Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THUỲ NGÂN TÌM HIỂU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC Ở TÔM SÚ (P.monodon) BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV – Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THUỲ NGÂN TÌM HIỂU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC Ở TÔM SÚ (P.monodon) BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV – Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths. BÙI THỊ BÍCH HẰNG 2008 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu MỤC LỤC Lời cảm tạ i Tóm tắt ii Danh sách hình iii Danh mục từ viết tắt iii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1 Sơ lược nghề nuôi tôm trên thế giới, ở Việt Nam 3 2.2 Tác nhân gây bệnh IHHNV 4 2.2.1 Đặc điểm của tác nhân gây bệnh IHHNV 4 2.2.2 Dấu hiệu bệnh lý 5 2.2.3 Phân bố và lan truyền bệnh 5 2.2.4 Chẩn đoán bệnh 6 2.2.5 Thiệt hại do IHHNV gây ra 6 2.2.6 Những nghiên cứu về bệnh 6 2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh 7 2. 3. 1 Phương pháp PCR 7 2.3.2 Phương pháp mô học 8 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 11 3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 11 3.2.1 Chẩn đoán bệnh IHHNV bằng kỹ thuật PCR theo bộ kit IQ 2000 TM 11 3.2.2 Kỹ thuật mô học 14 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 4.1 Kết quả xét nghiệm PCR 17 4.2 Kết quả mô học 17 4.2.1 Những biến đổi mô học lớp biểu mô dưới vỏ tôm sú nhiễm IHHNV. 17 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 4.2.2 Những biến đổi mô học ở mang tôm sú nhiễm IHHNV .17 4.2.3 Những biến đổi mô học ở mô liên kết gan tuỵ tôm sú nhiễm IHHNV 19 4.2.4 Những biến đổi mô học ở tuyến râu tôm sú nhiễm IHHNV 20 4.2.5 Những biến đổi mô học ở cơ tôm sú nhiễm IHHNV 21 4.2.6 Những biến đổi mô học ở cơ quan tạo máu tôm sú nhiễm IHHNV 21 Chương 5: KẾT LUẬN & ĐỀ XUẤT 23 5.1 Kết luận 23 5.2 Đề xuất 23 Tài Liệu Tham Khảo. 24 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu i LỜI CẢM TẠ Xin trân trọng cảm tạ cô Bùi Thị Bích Hằng giáo viên hướng dẫn thực hiện đề tài đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Xin trân trọng cảm tạ quí thầy cô phụ trách phong thí nghiệm cùng cán bộ phụ trách thư viện khoa Thuỷ Sản đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này. Có được kết quả ngày hôm nay tôi xin chân thành cảm ơn tất cả quí thầy cô của trường, khoa thuỷ sản đã giáo dục, truyền đạt các kiến thức cần thiết ngay từ những ngày đầu bước chân đến giảng đường. Cảm ơn tập thể lớp Bệnh Học Thuỷ Sản- K30 đã giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báo trong suốt khoảng thời gian thực hiện đề tài. Và cuối cùng xin chân thành cảm tạ cha mẹ tôi, gia đình tôi đã hết lòng nuôi dưỡng, thương yêu, bảo bọc và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể lớn lên, được giáo dục và có được thành quả như ngày hôm nay. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu ii TÓM TẮT Để tìm hiểu đặc điểm mô bệnh học bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV) trên tôm sú giống, trước tiên ứng dụng kỹ thuật PCR (dùng bộ kit IQ 2000 TM ) xét nghiệm 66 mẫu được15 mẫu dương tính. Sau đó, tiến hành làm tiêu bản mô học trên mẫu đã xét nghiệm bằng phương pháp truyền thống (Lightner, 1996). Quá trình thực hiện từ tháng 01/ 2008 đến tháng 05/ 2008 tại khoa thuỷ sản trường Đại Học Cần Thơ. Kết quả quan sát trên tiêu bản mô học cho thấy khi tôm bị bệnh IHHNV biểu hiện dưới mức độ vi thể là thể vùi IHHNV trong nhân phì đại của các tế bào biểu mô dưới vỏ, mang, cơ quan tạo máu, tuyến râu, cơ, mô liên kết gan tuỵ cũng như hiện tượng hoại tử làm mất cấu trúc bình thường trên các cơ quan này. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu iii DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR 13 Hình 4.1: Lớp biểu mô dưới vỏ tôm nhiễm IHHNV 17 Hình 4.2: Cấu tạo vi thể của mang bị nhiễm IHHNV 18 Hình 4.3: Thể vùi Cowdry loại A trên mô liên kết gan tuỵ và sự hoại tử với nhiều khoảng trống 19 Hình 4.4: Tuyến râu tôm sú nhiễm IHHNV 20 Hình 4.5: (A) Cơ tôm sú bình thường; (B) Cơ tôm sú bị bệnh. 21 Hình 4.6: Mô tạo máu nhiễm IHHNV 22 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT bp = Base pair ĐBSCL = Đồng Bằng Sông Cửu Long IHHNV = Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus NTTS = Nuôi Trồng Thuỷ Sản TS = Thủy Sản ORF = Open Reading Frame PCR = Polymerase Chain Reaction µl = Micro lít nm = Nano mét ADN = Acid Deoxyribonucleotide % = Phần trăm WSSV = White spot syndrome virus YHV = Yellow head virus Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU Việt Nam có truyền thống lâu đời trong các hoạt động khai thác và NTTS (Nuôi Trồng Thuỷ Sản). Ngành thuỷ sản đóng góp hơn 3% GDP trong hơn mười năm qua và được xem là một trong những ngành có bước trưởng thành nhanh chóng nhất trong thập kỷ vừa rồi. Tháng 12/ 1999 Chính phủ đã thông qua chương trình phát triển NTTS Việt Nam giai đoạn 2000- 2010, trong đó chỉ ra rằng đến năm 2010 tổng sản lượng NTTS phải đạt 2 triệu tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 2,5 tỷ đô la (Tạp chí TS, số 6, 2007). Riêng sản lượng tôm nuôi năm 2004 theo Bob Rosenberry, Việt Nam đứng thứ hai trên thế giới (350.000 tấn) vượt cả Thái Lan (300.000 tấn). Thu nhập ngoại tệ từ NTTS tăng lên hàng năm và chỉ riêng tôm đã mang lại ước tính gần một tỷ USD. Thật vậy, hiện nay tôm sú (Penaues monodon) là đối tượng thuỷ sản có giá trị thương phẩm cao và cũng là đối tượng nuôi quan trọng của một số nước đang phát triển ở Châu Á. Tuy nhiên khi nuôi thuỷ sản phát triển theo hướng năng suất cao thì luôn đi kèm theo sự phát triển của dịch bệnh và đó luôn là một trong những khó khăn của NTTS. Ở Việt Nam, dịch bệnh trong NTTS trong vài năm qua đã cho thấy đây là một trong những yếu tố giới hạn rất quan trọng mà cần phải có các giải pháp khắc phục nhằm đưa nghề nuôi thuỷ sản phát triển theo hướng bền vững. Bệnh đốm trắng và bệnh đầu vàng trong nuôi tôm sú hay bệnh mủ gan và ký sinh trùng trên cá da trơn là những bệnh nguy hiểm và gây tác hại nghiêm trọng cho nghề nuôi. Trong đó, tôm sú nhiễm virus gây bệnh đốm trắng có tỷ lệ chết rất cao (> 80%) mà chưa có thuốc trị hiệu quả (Tạp chí TS, số 6, 2007). Trong khi đó thì IHHNV (Infectiuos Hypodermal and Haematopoietic necrosis) là tác nhân nguy hiểm nhất ở tôm P. stylirostris và P. vannamei (Kalagayan et al., 1991). IHHNV là virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cow quan lập biểu mô ở tôm Penaeid, lần đầu tiên phát hiện vào năm 1981 ở Hawai khi gây chết hàng loạt tôm P. stylirostris (Lightner et al., 1983). Theo Carpenter & Brock (1992) IHHNV gây thiệt hại nặng nề về mặt kinh tế vì gây chết 90% tôm P. stylirostris sau hai mươi ngày thả nuôi. Tuy virus này không gây chết cho tôm sú nhưng lại là một trong những tác nhân gây chậm lớn, dị hình (Flegel, 1997). Mặc khác các đợt dịch bệnh do IHHNV gây ra có thể xảy ra bất cứ mùa nào trong năm và tôm giống là rủi ro nhất. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật thì các phương pháp chẩn đoán bệnh trong thuỷ sản cũng ngày càng tiến bộ. Trước tiên phải kể đến PCR (Polymerase Chain Reaction), đây là kỹ thuật khuếch đại trình tự ADN Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2 một cách nhanh nhất, được phát minh và đặt tên bởi Mullis & ctv vào năm 1985. Bên cạnh đó phương pháp mô bệnh học là một phương pháp góp phần quan trọng vào việc chẩn đoán bệnh thuỷ sản, đặc biệt là bệnh tôm. Mô bệnh học không chỉ mô tả các tổn thương ở các mô và tế bào ở mức độ vi thể mà còn so sánh đối chiếu các tổn thương đó với những biểu hiện lâm sàng của cá, tôm, nhuyễn thể (Lightner and Bell, 1988). Để ứng dụng mô bệnh học vào việc chẩn đoán tác nhân gây bệnh IHHNV trên tôm sú cũng như tìm hiểu về đặc điểm mô học của virus này đề tài ”Tìm hiểu đặc điểm mô bệnh học ở tôm sú bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV)” được thực hiện. Mục tiêu: Mô tả đặc điểm mô bệnh học ở tôm sú nhiễm IHHNV ở Việt Nam. Nội dung: Xét nghiệm IHHNV trên tôm sú giống bằng PCR nhằm tìm ra mẫu bị bệnh. Tiến hành làm tiêu bản mô học trên mẫu dương tính với IHHNV. Quan sát đặc điểm mô bệnh học ở tôm nhiễm IHHNV. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 3 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược nghề nuôi tôm trên thế giới, ở Việt Nam Trên thế giới: Các quốc gia tham gia sản xuất tôm khu vực Châu Á hiện nay như Thái Lan đã cơ bản giải quyết được các vấn đề về kỹ thuật, công nghệ nuôi tôm. Ấn Độ cũng đang có nhiều cố gắng để cải tiến các biện pháp khoa học công nghệ. Ở các quốc gia này nhiều biện pháp kỹ thuật tiên tiến đã được áp dụng vào sản xuất tôm giống có chất lượng cao như: sàng lọc tôm bố mẹ sạch bệnh bằng phương pháp kiểm tra PCR, hạn chế sử dụng thuốc kháng sinh, tăng cường sử dụng các chế phẩm sinh học, áp dụng các phương pháp kiểm dịch vệ sinh nghiêm ngặt, … Ấn Độ và Thái Lan đã thành lập các ngân hàng tôm bố mẹ có khả năng kháng bệnh và đang nghiên cứu phát triển đàn tôm bố mẹ thông qua phương pháp thuần hoá, … Tóm lại đẩy mạnh phát triển khoa học công nghệ nhằm nâng cao tính bền vững của nuôi tôm là ưu tiên hàng đầu của người sản xuất và các quốc gia xuất khẩu tôm (Nguyễn Thị Ngọc, 2007). Song song với việc tăng số lượng tôm thì bệnh tôm cũng ngày càng phát triển nhiều và xuất hiện nhiều bệnh lạ chưa có giải pháp điều trị. Theo Bùi Quang Tề (2006) thì có gần 30 bệnh và hội chứng của tôm nuôi với một số tác nhân gây bệnh quan trọng như virus, vi khuẩn, nấm và nguyên sinh động vật. Hiện nay chưa có phương pháp nào điều trị bệnh virus thành công ở tôm. Ở Việt Nam Nghề nuôi tôm ở Việt Nam thực sự phát triển vào năm 1987 và nuôi tôm thương phẩm phát triển vào những năm đầu thập kỷ 90 của thế kỷ trước. Đến giữa thập kỷ 90 (1994 – 1995) phát triển nuôi tôm ở Việt Nam có phần chững lại do gặp phải nạn dịch bệnh tôm. Trong các năm 1996 – 1999 dịch bệnh có giảm nhưng vẫn tiếp tục gây thiệt hại cho người nuôi (Phạm Văn Công, 2007). Năm 2000 được xem là năm đánh dấu sự bùng nổ của nghề nuôi tôm thương phẩm khi chính phủ ban hành nghị quyết 09 cho phép chuyển đổi một phần diện tích trồng lúa, làm muối năng suất thấp, đất hoang hoá sang NTTS (Tạp Chí Thuỷ Sản, số 6, 2007) Theo Hanafi & T. Ahmad (1999) (trích dẫn từ Lê Khanh (2006)) thì diện tích nuôi tôm ở Việt Nam tăng từ 250.000 ha năm 2.000 sang 478.000 ha năm 2001 và 540.000 ha năm 2003, cho đến nay diện tích nuôi tôm vẫn tiếp tục [...]... sự hoại tử hoá lỏng ở phần cơ đốt bụng Tuy nhiên không tìm thấy bất cứ thể vùi nào ở phần cơ 4.2.6 Những biến đổi mô học ở cơ quan tạo máu tôm sú nhiễm IHHNV 20 Mô tạo máu là cơ quan tạo những tế bào máu mới, đóng vai trò quan trọng trong việc tuần hoàn, phục hồi vết thương, đông máu, thực bào và kết nang của vật chất sống (Fontaine & Lightner, 1973) Mô tạo máu cũng là cơ quan mà IHHNV sẽ tấn công và. .. Cowdry loại A ở tuyến râu Đặc điểm thể vùi này tương tự như đặc điểm thể vùi ở tôm sú P monodon mà chúng tôi quan sát được 4.2.5 Những biến đổi mô học ở cơ tôm sú nhiễm IHHNV Quan sát trên tiêu bản mô học ở mặt cắt dọc ta thấy những sợi cơ, ở mặt cắt ngang là những bó cơ Nhân tế bào cơ bắt màu tím của hematoxylin & eosin còn sợi cơ hay bó cơ bắt màu hồng Chức năng của cơ là bảo vệ phần nội quan bên trong... có mô tả thể vùi Cowdry loại A ở nhiều cơ quan (lớp biểu mô dưới vỏ, mô tạo máu, mang, mô liên kết gan tụy, …) nhưng ít khi thấy thể vùi xuất hiện ở cơ tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu A B Hình 4.5: (A) Cơ tôm sú bình thường; (B) Cơ tôm sú bị bệnh, mũi tên chỉ thể vùi IHHNV Mặt khác, trong nghiên cứu về IHHNV trên tôm càng xanh, Hsieh và ctv (2006) đã ghi lại biến đổi trên cơ. .. được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR trên gel agarose và đọc kết quả dưới bàn đọc UV 2.3.2 Phương pháp mô học: Các định nghĩa về mô bệnh học: Trung Mô học là môn khoa học nghiên cứu các tổn thương ở các mô và tế bào Nghĩa là mô tả đầy đủ mọi chi tiết của tổn thương liệu học vi thể Mô bệnh học tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài đó ở mức độ tập và nghiên... bệnh có biểu hiện giống nhau Một số ứng dụng cuả mô bệnh học: Young (1959) và Johnson (1980) đã ứng dụng giải phẩu học và mô học trong việc hệ thống bệnh thường gặp trong nuôi tôm ở Châu Mỹ, Châu Á (Lightner et al, 1992) Thời gian sau, Wang và ctv (1997) chứng minh sự hiện diện của vi rút đốm trắng trên tôm sú, tôm thẻ và tôm he Nhật Bản bằng việc quan sát tiêu bản mô học dưới kính hiển vi quang học. .. trên tôm lai P esculentus x P.monodon ở Úc thì Owens & ctv (1992) cũng đã tìm thấy thể vùi Cowdry loại A ở lớp biểu mô dưới vỏ Thể vùi ưa eosin làm nhân phình to, nằm ở trung tâm nhân Ngoài ra ông còn tìm thấy thể vùi ở những cơ quan: mang, lớp biểu mô dưới vỏ, tuyến râu, tuyến sinh dục, tim, tổ chức limpho, mô tạo máu, hệ thần kinh, cơ 4.2.2 Những biến đổi mô học ở mang tôm sú nhiễm IHHNV Cơ quan. .. tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Hình 4.6: Mô tạo máu nhiễm IHHNV Mũi tên vàng chỉ tế bào mô tạo máu với thể vùi IHHNV.Mũi tên xanh chỉ tế bào mô tạo máu bình thường (E100) 21 Chương 5: KẾT LUẬN & ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Khi tôm sú (P monodon) bị bệnh IHHNV sự biểu hiện dưới mức độ vi thể là tạo thể vùi IHHNV trong nhân phì đại của các tế bào biểu mô dưới vỏ, mang, cơ quan tạo máu, ... học 4.2.1 Những biến đổi mô học ở lớp biểu mô dưới vỏ tôm sú nhiễm IHHNV Lớp biểu mô dưới vỏ là một trong những cơ quan đích mà IHHNV tấn công Lớp này được cấu tạo bởi nhiều tế bào biểu mô Kết quả quan sát mô học cho thấy hầu hết các mẫu nhiễm IHHNV đều xuất hiện thể vùi Thể vùi IHHNV có dạng tròn, nhân tế bào phình to và bắt màu hồng đậm với eosin Hình 4.1: Lớp biểu mô dưới vỏ tôm nhiễm IHHNV, mũi tên... quang học và điện tử Một năm sau đó, năm 1998, Sudha và ctv bằng phương pháp mô học đã xác định mối quan hệ giữa các loài vi rút gây nhiễm trên các loài tôm biển ở Ấn Độ Trung Ở Việt Nam năm 1999, Nguyễn Văn Hảo nghiên cứu bệnh tôm trên tôm sú nuôi tại Trà Vinh bằng phương pháp mô học và PCR, bằng việc kết hợp hai phương pháp này ông mô tả rất cụ thể các đặc điểm mô học của các tác nhân gây bệnh trên... trắng ở tôm sú Qua đó, tác giả đã mô tả hầu hết đặc điểm các cơ quan trên tôm bình thường và tôm bệnh Cho đến nay, mô bệnh học vẫn luôn đựơc ứng dụng trong nhiều trường hợp để chẩn đoán tác nhân gây bệnh trên cá, tôm, nhuyễn thể nói chung 9 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu: Địa điểm: Phòng thí nghiệm bệnh học thuỷ sản, khoa thuỷ sản, trường Đại Học Cần Thơ . mô bệnh học ở tôm sú bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV)” được thực hiện. Mục tiêu: Mô tả đặc điểm mô bệnh học ở tôm sú nhiễm. liệu học tập và nghiên cứu ii TÓM TẮT Để tìm hiểu đặc điểm mô bệnh học bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV) trên tôm sú giống,