Mng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 1 M U  m sinh vt, vt cht sc cu to t i phân t sinh hc, ng nht là  quan trng trong s  và truyt thông tin di truyn cho th h a, các thông tin này s c biu hi thông qua s to thành các phân t protein.        ng hp protein luôn xut hin nhiu bin gc ca s ting ca sinh gii. Vì vy vic tìm hiu, phân tích các phân t DNA, RNA là rt cn thit. Khi hiu rõ cm ci phân t này, chúng ta có th kt hp vi s phát trin các k thut, các công ngh hi tin hành lai to, chn ging mi, sn xut các hp cht th cp dùng trong y hc, sn xut các ch Có rt nhiu k thuc ng dng trong công ngh sinh hc  nghiên cu vt cht sn di là mt k thut rt hu ích s dng nhm phân tích, nh và tinh sn DNA bng cách da vào s dch chuyn ca chúng ng. Mng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 2 NI DUNG I. NGUYÊN TC CHUNG n di là hing dch chuyn ca các phân t ng cng, hay nói cách khác là k thut phân chia các phân t DNA, RNA, protein dm vn tích thc ca chúng. Khi các phân t    t trong m  ng, chúng s dch chuyn v các cc (+) hoc (-n tích cn tích thc hoc c âm, còn các nucleic acid có mi nh khung phosphate ca mình và vì th ch dch chuyn c              polyacrylamide gel. Tuy nhiên               -20 kb. N DI AGAROSE GEL Agarose có khng phân t xp x 120.000 Da, là mt trong hai thành phn chính ca agar chim khong 70%, phn kia là agaropectin chim khong 30%. Agarose là mt polymer mch thng không b sulphate hóa cha hai gc xen k nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose.                 o C   ge-45 o   Mng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 3       1. Nguyên tc                                                         . T dch chuyn ca các phân t trong gel ph thu   c, cu hình phân t, n  gel, l   n di i  nh và tinh sn DNA  :                 (EtBr)     n d. 2. Các yu t ng 2.1.  Các phân t c càng ln (khng phân t ln) thì t dch chuyn càng chm.    10       . Mng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 4 2.                      2.2.                                      . 1.   (%) trong gel     (kb)            0,3 60-5 0,6 20-1 0,7 10-0,8 0,9 7-0,5 1,2 6-0,4 1,5 4-0,2 2,0 3-0,1 0,5% 0,9% 1,2% 1,4% 0,7% 5 4 3 2 Log 10 của các cặp nucleotide đệm: 0,5 x TBE – 0,5 μg/mL EtBr điện di: 1 V/cm trong 16 giờ 1 2 3 4 5 6 Mng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 5 3. n di các mu DNA ging nhau  các n agarose khác nhau. A: 1%, B: 1,5% và C: 2%. Theo hình trên, s    2.3.            ,  ng                 . DNA ca các plasmid mch vòng dch chuya plasmid cùng long mch thng. Hình 4. Kt qu n di vi plasmid mch vòng bên trái và plasmid cùng loi mch thng  bên phi. 1 2 1 2 1 2 A B C DNA mạch vòng DNA mạch thẳng Dạng vòng đứt Dạng vòng đóng Mng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 6 2.4.                           . Trong agarose gel,   ng t 4 o C n 30 o C. ,               . n di 3.1. Thit b n di    p:     Mng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 7   3.2.   pH Mt s  n di DNA thích hp là Tris-acetate-EDTA (TAE), Tris- borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE)  50    pH 7,5-7,8.       ,        .                     . Cán DNA s dch chuyn vi các t m trên. m giúp thit lp mt giá tr pH, cung c h tr  dn.         1 lít) Tris-acetate- EDTA(TAE) 40 mM Tris 20 mM acetic acid 1 mM EDTA (50) 242 g Tris base 57,1 mL glacial acetic acid 100 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0) Tris-borate- EDTA (TBE) 89 mM Tris 89 mM boric acid 2 mM EDTA (10) 108 g Tris base 55 g boric acid 40 mL EDTA 0,5 M (pH 8,0) Tris-phosphate- EDTA (TPE) 80 mM Tris- phosphate 2 mM EDTA (10) 108 g Tris base 15,5 mL H 3 PO 4 85% 40 mL EDTA 3.3.      3.3.1. Chuẩn bị agarose gel  ,         -II-       (low-endo- osmotic).             ,                   . Tuy nhiên, type-II-       i sulphate polysaccharides (SP),          ,    . ,       . Mng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 8 Cách tiến hành: Cho 1% type-II-   100    0,5   trong ni kh        .     100 mL.        60 o                 .      5      . Sau 30-40 , k    ,     . 3.3.2. Đt mu DNA vo giếng    .         : DNA (1 g/1 µL ) : 1 L     (10 loading dye):1 L c 2 : 9 L Tng s : 11 L 11     .               0,5        gel,       . ng dùng micropipette loi 20-200 L         n th cn di, n DNA lng dch chuyn nh. DNA dch          .                . 3.3.3. Nhuô ̣ m DNA bằng EtBr                   . Sau k             0,5 g/mL,   30-45 ,  trên m    (  10 /).            ,   15-20 . EtBr             5 mg/     4 o .               . Tuy nhiên,  (affinity)                Mng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 9    . Sau khi nhum, EtBr s xen vào gia các base ca nucleic acid và cho phép phát hin d dàng chúng  trong gel.   (0,5 g/mL)      phn ng nhum xy ra trong sun di.                 (15%),                                   . Tuy nhiên,                    .           2   (0,5 g/mL)/45 . Hình 6 minh hn di agarose gel 3.3.4. Quan sa ́ t va ̀ chu ̣ p a ̉ nh  ( = 302 nm).             hình nh DNA (Gel Documentation System). a. Khuôn đổ gel Dung dịch agarose gel Băng dính Lược Giếng b. Gắn lược và đổ agarose gel vào khuôn c. Lấy lược ra khỏi khuôn gel Micropipette Nguồn điện di Cable Đệm điện di Nắp Buồng điện di d. Nạp mẫu DNA vào giếng e. Chạy điện di Vị trí gắn lược Mng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 10 (a) (b) i ánh sáng t ngoi (a) và hình n di DNA trên agarose gel (b) 3.4. Mt s      a) Dùng agarose có nhi nóng chy thp Mu agarose gel có nhi nóng chy thp chc ct ra khi bm vi t l 1:1, b sung mun n 0,5 M, c nóng chy  70 o  m. Dung dch gel có DNA c chit bng phenol/chloroform và kt t    c tách chit bng p cho mc thao tác tip theo, do s hin din ca các nhân t c ch trong agarose. Agarose gel có nhit  nóng chy thp Ct n DNA quan tâm n DNA quan tâm m vi t l 1:1 Chit bng phenol/chloroform và kt ta B sung mun n 0,5M Dung dch gel có DNA 70 o C Hình 8.  tóm tt quá trình thu hi DNA quan tâm bng cách dùng agarose có nhi nóng chy thp [...]... LUẬN Phương pháp điện di giúp nhận biết, phân tích và tinh sạch DNA Nhờ phương pháp này mà người ta ứng dụng để phân tích giải trình tự DNA, ứng dụng trong các nghiên cứu về DNA rất hiệu quả Có nhiều loại khuôn đỡ được áp dụng cho kỹ thuật này Nhưng mỗi loại phân tử khác nhau sẽ phù hợp đối với loại khuôn đỡ khác nhau Điện di agarose gel là phương pháp tối ưu nhất đối với DNA còn polyacrylamide gel điện. .. được điện di nhanh trở lại để chuyển DNA từ gel vào trong dung dịch glycerol (quá trình điện di 11 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com có thể được kiểm soát bằng UV) Dung dịch glycerol-DNA sau đó được chiết bằng pipette * Cách 2: sau khi điện di, một khe nhỏ được cắt trong gel ngay phía trước băng DNA quan tâm và đặt trong khe một mẫu giấy loại NA-45 Gel sau đó được điện. .. DNA bằ ng phương pháp này nế u hàm lươ ̣ng của nó thấ p hơn 10 ng 2.2.2 Nhuộm bằng thuốc nhuộm bạc: Thuốc nhuộm bạc sử dụng hiệu quả để phát hiện cho phép phát hiện một lượng protein ở dạng vết trong polyacrylamide gel và một lượng nhỏ nucleic acid (pg), nhạy gấp 1.000-10.000 lần phương pháp nhuộm bằng EtBr Hai phương pháp nhuộm bạc thường được sử dụng là: 1) Dùng các dung dịch diamine silver... kích thước và điện tích của DNA Bảng 2 Hiêu quả của sự phân tách DNA trong ̣ polyacrylamide gel không biế n tính Acrylamide (% w/v) Hiêu quả phân tích ̣ (nucleotide) 3,5 1.000-2.000 5,0 80-500 8,0 60-400 12,0 40-200 15,0 25-150 20,0 6-100 Hình 15 Cấu trúc thiết bị điện di polyacrylamide gel 16 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 2.1 Phương pháp điện di polyacrylamide... Trô ̣n các mẫu DNA với m ột lươ ̣ng thich hơ ̣p của đê ̣m 6 gel-loading dye ́ Đặt mẫu vào trong giếng bằng micropipette hoặc Hamilton syringe h) Nố i buồ ng điê ̣n di với bô ̣ nguồ n Polyacrylamide gel không biế n tính thường chạy điện di trong khoảng 1 V/cm đế n 8 V/cm Chạy gel cho đến khi thuốc nhuô ̣m chỉ thi ̣dich chuyể n đế n vi ̣trí mong muố n Tắ t nguồ n, lấ y khuôn gel... điện di agarose gel Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…) Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc in dấu di truyền…) Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern, hoặc RNA trước khi thẩm tích Northern 5 Ưu điểm và nhược điểm * Ưu điểm của phương pháp. .. 2) Thấm dung dịch silver nitrate vào gel trong môi trường acid yếu và dùng formaldehyde khử có chọn lọc các ion bạc thành bạc kim loại dưới điều kiện kiềm Phương pháp diamine kiềm kém nhạy hơn nhưng thích hợp đối với các gel dày, trong khi phương pháp acid nhanh và bắt màu tốt hơn đối với các gel mỏng Quá trình nhuộm bao gồm các bước sau: - Cố định nucleic acid trong acetic acid 7,5% tối thiểu 5 phút... của 3 M sodium acetate và kết tủa DNA - Rửa cẩ n thâ ̣n tiể u thể với ethanol 70% và hòa tan trở lại DNA trong đê ̣m TE (pH 7,6) tới thể tich cuố i cùng là 10 L ́ - Kiể m tra số lươ ̣ng và chấ t lươ ̣ng của đoa ̣n DNA bằ ng điê ̣n di polyacrylamide gel Lấ y mô ̣t th ể tích nhỏ tối thiểu trô ̣n với 10 L TE (pH 7,6), bổ sung thêm 2 L gel-loading dye Nạp mẫu và chạy điện di polyacrylamide... agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định II ĐIỆN DI POLYACRYLAMIDE GEL Acrylamide là một monomer có cấu trúc như sau: CH2 = CH C NH2 O Khi có mặt các gốc tự do, được cung cấp bởi ammonium persulphate và ổn định bởi TEMED (N, N, N', N'-tetramethylathylene-diamine), phản ứng chuỗi 13 Mạc Văn Trọng trong.biotech@gmail.com... sẽ phù hợp đối với loại khuôn đỡ khác nhau Điện di agarose gel là phương pháp tối ưu nhất đối với DNA còn polyacrylamide gel điện di được cả nucleic acid và protein Nói chung mỗi phương pháp đều có những ưu và nhược điểm riêng, tùy vào từng trường hợp để tiến hành điện di theo cách nào là tốt nhất 23 . khuôn gel Micropipette Nguồn điện di Cable Đệm điện di Nắp Buồng điện di d. Nạp mẫu DNA vào giếng e. Chạy điện di Vị trí gắn lược Mng. điện di: 1 V/cm trong 16 giờ 1 2 3 4 5 6 Mng trong.biotech@gmail.com or macvantrong@vabiotechvn.com 5 3. n di