi ñi u ch nh khí Gas-Pak (xúc tác hydro k t h p oxy t o thành nư c, ph n ng s d ng l i thêm nư c vào) đ t bình v i ch th xanh methylen Khi có m t c a oxy ch th có màu xanh, chuy n thành tr ng oxy gi m - Ni bình 35oC - Sau nuôi c y, ghi l i s sinh trư ng c a vi khu n m i ñĩa - Th c hi n ki m tra th catalaza b ng cách cho thêm vài gi t H2O2 3% vào khu n l c khác ñĩa th ch Test catalaza dương tính s sinh b t bong bóng tr ng Có th dùng kính hi n vi ñ xác ñ nh rõ b t bóng Test th catalaza có th đư c th c hi n lam kính Vi khu n sinh trư ng môi trư ng th ch máu có th s d ng phương pháp Xác ñ nh ñư ng cong sinh trư ng c a vi khu n: nh hư ng c a ñi u ki n nhi t ñ Các pha sinh trư ng c a VSV có th đư c xác đ nh b ng cách đ đ c c a dich ni c y ð đ c khơng ph i đơn v ño lư ng tr c ti p s lư ng VSV, ñ ñ c tăng ñã ch s sinh trư ng c a VSV T s hi n di n c a tri u t bào/ml có th phân bi t đ đ c b ng m t, máy ño quang ph ñư c s d ng ñ ño xác ñ nh ñ ñ c v i lư ng VSV nh ða s VSV sinh trư ng m t kho ng nhi t ñ nh t ñ nh Nhi t ñ sinh trư ng t i thi u nhi t ñ th p nh t mà lồi VSV s phát tri n Các loài VSV sinh trư ng nhanh nh t nhi t ñ sinh trư ng t i ưu c a chúng Và nhi t ñ cao nh t mà chúng có th sinh trư ng nhi t đ sinh trư ng t i ña Vi sinh v t ñư c chia thành nhóm d a theo nhi t ñ sinh trư ng c a chúng Nhi t ñ t i ưu c a VSV ưa l nh 15oC, c a VSV ưa m 25oC 40oC Nhi t đ t i thích c a nhi u lo i ưa nhi t 45-65oC, m c dù m t vài lồi có kh sinh trư ng 90oC Kho ng nhi t đ ưa thích c a VSV di truy n quy t ñ nh Trong t p này, s v bi u ñ ñư ng cong sinh trư ng c a m t lo i vi khu n nhi t ñ khác ñ ñưa kho ng nhi t đ thích h p c a lồi 3.1 V t li u Bình nón ch a d ch dinh dư ng + NaCl 1,5% ng nghi m ño quang ph Pipet ml, 10ml vơ trùng Máy đo quang ph 3.2 D ch nuôi c y Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………95 Vibrio natriegenes 3.3 Th t c ti n hành - Cho ml d ch dinh dư ng vơ trùng vào ng đo quang ph ng ñ i ch ng ñ chu n hố máy đo - Nhi m 10ml vi khu n Vibrio vào m t bình nón ch a d ch dinh dư ng - Xoay bình đ tr n l n dung d ch Chuy n ml t bình vào ng ño quang ph th 2, ño s h p ph (Abs.) máy quang ph - Ghi l i k t qu ño ñư c - ð bình nón nhi t đ mong mu n - Ghi l i s h p ph sau m i 10 phút cho ñ n 60 90 phút L y bình kh i ch u nư c cho th i gian t i thi u có th ñ l y m u Khi l y m u, dùng pipet vô trùng hút ml cho vào ng ño quang ph th - V ñ th t s li u thu đư c đ có đư ng cong sinh trư ng c a VSV theo nhi t ñ * Câu h i ôn t p: Bài s 18 Trình bày thuy t sinh trư ng phát tri n c a VSV? Tính tốn k t qu thí nghi m theo sinh kh i VSV ñi u ki n c n ñ c a t ng thí nghi m? Bài s 19 THĂM QUAN KI N T P MÔN H C M c đích u c u: + Nh m trang thi t b ki n th c th c t cho sinh viên v ng d ng công ngh VSV nông nghi p x lý ô nhi m môi trư ng + Yêu c u sinh viên tham gia ñ y ñ bu i h c ngo i khóa theo chương trình mơn h c + Sau h c xong sinh viên ph i vi t ti u lu n v h c ngo i khóa ð a m h c ngo i khóa: + Các phịng thí nghi m VSV hi n ñ i chuyên ph c v gi ng d y & nghiên c u v lĩnh v c nông nghi p + Các lo i ch ph m, phân VSV ñang ñư c s n xu t áp d ng nông nghi p + Trung tâm VSV ng d ng Trư ng ð i h c Khoa h c t nhiên + Phòng nghiên c u VSV nông nghi p Trư ng ð i h c Nông nghi p I Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………96 + Vi n Sinh h c Vi n khoa h c Vi t Nam + Nhà máy (phân xư ng) phân h u vi sinh v t (Sông Gianh t nh Ngh An, Ti n Nơng t nh Thanh Hóa, Văn ði n Hà N i, Vi t Trì t nh Phú Th …và t nh toàn qu c) + Vi n chăn nuôi thú y, xư ng s n xu t th c ăn gia súc, gia c m, thu c thú y t nh + Các trang tr i, công ty nuôi tr ng thu , h i s n toàn qu c + Xí nghi p x lý ph th i th thành ph t nh N i dung: + Xem cách thi t k phòng nghiên c u ng d ng vi sinh v t + Quan sát tìm hi u quy trình s n xu t ho c x lý ô nhi m môi trư ng s ng d ng công ngh vi sinh v t + Ti n hành l y m u ñ ki m tra ch t lư ng s n ph m ch ph m VSV Bài s 19 THĂM QUAN KI N T P MƠN H C * Câu h i ơn t p: Vi t thu ho ch ñ t ki n t p t i s thăm quan, ki n t p? Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………97 PH L C B NG 1: PHA DUNG D CH ð M SORENSEN I VÀ DUNG D CH Na2HPO4 1/15M VÀ KH2PO4 1/15M - S LƯ NG DUNG D CH (Ml) pH KH2PO4 1/15 M 4,53 Na2HPO4 1/15 M 0,00 4,48 0,10 9,90 5,29 0,25 9,75 5,59 0,50 9,50 5,91 1,00 9,00 6,24 2,00 8,00 6,47 3,00 7,00 6,64 4,00 6,00 6,81 5,00 5,00 6,98 6,00 4,00 7,17 7,00 3,00 7,38 8,00 2,00 7,73 9,00 1,00 8,04 8,34 9,50 0,50 9,75 0,25 8,67 9,90 0,10 9,18 10,00 0,00 10,00 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………98 B NG 2: TÍNH S Ch s 000 001 002 003 010 011 012 013 020 021 022 030 031 040 041 100 101 102 103 110 111 112 113 120 121 122 123 130 131 LƯ NG VI SINH V T THEO MAC.CRADY S lư ng VSV có xác su t l n nh t c y l p l i ng nghi m 0,0 0,0 0,0 0,0 0,5 0,3 0,2 0,2 0,5 0,4 0,7 0,5 0,3 0,2 0,2 0,9 0,6 0,5 0,4 0,7 0,6 0,9 0,9 0,6 0,5 0,4 0,7 0,6 0,9 0,7 0,6 0,9 0,9 1,2 0,6 0,4 0,3 0,2 1,2 0,7 0,5 0,4 1,1 0,8 0,6 1,0 0,8 1,3 0,7 0,5 0,4 2,0 1,1 0,8 0,8 1,0 0,8 0,5 2,0 1,1 0,8 0,6 3,0 1,5 1,1 0,3 1,3 1,1 1,6 1,6 1,1 0,8 1,4 1,0 Ch s 132 140 141 200 201 202 203 210 211 212 213 220 221 222 223 230 231 232 240 241 300 301 302 303 310 311 312 313 320 S lư ng VSV có xác su t l n nh t c y l p l i ng nghi m 1,6 1,4 1,1 1,7 2,5 0,9 0,6 0,5 5,0 1,4 0,9 0,7 2,0 1,2 0,9 1,6 1,2 6,0 1,5 0,9 0,7 13,0 2,0 1,3 0,9 20,0 3,0 1,6 1,2 2,0 25,0 2,0 1,3 0,9 17,0 3,0 1,6 1,2 110,0 3,5 2,0 1,4 4,5 3,0 1,7 1,2 3,5 2,0 1,4 4,0 2,0 1,4 3,0 2,5 1,1 0,8 4,0 1,6 1,1 6,5 2,0 1,4 2,5 4,5 1,6 1,1 7,5 2,0 1,4 11,5 3,0 1,7 16,0 3,5 2,0 9,5 2,0 1,4 Trư ng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………99 B NG 2B: TÍNH S Ch s 321 322 330 331 332 333 340 341 350 400 401 402 403 410 411 412 413 414 420 421 422 423 424 430 431 432 433 434 440 441 450 LƯ NG VI SINH V T THEO MAC.CRADY S lư ng VSV có xác su t l n nh t c y l p l i ng nghi m 15,0 3,0 1,7 20,0 3,5 2,0 25,0 3,0 1,7 45,0 3,5 2,0 110,0 4,0 140,0 5,0 3,5 2,0 4,5 2,5 2,5 2,5 1,3 3,5 1,7 5,0 2,0 7,0 2,5 3,5 1,7 5,5 2,0 8,0 2,5 11,0 11,0 6,0 2,0 9,5 2,5 13,0 3,0 17,0 20,0 11,5 2,5 16,5 3,0 20,0 4,0 30,0 35,0 25,0 3,5 40,0 4,0 1,4 Ch s 451 500 501 502 503 504 510 511 512 513 520 521 522 523 524 525 530 531 532 533 534 535 540 541 542 543 544 545 550 551 555 S lư ng VSV có xác su t l n nh t c y l p l i ng nghi m 5,0 2,5 3,0 4,0 6,0 7,5 3,5 4,5 6,0 8,5 5,0 7,0 9,5 12,0 15,0 17,5 8,0 11,0 14,0 17,0 20,0 25,0 13,0 17,0 25,0 30,0 35,0 45,0 25,0 35,0 180,0 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành ……………100 TÀI LI U THAM KH O Nguy n Lân Dũng c ng s S tay nghiên c u vi sinh v t, t p I,II,II NXB GD 1978.1979 Nguy n Lân Dũng c ng s Th c hành vi sinh v t NXB GD 1992 Nguy n Lân Dũng Th c t p vi sinh v t (d ch gi t ti ng Nga) NXB GD 1983 Nguy n ðư ng c ng s Th c t p vi sinh v t tr ng tr t NXB.NN 1982 Nguy n ðư ng c ng s Th c t p vi sinh v t NXB.NN 1989 Nguy n Xuân Thành c ng s Th c t p vi sinh v t ñ i cương NXB.NN 1994 Nguy n Xuân Thành c ng s Giáo trình vi sinh v t h c nơng nghi p NXB GD 2004 Nguy n Xuân Thành c ng s Th c t p vi sinh v t ñ i cương NXB.NN 2006 101 ... lưu huỳnh 67 Bài s 17: Xác ñ nh sinh kh i vi sinh v t ñ t 75 Bài s 18: Sinh trư ng c a vi sinh v t 83 Bài s 19: Thăm quan ki n t p v vi sinh v t 86 Ph l c 88 Tài li u tham kh o 91 Trư ng ð i... thi t nghiên c u vi sinh v t Bài s 2: Phương pháp c ñ nh tiêu b n nhu m t bào vi sinh v t 12 Bài s 3: Chu n b d ng c môi trư ng nuôi c y vi sinh v t 16 Bài s 4: Nuôi c y vi sinh v t 26 Bài s... u vi sinh v t t canh trùng đ c (mơi trư ng th ch): dùng que c y b ch kim l y m t vi sinh v t m t khu n l c, (không nên l y nhi u vi sinh v t ph t dày s khó xem khó phân bi t hình thái c a vi sinh