TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN PHẠM MINH TRÚC XÁC ĐỊNH CHỈ TIÊU SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ HUYẾT TƯƠNG TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) BỊ ĐỤC CƠ NUÔI Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Cảm ơn tạo hóa cho làm cha mẹ Cảm ơn cha mẹ sinh con, luôn bên cạnh làm chỗ dựa tinh thần vững để tự tin bước qua khó khăn sống Xin gởi lời cám ơn chân thành đến Đặng Thị Hồng Oanh, Nguyễn Thị Thu Hằng tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành tốt đề tài Cám ơn cô Đặng Thụy Mai Thy, chị Nguyễn Hà Giang, chị Nguyễn Thị Thúy Liễu quý thầy cô, anh chị môn thủy sinh học bệnh thủy sản tận tâm nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Cảm ơn người bạn thân tập thể lớp Bệnh học thủy sản 31 ủng hộ tôi, chia sẻ giúp đỡ suốt thời gian qua Cuối cùng, lần xin cảm ơn tất Chân thành cảm ơn! i PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Đề tài thực nhằm xác định tiêu sinh hóa khả kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm xanh bị bệnh đục nuôi thành phố Cần Thơ Vi khuẩn đề tài chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu huyết tương tôm xanh bị bệnh đục phục hồi từ tủ -80O C môn Sinh học Bệnh thủy sản – Khoa thủy sản – ĐHCT Sau kiểm tra đặc tính sinh lý vài tiêu sinh hóa với kết test kit API 20E định danh nhóm vi khuẩn: Aeromonas gồm 12 chủng có chủng Aeromonas hydrophila; Enterobacter chủng Pantoea chủng Kết kiểm tra kháng sinh đồ 16 chủng vi khuẩn với loại kháng sinh thường dùng nuôi trồng thủy sản nhìn chung nhạy cảm với kháng sinh Cả nhóm vi khuẩn nhạy với Streptomycin, Colistin, Norfloxacin, Flofenicol, Doxycycline Ciprofloxacin Tuy nhiên, khả mẫn cảm vi khuẩn colistin không cao; oxolinic acid nhạy có chủng kháng Riêng amoxyciclin kháng hoàn toàn chiếm 93,75% ii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC Trang PHẦN GIỚI THIỆU PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình dịch bệnh nuôi trồng thủy sản 2.2 Một số bệnh tôm xanh 2.2.1 Bệnh virus 2.2.2 Bệnh vi khuẩn 2.2.3 Bệnh sinh vật bám 2.2.4 Bệnh dinh dưỡng môi trường 2.3 Sơ lược bệnh đục 2.3.1 Dấu hiệu bệnh lý 2.3.2 Tác nhân 2.3.3 Phân bố lan truyền 2.3.4 Các biện pháp phòng bệnh đục vi khuẩn 2.4 Sơ lược vi khuẩn gây bệnh tôm 2.4.1 Đặc điểm vi khuẩn Aeromonas 2.4.2 Đặc điểm vi khuẩn Vibrio 2.4.3 Đặc điểm vi khuẩn Pseudomonas 2.4.4 Đặc điểm cầu khuẩn Lactococcus garvieae 2.5 Các nghiên cứu kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh động vật thủy sản iii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 11 3.2 Nội dung 11 3.3 Vật liệu nghiên cứu 11 3.3.1 Dụng cụ 11 3.3.2 Hóa chất mơi trường 11 3.3.3 Đối tượng nghiên cứu 12 3.4 Phương pháp nghiên cứu 13 3.4.1 Phương pháp xác định tiêu sinh hóa 13 3.4.2 Phương pháp lập kháng sinh đồ 14 PHẦN KẾT QUẢ THẢO LUẬN 16 4.1 Kết định danh vi khuẩn 17 4.2 Kết kháng sinh đồ 22 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 26 5.1 Kết luận 26 5.2 Đề xuất 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 PHỤ LỤC 31 iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Nguồn gốc chủng vi khuẩn nghiên cứu 12 Bảng 3.2: Bảng đọc kết kit API 20E - 14 Bảng 3.3: Bảng đường kính tiêu chuẩn loại thuốc kháng sinh theo NCCLS- National Committee Clinical Laboratory Standard - 15 Bảng 4.1: Các tiêu sinh lý kết sinh hóa kit API Aeromonas - 18 Bảng 4.2: Các tiêu sinh lý kết sinh hóa kit API Enterobacter - 20 Bảng 4.3: Các tiêu sinh lý kết sinh hóa kit API Pantoea - 21 Bảng 4.4 Đường kính vịng vơ trùng vi khuẩn kháng sinh 24 v PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 4.1: Hình nhuộm gram vi khuẩn Aeromonas 17 Hình 4.2: Khả lên men oxi hóa O/F vi khuẩn Aeromonas - 19 Hình 4.3 : Khuẩn lạc Aeromonas môi trường Aeromonas agar 19 Hình 4.4: Tính kháng Aeromonas kiểm tra với O/129 - 19 Hình 4.5: Kết test sinh hóa Aeromonas kit API 20E 19 Hình 4.6: Biểu đồ thể tính kháng vi khuẩn với kháng sinh - 22 Hình 4.7: Tính nhạy Enterobacter kháng sinh 23 vi PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN I GIỚI THIỆU Việt Nam có nhiều tiềm để phát triển ni trồng thuỷ sản khắp miền đất nước nuôi biển, nuôi nước lợ nuôi nước Đến năm 2003, sử dụng 612.778 nước mặn, lợ 254.835 nước để nuôi thuỷ sản Trong đối tượng ni chủ lực tơm với diện tích 580.465 Diện tích ni tơm xanh tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long tăng nhanh năm gần đạt gần 5.000ha, tăng gấp 10 lần so với thời điểm năm trước (Thơng xã Việt Nam) Diện tích ni tôm xanh tập trung lớn tỉnh hai bên bờ sông Tiền sông Hậu An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Bến Tre Thành phố Cần Thơ Năm 2007 diện tích ni thuỷ sản Thành Phố Cần Thơ 15.245 gồm cá ao, cá tra, cá ruộng tôm xanh, tăng 5% so với năm 2006 Tổng sản lượng thu hoạch 175.083 tấn, cá tra đạt 154.564 vượt kế hoạch 14,4%, tôm xanh 268 (Nguyễn Thị Đẹp) Hiện nay, thủy sản nói chung nghề ni tơm nói riêng xanh ln gặp nhiều khó khăn từ môi trường, kinh tế đáng ngại tình hình dịch bệnh đặc biệt đục Bệnh gây nhiều thiệt hại cho người nuôi Tại Thái Lan, đục gây tỉ lệ chết cao từ 30 – 100 % tôm xanh giai đoạn hậu ấu trùng Tại huyện Cờ Đỏ - thành phố Cần Thơ, bệnh gây thiệt hại 10 diện tích ni tơm xanh hao hụt từ 60-70% (2004), 70-100% (2005) Bệnh đục tôm xanh vấn đề trọng quan tâm năm gần Tác nhân bệnh đục hai loại virus MrNV ( Macrobrachium rosenbergii Nodavirus) XSV (Extra small virus) (Hameed et al., 2004) vi khuẩn (Yang et al., 2003) gây nên Xuất phát từ vần đề đề tài “ Xác định tiêu sinh hóa khả kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm xanh bị bệnh đục nuôi thành phố Cần Thơ” thực nhằm mục tiêu tìm hiểu đặc điểm sinh hố khả kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn nhiễm tôm xanh bệnh đục ương nuôi Cần Thơ Đề tài bao gồm hai nội dung: Xác định số tiêu sinh hóa vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm xanh bị bệnh đục Xác định khả kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm xanh bị bệnh đục PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình dịch bệnh ni trồng thủy sản Nghề nuôi trồng thủy phát triển mạnh nước ta nói chung Đồng Bằng Sơng Cửu Long nói riêng thời gian gần làm cho môi trường nuôi ngày xấu đi, bùng phát dịch bệnh xảy ngày nhiều Sự lan truyền dịch bệnh thủy sản dẫn đến hậu nghiêm trọng kinh tế - xã hội, mơi trường thương mại quốc tế khó lường Tại Việt Nam, năm có hàng nghìn hộ dân nuôi luân canh tôm lúa bị thua lỗ tôm bị chết, tổng thiệt hại 4,5 tỉ đồng (Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I,1998) Ở Thái Lan, sản lượng tôm nuôi giảm từ 225.000 xuống 16.000 dịch bệnh đốm trắng (giai đoạn 1995 – 1996) Đã làm thiệt hại 500 triệu USD đến 1997 tình trạng chưa cải thiện (Triệu Thanh Tuấn, 2006) Trong số bệnh động vật thuỷ sản nguyên nhân chủ yếu vi khuẩn gây với vụ dịch bệnh có qui mơ lớn Thơng thường, người ta sử dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát vi khuẩn gây bệnh Do việc sử dụng không cách nhiều loại thuốc kháng sinh nên gây tượng vi khuẩn kháng thuốc tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh thịt thuỷ sản Một nguyên nhân khác gây tượng vi khuẩn kháng thuốc việc sử dụng loại kháng sinh với hàm lượng nhỏ thức ăn thuỷ sản chất kích thích sinh trưởng (Mai Văn Tài ctv., 2004) 2.2 Một số bệnh tôm xanh 2.2.1 Bệnh vi rút 2.2.1.1 Bệnh trắng đuôi.(White Tail Disease, WTD) Bệnh trắng cịn gọi bệnh trắng (White Muscle Disease,WMD) virut có tên Macrobrachium rosenbergii Nodavirus (MrNV) Extra Small Virus (XSV) gây Bệnh gây thiệt hại lớn trại giống Ấn Độ, Trung Quốc, Đài Loan Đối với giai đoạn hậu ấu trùng, tỉ lệ chết 100% vòng 2-3 ngày xuất dấu hiệu lâm sàng 50% tôm trưởng thành (Hameed, 2003) Ở Trung Quốc, theo Xianle Huang (2003) trắng cịn gọi bệnh đục thân (White Body Disease) cho bệnh xuất PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com mầm bệnh từ Thái Lan mang sang Trung Quốc Bệnh đục công 60-90% quần đàn tôm gây tỉ lệ chết 50% cỡ 2-8cm Khi tôm bị bệnh phần thân trở nên tái nhợt, trắng đục Hiện tượng đục xuất từ telson di chuyển lên phần đầu (Bùi Quang Tề ctv, 2004) 2.2.1.2 Bệnh Hepatopancreatic (HPV) HPV xem virus tôm nuôi Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ HPV tìm thấy tơm thuộc họ Penaeid ni tự nhiên Australia, Trung Quốc, Hàn Quốc, Philippin, Đài Loan, Indonesia, Singapore…Vào 1990, báo cáo HPV tôm Penaeus vanamei P stylirostric nuôi tự nhiên bờ biển Thái Bình Dương phía tây Mexico (Lightner, 1996) Theo ơng, HPV tìm thấy tôm xanh Macrobrachium rosenbergii Đặc điểm bệnh khơng thấy có dấu hiệu đặc trưng bên Thể vùi virus bắt màu hồng Eosin bệnh giai đoạn sớm bắt màu bazơ đậm bệnh giai đoạn muộn Thể vùi tìm thấy nhân phì đại tế bào E F ống gan tụy (Lightner, 1996) 2.2.2 Bệnh vi khuẩn 2.2.2.1 Bệnh vi khuẩn Vibrio Tác nhân gây bệnh thường vi khuẩn: Vibrio anguillarium, V.alginolyticus, V.parahacmolyticus, V harveyi loài khác Khi nuôi mật độ dày, cho ăn nhiều quảng lý môi trường ao nuôi không tốt làm bệnh xuất Ở Trung Quốc, theo Xianle Huang (2003) tỉ lệ chết thường 30-50% tôm giai đoạn hậu ấu trùng Nếu giai đoạn giống bị nhiễm bệnh gây tổn thất nặng hay trắng Do vậy, trại giống thường xử dụng thuốc kháng sinh để ngăn chặn bệnh xảy điều làm xuất nhiều dịng vi khuẩn kháng thuốc 2.2.2.2 Bệnh đốm nâu Nguyên nhân gây bệnh liên kết nhiều tác nhân: hóa học, dinh dưỡng, lý học Vi khuẩn nấm tác nhân lây nhiễm thứ hai Các vi khuẩn gồm: Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Vibris sp … Tôm bị bệnh có dấu hiệu bị hoại tử, sưng viêm, đốm đen thân phụ bộ; tỉ lệ chết khơng đáng kể làm giảm giá trị kinh tế tôm Đây bệnh thường xảy ao nuôi tôm đặc biệt hệ thống nuôi tôm cơng nghiệp mật độ dày (trích dẫn Nguyễn Kim Cương, 2006) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 4.2 Kết kháng sinh đồ Các chủng vi khuẩn kiểm tra với loại kháng sinh: Streptomycin (S, 10µg), Colistin (CS,10µg), Norfloxacin (NOR,10ppm), Flofenicol (FFC,30µg), Oxolinic acid (O, 2µg), Amoxycilline (AMX,30µg), Doxycycline (DO,30µg), Ciprofloxacin (CIP,5µg) Qua biểu đồ cho thấy nhóm vi khuẩn nhạy với norfloxacin, doxycycline, flofenicol, colistin, streptomycin ciprofloxacin ngược lại oxolinic acid amoxicillin bị kháng Tuy nhiên, oxolinic acid có nhóm kháng thuộc Aeromonas với tỉ lệ tương đối thấp 8,33 % Riêng amoxicillin chiếm tỉ lệ kháng cao với nhóm vi khuẩn Trong Aeromonas Pantoea kháng hồn tồn chiếm 100% Enterobacter kháng đến 66,67% Nhưng xét cách tổng thể tính nhạy vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm đục kháng sinh cao, vịng vơ trùng tương đối lớn (Hình 4.7) 100 100 100 90 80 66.67 70 60 Tỉ lệ kháng(%) 50 40 30 20 10 0 00 8.33 00 000 00 00 00 CS S Aeromonas Enterobacter NOR DO OA FFC AMX CIP Tên thuốc Pantoea Hình 4.6: Biểu đồ thể tính kháng vi khuẩn loại kháng sinh 22 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com P2P1N9 Hình 4.7: Tính nhạy Enterobacter với kháng sinh Kết từ Bảng 4.4 thấy nhóm vi khuẩn nhạy với norfloxacin Aeromonas có đường kính vịng vơ trùng dao động nhiều từ 19 – 39mm có chủng đường kính khơng lớn P2P2N3 (19mm) Hai nhóm vi khuẩn cịn lại đường kính vịng vô trùng tương đối lớn (26-37mm) Đối với flofenicol nhóm Aeromonas nhạy, đường kính vịng vơ trùng tương đối ( 29-44mm), nhóm Enterobacter tính nhạy khơng cao (24-26mm) thấp nhóm Pantoea (P2P2N1) có chủng nhạy cấp trung bình (20mm) Ciprofloxacin có đường kính lớn loại thuốc kháng sinh, lớn 45mm thuộc Aeromonas (P2P2N13), khoảng dao động đường kính từ 23-45mm Tính mẫn cảm vi khuẩn doxycyline, colistin streptomycin, oxolinic acid cao Doxycyline, colistin streptomycin có chủng nhạy trung bình oxolinic acid có chủng kháng Aeromonas (P2P2N3) cịn lại tất nhạy Tính nhạy cảm vi khuẩn oxolinic acid tương đối lớn, dao động từ 24-34mm Những chủng mẫn cảm cao Aeromonas (P2P2N10, P2P2N13, P2P2N16, P2P2N15) đồng thời chủng mẫn cảm có chủng Aeromonas (P2P1N6, P2P2N11, P2P2N14) chủng mẫn cảm thuộc nhóm 23 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Pantoea (P2P2N1) Cịn lại chủng Enterobacter có khoảng đường kính ( 24-26mm) Bảng 4.4 Đường kính vịng vơ trùng 16 dịng vi khuẩn kháng sinh STT Chủng 10 11 12 13 14 15 16 P2P2N3 P2P2N12 P2P1N6 P2P2N10 P2P2N17 P2P1N3 P2P2N13 P2P2N11 P2P2N14 P2P2N16 P2P2N15 P13b1N1 P2P1N9 P2P1N12 P2P1N4 P2P2N1 NOR DO OA FFC AMX CS S CIP (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) 19 27 22 34 27 31 36 27 27 30 39 34 26 25 37 31 16 28 26 30 24 27 32 22 28 30 28 29 20 13 16 22 28 14 30 26 27 34 12 13 30 30 29 24 26 25 14 33 32 29 33 33 31 44 35 35 35 35 35 25 26 24 20 10 14 11 14 10 14 15 13 17 12 12 11 11 15 16 11 10 15 12 11 11 12 11 12 12 12 12 18 17 18 21 14 17 24 17 18 20 18 20 20 15 20 19 23 30 22 34 29 35 45 29 27 35 40 37 26 29 42 32 Ghi chú: 1-12 Aeromonas; 13-15: Enterobacter; 16: Pantoea S: Streptomycin, CS: Colistin, NOR: Norfloxacin, FFC: Flofenicol, OA: Oxolinic acid, AMX: Amoxycillin, DO: Doxycycline, CIP: Ciprofloxacin Tính nhạy, kháng, trung bình nhạy dựa vào đường kính chuẩn Bảng 3.3 Phần III) Colistin khơng có chủng kháng lại nhiên tính nhạy khơng cao, đường kính vịng vơ trùng tương đối nhỏ, dao động khoảng 10-12mm nhiều lớn có 16mm thuộc nhóm Aeromonas (P2P2N10 ) có chủng trung bình nhạy thuộc Aeromonas, P2P1N3 (10mm) Như colistin, streptomycin hồn tồn khơng bị kháng tính nhạy khơng cao khoảng dao động từ 15-24mm, nhạy 24mm thuộc nhóm Aeromonas (P2P2N13) thấp trung bình nhạy (14mm) Aeromonas (P2P2N17) 24 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Với doxycyline, khơng có chủng kháng đường kính vịng vơ trùng tương đối không lớn (13-32mm) khoảng dao động từ 13-27mm nhiều Riêng amoxycilin bị kháng hồn tồn (93,75%) 15 chủng bị kháng chủng cịn lại mẫn cảm trung bình (P2P1N12) thuộc nhóm Aeromonas Nhìn chung, từ kết kháng sinh đồ cho thấy tính kháng thuốc vi khuẩn xảy amoxycillin, thuốc lại nhạy, riêng có chủng thuộc Aeromonas kháng với oxolinic acid Nhưng cần lưu tâm đến colistin sử dụng tính nhạy tương đối thấp Xét nhóm nhạy, ciprofloxacin có đường kính vịng vơ trùng lớn flofenicol, thấp colistin streptomycin Như vậy, vi khuẩn phân lập từ huyết tương tơm xanh bị đục cịn mẫn cảm cao với kháng sinh trừ amoxicillin Hầu hết kháng sinh hiệu lực vi khuẩn Từ kết cho thấy, không nên sử dụng amoxycillin ao xanh bị đục trường hợp tỉ lệ kháng thuốc cao hạn chế tác dụng thuốc khơng có tác dụng điều trị Trong 16 chủng vi khuẩn kiểm tra kháng sinh đồ có 12 chủng Aeromonas Tính mẫn cảm Aeromonas loại kháng sinh kiểm tra tương tự với nhiều kết nghiên cứu trước Kết kháng sinh đồ nghiên cứu 10 dòng Aeromonas phân lập từ mẫu nước vùng nước Bangladesh kháng với Amoxycillin nhạy với Streptomycin (Bazlur & Valerie, 1994) Lê Trung Tín (2007) cho A.hydrophila nhạy với oxolinic acid, doxycycline nhạy trung bình norfloxacin streptomycin Ngoài ra, Nguyễn Thị Thúy Hằng (2008) cho A.hydrophila kháng với amoxicillin, doxycylin Qua nhiều nghiên cứu lại cho nhiều kết luận có phần trái ngược Có thể nói, vùng thời điểm lượng kháng sinh sử dụng khác nên kết nghiên cứu khác 25 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦNV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Qua kết kiểm tra hình thái sinh hóa nhuộm gram, tính di động, test phản ứng Oxidase, catalse, O/F, O/129 kit API 20E xác định 12 chủng Aeromonas có chủng A hydrophila (P2P2N15), chủng Enterobacter (P2P1N9, P2P1N12, P2P1N4) chủng Pantoea (P2P2N1) Kết kiểm tra kháng sinh đồ nhìn chung dễ mẫn cảm với Norfloxacin, Docycycline, Oxolinic acid, Flofenicol, Colistin, Streptomycin, Ciprofloxacin, có chủng Aeromonas (P2P2N3) kháng với oxolinic acid Riêng amoxycillin kháng gần hoàn toàn chiếm tỉ lệ 93,75% 5.2 Đề xuất Do thời gian đề tài có hạn nên nghiên cứu cần tạo điều kiện tiến hành diện rộng với tỉnh đồng sông Cửu Long để tìm hiểu đa dạng vi khuẩn mầm bệnh đục Nghiên cứu MIC với kháng sinh kháng sinh đồ để xác định lượng kháng sinh phù hợp sử dụng 26 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Quang Tề, Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội 2004 Bệnh học thủy sản Nhà xuất nông nghiệp – TPHCM Bùi Việt Hùng Tổng quan bệnh đuôi trắng tôm Càng Xanh - Tôm Nông nghiệp Việt Nam Crumlish, Tu Thanh Dung, J.F Turnbull, Nguyen Thi Nhu Ngoc, H.W Ferguson 2002 Indentification of E ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypothalamus culture in the MeKong Dalta VietNam, 25, 733 – 736 Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Thanh Phương, Nguyễn Thị Thu Hằng 2006 Xác định vị trí phân loại khả kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tơm sú (Penaeus monodon) Đặng Thị Hồng Oanh, Nguyễn Thanh Phương, Temdoung Somsiri, Supranee Chinabut, Fatimah Yussoff, Mohamed Shariff, Kerry Bartie, Geert Huys, Mauro Giacomini, Stefania Berton, Jean Swingsand Alan Teale 2005 Xác định tính kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn phân lập từ hệ thống nuôi thủy sản Đồng Bằng Sông Cửu Long, Việt Nam Tạp chí Nghiên Cứu Khoa Học, 2005 x-y Depaola A., James T Peeler and Gary E Rodrick 1995 Effect of Oxytetraxycline-Medicated Feed on Antibiotic Resistance of GramNegative Bacteria in Catfish Ponds Applied and Environmental Microbiology, June 1995, p 2335-2340 Depaola, A., Pauline, A Flynn, R Merrill McPhearson and Stuart B Levy 1988 Phenotypic and Genotypic Characterization of Tetracycline and Oxytetraxycline Resistance Aeromonas hydrophila from Cultured Channel Catfish (Ictalurus punctatus) and their Environments Applied and Environmental Microbiology, July 1988, p 1861-1863 Hameed, A.S.S.2003 White tail disease Hsieh, C.Y., Z.B Wu, M.C Tung, CTu, S.P Lo, T.C Chang, C.D Chang, S.C Chen In situ hybridization and RT-PCR detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man), in Taiwan Journal of Fish Diseases Volume 29 Issue 11 Page 665 - November 2006 27 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 10 Kumar, G.R , V.Rao, K.R.S.S Rao 2004 Appendage deformity syndrome-anutritional diease of Macrobrachium rosenbergii Disease of aquatic Organism Vol.59: 75-78 11 Lê Trung Tín 2007 Độ nhạy nồng độ diệt khuẩn kháng sinh với vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh cá tra giống (Pangasianodon hypothalamus) Thực tập tốt nghiệp đại học Khoa thủy sản – ĐHCT 12 Lightner , D.V 1996 A handbook of pathology and Diagnostic Procedures for disease of Penaed shimp World Aquaculture Society 13 Mai Văn Tài, Tống Hoài Nam, Lý Thị Thanh Loan, Phạm Văn Tình…2004 Điều tra đánh giá trạng loại thuốc, hóa chất chế phẩm sinh học dung nuôi trồng thủy sản nhằm đề xuất giải pháp quản lý Báo cáo đề tài khoa học, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 24 trang 14 Mattyar F., S Dincer, A Kaya, and Ư Çolak 2004 Prevalence and resistance to antibiotics in Gram negative bacteria isolated from retail fish in Turkey, Annals of Microbiology, 54 (2), p.151-160 15 Mohamed Nawaz, Kindon Sung, Saeed A Khan, Ashraf A Khan, and Roger Steele 2006 Biochemical and Molecular Characterization of Tetracycline-Resistance Aeromonas veronii Isolates from Catfish Applied and Environmental Microbiology, Oct 2006, p 6461-6466 16 Nguyễn Kim Cương 2006 Khảo sát kí sinh trùng, mơ học thử nghiệm cảm nhiễm bệnh đốm trắng tôm xanh nuôi ruộng lúa Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoa thủy sản – Đại học Cần Thơ 17 Nguyễn Hữu Thịnh Trương Thanh Loan 2007 Phân lập khảo sát đặc điểm kháng sinh Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasius hypophthamus) nuôi thâm canh Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Nơng Lâm Nghiệp số 1&2/2007 Trang 175-179 18 Nguyễn Thị Thúy Hằng 2008 Tiêu chuẩn hóa phương pháp lập kháng sinh đồ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila khoa thủy sản Luận văn tốt nghiệp Đại học Khoa thủy sản – Đại học Cần Thơ 19 Nguyễn Thị Đẹp, Chi cục thuỷ sản Cần Thơ 20 Pender J and E.E Stobberingh.2008 Antibiotic Resistaceof motile Aeromonads in indoor catfish and farms in the southern part of th 28 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Nethelands International journal of Antimicrobial Agents, March 2008, p.261-265 21 Sahul Hameed, A.S 2005 White Tail Disease - disease card Developed to support the NACA/FAO/OIE regional quarterly aquatic animal disease (QAAD) reporting system in the Asia-Pacific NACA, Bangkok, Thailand pp 22 Sahul Hameed, A.S., K Yoganandhan, J Sri Widada, J.R Bonami 2004 Experimental transmission and tissue tropismof Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and its associated extra small virus (XSV) Disease of aquatic organisms pp 191-196 23 Stock I., and B Wiedemann 2001 Natural Antibiotic susceptibilities of Edwardsiella tarda, E ictaluri and E hoshinac Antibiomicrobial Agenrs and chemotherapy, Aug, 2001, P.2245-2255 24 Tài liệu hứơng dẫn thực tập giáo trình chun mơn Bệnh học thủy sản 2008 25 Thơng xã Việt Nam Diện tích ni tôm xanh Đồng Bằng Sông Cửu Long tăng gấp 10 lần 26 Triệu Thanh Tuấn 2006 Khảo sát mối quan hệ kiểu gen White spots syndrome (WSSV) với bệnh đốm trắng tôm sú (Penaeus monodon) nuôi Bạc Liêu Cà Mau Luận văn tốt nghiệp Khoa thủy sản – Đại học Cần Thơ 45 trang 27 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa 2005 Giáo trình Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản- Trường Đại Học Cần Thơ 28 Từ Thanh Dung 2008 Bệnh vi khuẩn động vật thủy sinh Khoa thủy sản – Đại Học Cần Thơ 29 Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I 1998 30 Waltman W.D and E.B Shotts 1986 Antibiomicrobial susceptibility of Edwardsiella ictaluri, Journal of U’ildife Disrasrs.21(21.1986), pp17: 317 31 Wang C.S., J.S Chang, H.H Shih and S.N Chen 2007 RT-PCR amplification and sequence analysis of extra small virus associated with white tail disease of Macrobrachium rosenbergii (de Man) cultured in Taiwan Journal of Fish Diseases 2007, 30, 127-132 29 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 32 Xianle, Y and Huang, Y 2003 The status and treatment of serious disease of freshwater prawn and crabs in China 30 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC PHỤ LỤC A v Cách pha dung dịch nhuộm gram + Dung dịch 1: Crystal violet 2g Ethanol 95 % 20ml Ammonium oxalate 0,8g Nước cất 80ml Hòa tan crystal violet ethanol, hòa tan ammoniumoxalat nước cất Trộn dung dịch lại để yên sau 24h lọc + Dung dịch 2: Iodine 1g Potassium iodide 2g Nước cất 300ml Hòa tan Potassium iodide 20ml nước cất Cho them iodine vào để yên qua đêm Sau cho thêm thể tích cịn lại + Dung dịch 3: Pha dung dịch theo tỉ lệ 95% ethanol : 5% acetone + Dung dịch Safranin 0,25g Ethanol 95% 10ml Nước cất 90ml Hịa tan Safranin ethanol sau cho nước cất vào Cách pha ống chuẩn McFarland: 1%H2SO4 & 1% BaCl2 Ống McFarland 10 1% BaCl2 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1%H2SO4 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0 Mật độ vi khuẩn khoảng ( x 108) 12 15 18 21 24 27 20 31 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com v Nhuộm Gram Cho giọt nước muối sinh lý lên lame Dùng que cấy triệt trùng lấy khuẩn lạc trãi lên lame Để lame khô tự nhiên Hơ lướt lame lên đèn cồn, để cố địnhvi khuẩn, để nguội Nhuộm Crystal violet (dd1) khoảng phút, rữa lame nước Nhuộm iodine (dd2) phút, rửa lame nước Rửa lame dung dịch alcohol/acetone (dd3) từ 2-3 giây Rửa lame lại nước Nhuộm safranin (dd4) khoảng phút, rửa lại nước để khơ Quan sát lame kính hiển vi quang học (40X 100X) Vi khuẩn Gram (+): màu xanh / tím Vi khuẩn Gram (-): màu hồng v Tính di động Cho Vaseline lên góc lamelle đặt ngữa lamelle lên bàn Dung pipet tiệt trùng nhỏ giọt nước muối sinh lý lên lamelle Tiệt trùng que cấy, lấy khuẩn lạc hịa tan vào giọt nước muối lamelle Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn Cẩn thận lật nhanh lame để giọt nước treo ngược lamelle Đặt lame lên kính hiển vi, quan sát tính di động vi khuẩn vật kính 40X v Phản ứng Oxidase Chạm nhẹ que thử oxidase vào khuẩn lạc đĩa agar dung que cấy nhặt khuẩn lạc cho tiếp xúc que thử oxidase Quan sát que thử 30 giây quan sát thai đổi màu sắc: que thử chuyển màu xanh đậm cho phản ứng oxidase dương tính (+) khơng chuyển màu âm tính (-) 32 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com v Phản ứng Catalase Nhỏ giột dung dịch H2O2 3% lên lame Dung que cấy triệt trùng lấy vi khuẩn cho vào dung dịch H2O2 3% Phản ứng Catalase dương tính có tượng sủi bọt, catalase âm tính khơng sủi bọt v Khả lên men oxy hóa đường glucose (O-F test) Chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường O/F tiệt trùng Dung que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn đĩa agar cấy thẳng vào ống nghiệm chứa mơi trường O/F, sau phủ 0,5-1 ml dầu paraffin tiệt trùng vào ống nghiệm tạo điều kiện yếm khí ống nghiệm (F), ống cịn lại kiểm tra tính hiếu khí vi khuẩn (O) Để ống nghiệm vào tủ ấm 28-30oC Đọc kết sau 1-7 ngày Lên men (F) ống có phủ dầu paraffin chuyển màu vàng Oxy hóa (O) ống khơng có phủ dầu paraffin chuyển sang màu vàng Khơng phản ứng ống nghiệm màu xanh Bảng kiểm tra kết test O/F Ống tiếp xúc với khơng Ống phủ dầu paraffin khí Kết Xanh Xanh Không phản ứng với glucose Xanh lơ phần Xanh Phản ứng kiềm tính Vàng Xanh Phản ứng oxy hóa Vàng Vàng Phản ứng lên men 33 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com v Phương pháp định danh vi khuẩn kit API 20E (BIOMÉRIEUS) Cho nước cất nước máy vào khay nhựa kit để giữ ấm trình ủ tủ ấm Đặt kit API vào khay nhựa Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn: dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc cho vào ml nước muối sinh lý nước cất tiệt trùng lắc trộn Các bước thực hiện: Dùng dung dịch vi khuẩn cho vào đầy ô CIT, VP GEL Tương tự chi vi khuẩn vào đầy phần tuýp ô ADH, LCD, ODC, H2S URE, cho dầu paraffin vào đầy phần lõm ô Tiếp theo dùng dung dịch vi khuẩn cho vào đầy phần tuýp cịn lại Đậy nắp khay ủ tủ ấm 26-28oC Đọc kết sau 24-48 Đọc kết quả: Kiểm tra ghi nhận tiêu không cần thêm thuốc thử Các tiêu cần thêm thuốc thử: Cho giọt thuốc thử TDA vào ô TDA, đọc kết sau vài giây Cho gọt thuốc thử IND vào ô IND, đọc kết sau vài giây Cho giọt thuốc thử VP1 sau cho tiếp giọt thuốc thử VP2 vào VP, đọc kết sau 10-15 phút Trước đọc kết , kit API 20E phải đạt tối thiểu tiêu cho kết dương tính Ngược lại cần ủ mẩu them vài Sau cho thuốc thử vào đậy nắp khay nhựa lại Khi cho thuốc thử vào tiêu khơng nên ủ lại tủ ấm Kiểm tra kết test API 20E 34 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Bảng đọc kết test API 20E Chỉ tiêu Thành phần Phản ứng/enzyme Âm tính Dương tính Β-galactosidase Không màu Vàng ADH Ortho-nitrophenyl galactosidase Arginine Arginine hidrolate Vàng Đỏ/cam LDC Lysine Lysine decarboxylate Vàng Đỏ/cam ODC Ornithine Ornithine decarboxylate Xanh nhạt/vàng Xanh lá/xanh CIT sodium citrate Sử dụng citrate Không màu/xám Vệt đen mãnh nhạt H2S Sodium Thiosulphate Sản phẩm H2S Vàng Đỏ/cam URE Urea Men urease Vàng Nâu đỏ nhạt TAD L-Tryptophane Tryptophane deaminase Xanh nhạt/vàng Hồng IND L-Tryptophane Sản phẩm indole Không màu Hồng/đỏ VP Sodium Pyruvate Sản phẩm acetone Khơng có màu đen Khuyếch tán màu đen GEL Gelatin Gelatinase Xanh/xanh Vàng GLU D-glucose Lên men/oxh glucose Xanh/xanh Vàng MAN D-manitol Lên men/oxh manitol Xanh/xanh Vàng INO Inositol Lên men/oxh Inositol Xanh/xanh Vàng SOR D-sorbitol Lên men/oxh sorbitol Xanh/xanh Vàng RHA L-Rhamnose Lên men/oxh Rhamnose Xanh/xanh Vàng SAC D-sucrose Lên men/oxh sucrose Xanh/xanh Vàng MEL D-melibiose Lên men/oxh melibiose Xanh/xanh Vàng AMY Amygdalin Lên men/oxh Amygdalin Xanh/xanh Vàng ARA L-arabinose Lên men/oxh arabinose anh/xanh Vàng ONPG 35 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC B Kết đường kính vịng vô trùng thuốc kháng sinh lập kháng sinh đồ đường kính test O/129 STT Chủng 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 P2P2N3 P2P2N12 P2P1N6 P2P2N10 P2P2N17 P2P1N3 P2P2N13 P2P2N11 P2P1N9 P2P2N1 P2P1N4 P2P1N12 P2P2N4 P2P1N1C P2P2N14 P2P2N16 P2P2N15 P6M1N3 P6M1N4 P6M1N12 P3P1N16 P3P2N4 P3P2N14 P3P1N10 P6M1N10 P13b1N1 P6M1N16 P3P2N13 P3P1N18 P3P2N19 NOR DO OA FFC AMX CS 19 27 22 34 27 31 36 27 26 31 37 25 18 38 27 30 39 30 26 29 24 20 27 30 34 26 27 26 25 16 28 26 30 24 27 32 22 20 22 16 13 19 30 28 30 28 21 17 16 24 26 16 11 22 29 24 20 10 13 28 14 30 26 27 34 12 24 14 25 26 19 30 13 30 30 21 0 26 20 0 23 29 20 23 33 32 29 33 33 31 44 35 25 20 24 26 10 35 35 35 35 16 19 21 22 15 20 20 35 11 20 19 22 10 14 11 14 13 12 12 17 20 10 10 14 15 23 19 32 23 18 9 25 20 11 11 11 15 16 11 10 15 12 12 12 12 12 10 12 11 11 12 11 12 11 12 11 12 10 11 11 12 11 11 12 S CIP 0/129 18 17 18 21 14 17 24 17 20 19 20 15 17 19 18 20 18 16 20 21 17 15 21 17 20 20 17 18 18 23 30 22 34 29 35 45 29 26 32 42 29 21 39 27 35 40 23 25 29 30 20 27 30 37 27 28 30 40 15 15 12 14 9 14 15 20 15 22 16 12 15 12 15 16 24 20 24 15 16 15 15 24 16 16 15 Ghi chú: S: Streptomycin ( 10µg), CS: Colistin (10µg), NOR: Norfloxacin (10µg), FFC: Flofenicol (30µg), OA: Oxolinic acid (2µg), AMX: Amoxycilin ( 30µg), DO: Doxycycline (30µg), CIP: Ciprofloxacin (5µg) 36 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ... hoá khả kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn nhiễm tôm xanh bệnh đục ương nuôi Cần Thơ Đề tài bao gồm hai nội dung: Xác định số tiêu sinh hóa vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm xanh bị bệnh đục Xác. .. phát từ vần đề đề tài “ Xác định tiêu sinh hóa khả kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm xanh bị bệnh đục nuôi thành phố Cần Thơ? ?? thực nhằm mục tiêu tìm hiểu đặc điểm sinh. .. màu Vàng Vàng Xanh nhạt/vàng Không màu/xám nhạt Vàng Vàng Xanh nhạt/vàng Không màu Không có màu đen Xanh/ xanh Xanh/ xanh Xanh/ xanh Xanh/ xanh Xanh/ xanh Xanh/ xanh Xanh/ xanh Xanh/ xanh Xanh/ xanh Xanh/ xanh