BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TP.HCM BÁO CÁO NGHIỆM THU THU NHẬN TRỨNG BÒ, HEO ĐỂ CẢI THIỆN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TRỨNG TRONG ĐIỀU KIỆN VIỆT NAM Mã số: cs.2008.19. CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS. NGUYỄN THỊ THƢƠNG HUYỀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TP.HCM BÁO CÁO NGHIỆM THU THU NHẬN TRỨNG BÒ, HEO ĐẺ CẢI THIỆN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TRỨNG TRONG ĐIỀU KIỆN VIỆT NAM Mã số:CS.2008.19. CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS. NGUYỄN THỊ THƢƠNG HUYỀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/2009 i NHỮNG NGƢỜI THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI STT Tên ngƣời tham gia Tên cơ quan 1 ThS. Phạm Văn Phúc Trƣờng ĐH KHTN TPHCM 2 CN. Đô Ngọc Hân Trƣờng ĐH KHTN TPHCM 3 CN. Trƣơng Văn Trí Trƣờng ĐHSP TPHCM CÁC ĐƠN VỊ PHỐI HỢP • Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM • Viện Sinh học Nhiệt đới Tp. HCM ii MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix TÓM TẮT x PHẦN MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2.Mục tiêu đề tài 2 3. Cách tiếp cận đề tài 2 4. Phƣơng phảp nghiên cứu 3 5. Phạm vi nghiên cứu 3 6. Nội dung nghiên cứu 3 7. Sản phẩm đề tài 3 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Tình hình nghiên cứu về đông lạnh trứng 5 1.1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc 5 1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 7 1.2. Sinh lý buồng trứng 8 1.2.1. Quá trình hình thành và phát triển nang trứng 8 1.2.2. Sự hình thành và phát triển của trứng 9 1.2.3. Cấu tạo của trứng 12 1.3. Cơ sở khoa học của đông lạnh trứng 13 1.3.1. Các phƣơng pháp đông lạnh 13 1.3.2. Chất bảo quản lạnh (Cryoprotective Additive_CPA) 15 1.3.2. 1. Các chất bảo quản thƣờng sử dụng cho phƣơng pháp thủy tinh hóa 15 1.3.2.2. Dung dịch đệm và các đại phân tử 16 iii 1.3.3. Các yếu tổ ảnh hƣởng đến chất lƣợng trứng sau khi bảo quản bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa 18 1.3.3.1. Biến đổi trong tế bào đông lạnh 19 1.3.3.2. Tính an toàn khi đông lạnh trứng trƣởng thành 21 1.4. Ứng dụng của đông lạnh trứng 23 1.4.1. Ở ngƣời 23 1.4.2. Ở động vật 24 CHƢƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Nội dung 1: Đông lạnh trứng heo trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa 25 2.1.1. Thu nhận mẫu buồng trứng 25 2.1.2. Thu nhận và nuôi trứng Chuẩn bị 26 2.1.3. Đánh giá trứng và lựa chọn trứng chín để đông lạnh 28 2.1.4. Đông lạnh trứng bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (PP1) 29 2.1.5. Phƣơng pháp giải đông các vi giọt đƣợc đông lạnh 31 2.1.6. Đông lạnh trứng bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ (PP2) 33 2.1.7. Đánh giá tỷ lệ sống chết của trứng 35 2.2. Nội dung 2: Đông lạnh trứng bò trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ (PP2) 35 2. 2.1. Thu nhận mẫu buồng trứng 35 2.6.2.2. Thu nhận và nuôi trứng 35 2. 2.3. Đông lạnh trứng theo phƣơng pháp 2 37 2.3. Nội dung 3: Đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa 38 2.3.1.Thu nhận buồng trứng 38 2.3.2.Thu nhận trứng 38 2.3.3.Đông lạnh trứng 38 2.3.4. Phƣơng pháp giải đông 39 2.4. Xử lý số liệu 39 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 40 3.1. Kết quả nội dung 1 40 3.1.1. Kết quả thu nhận trứng 40 iv 3.1.2. Kết quả nuôi trứng trong ống nghiệm (IVM) 41 3.1.3. Kết quả đông lạnh trứng bằng PP1 44 3.1.4. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP2 48 3.1.5. Kết quả so sánh giữa 2 phƣơng pháp thủy tinh hóa trứng heo 50 3.2. Kết quả nội dung 2 51 3.2.1. Kết quả thu nhận trứng 51 3.2.2. Kết quả nuôi trứng bò 53 3.2.3. Kết quả đông lạnh trứng bò 55 3.3. Kết quả nội dung 3 57 3.3.1. Kết quả đông lạnh trứng bằng PP1 57 3.3.2. Kết quả đông lạnh trứng bằng PP2 59 3.3.3. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành theo 2 phƣơng pháp thủy tinh hóa 61 3.4. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ 63 3.5. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò và heo đã trƣởng thành bằng PP2 64 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 4.1. Kết luận 65 4.2. Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC 75 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Môi trƣờng chuẩn bị thu trứng 27 Bảng 3.1. Kết quả thu nhận trứng heo 40 Bảng 3.2. Kết quả nuôi trứng heo 42 Bảng 3.3. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP1 44 Bảng 3.4. Kết quả đông lạnh trứng heo bằng PP2 48 Bảng 3.5. So sánh kết quả đông lạnh trứng heo 50 Bảng 3.6. Kết quả thu nhận trứng bò 51 Bảng 3.7. Kết quả nuôi trứng bò 54 Bảng 3.8. Kết quả đông lạnh trứng bò chín bằng PP2 56 Bảng 3.9. Kết quả đông lạnh trứng bò bằng PP1 57 Bảng 3.10. Kết quả đông lạnh trứng bò bằng PP2 59 Bảng 3.11. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành 61 Bảng 3.12. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn khác nhau 63 Bảng 3.13. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò, heo trƣởng thành bằng PP2 64 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sự hình thành và phát triển nang trứng 9 Hình 1.2. Cấu trúc của buồng trứng và nang trứng 10 Hình 1.3. Tế bào trứng 12 Hình 1.4. Ảnh hƣởng của tốc độ đông lạnh lên sự hình thành tính thể đá 19 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 1 25 Hình 2.2: Mầu buồng trứng heo 26 Hình 2.3. Thao tác chọc hút trứng từ buồng trứng 28 Hình 2.4. Soi tìm và thu trứng bằng hệ thống kính đảo ngƣợc 28 Hình 2.5. Sơ đồ bổ trí đĩa vi giọt đông lạnh 30 Hình 2.6. Cách tạo vi giọt đông lạnh 30 Hình 2.7. Nhỏ trực tiếp vi giọt vào LN 2 31 Hình 2.8. Chuyển vì giọt vào cryotube 31 Hình 2.9. Thao tác đổ vị giọt ra khỏi cryotube 32 Hình 2.10. Sơ đồ bố trí đĩa vi giọt rã đông 32 Hình 2.11. Cọng rạ chứa trứng 33 Hình2.12. Lấy cọng rạ chứa trứng ra khỏi bình nitơ lỏng 34 Hình 2.13. Giải đông cọng rạ trong nƣớc ấm 34 Hình 2.14. Cắt cọng rạ chứa trứng 34 Hình 2.15. Chuyển trứng vào môi trƣờng RĐ 34 Hình 2.16. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 2 35 Hình 2.17. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 3 38 Hình 3.1. Trứng heo đƣợc thu nhận từ buồng trứng (X100) 40 Hình 3.2. Trứng heo với sự xuất hiện thể cực thứ nhất 42 Hình 3.3. Trứng sống 46 Hình 3.4. Trứng có tế bào chất phân mảnh 46 Hình 3.5. Trứng chết do tế bào chất co lại 46 vii Hình 3.6. Trứng bò thu nhận từ dịch nang trứng theo phƣơng pháp chọc hút (X40) 51 Hình 3.7. Trứng bò sau khi IVM có lớp cumulus giãn nở (X100) 54 Hình 3.8. Trứng bò sau khi IVM xuất hiện thể cực I (X400) 54 Hình 3.9. Trứng sống sau giải đông (X100) 55 Hình 3.10. Trứng chết sau giải đông 55 viii DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Kết quả thu nhận trứng heo từ buồng trứng 41 Biểu đồ 3.2. Kết quả nuôi trứng heo 42 Biểu đồ 3.3. Kết quả thu hồi trứng heo từ đông lạnh theo PP1 45 Biểu đồ 3. 4. Tỷ lệ sổng, chết của trứng heo so với tổng số trứng thu hồi đƣợc bảo quản theo PP1 46 Biểu đồ 3.5. Kết quả thu hồi trứng từ đông lạnh theo PP2 49 Biểu đồ 3. 6. Tỷ lệ sống, chết của trứng heo so vói tổng số trứng thu hồi đƣợc bảo quản theo PP2 49 Biểu đồ 3.7. Kết quả so sánh bảo quản trứng heo theo 2 phƣơng pháp 50 Biểu đồ 3.8. Kết quả thu nhận trứng bò từ mẫu buồng trứng 52 Biểu đồ 3.9. Kết quả nuôi trứng bò 54 Biểu đồ 3.10. Kết quả thu hồi trứng bò chín sau giải đông 56 Biểu đồ 3.11. Tỷ lệ trứng sống, chết so với tồng số trứng thu hồi đƣợc bảo quản theo PP2 57 Biểu đồ 3.12. Kết quả thu hồi trứng chƣa chín đƣợc bảo quản theo PP1 58 Biểu đồ 3.13. Tỷ lệ trứng sống, chết so với tồng số trứng thu hồi đƣợc bảo quản theo PP1 59 Biểu đồ 3.14. Kết quả thu hồi trứng chƣa chín đƣợc bảo quản theo PP2 60 Biểu đồ 3.15. Tỷ lệ trứng sống, chết so với tồng số trứng thu hồi đƣợc bảo quản theo PP2 61 Biểu đồ 3.16. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành 62 Biểu đồ 3.17. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò ở 2 giai đoạn khác nhau 63 Biểu đồ 3.18. So sánh kết quả đông lạnh trứng bò, heo trƣởng thành bằng PP2 64 [...]... cs., 1996) Trên cơ sở đó, chúng tôi mạnh dạn thực hiện đề tài "Thu nhận trứng bò, heo để cải thiện cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam" 2.Mục tiêu đề tài - Thu nhận và nuôi trứng bò, heo đến giai đoạn trƣởng thành (In vitro Maturaration_IVM) - Thử nghiệm khả năng sống của trứng bò, heo trƣởng thành sau khi đông lạnh bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa 3 Cách tiếp cận đề tài • Tiếp... PEG Polyethylene glycol PTN Phòng thí nghiệm PP1 Thủy tinh hóa trong vi giọt PP2 Thủy tinh hoa trong cọng rạ PVP Polyvinylpirrolidone x TÓM TẮT Tên đề tài: "Thu nhận trứng bò, heo để cải thiện cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam " Mã số: CS.2008.19 Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Thị Thƣơng Huyền Tel.: 0918605081 Email: thuonghuyen78@,yahoo.com; huyenntth@,hcmup.edu.vn Cơ quan chủ... hành thu nhận và bảo quản nguồn trứng bò, heo thu nhận từ lò mổ bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong vi giọt và trong cọng rạ Kết quả sản phẩm Đã bảo quản đƣợc số lƣợng trứng vƣợt với chỉ tiêu đề ra trong thuyết minh: • 71 cọng rạ chứa 386 trứng heo đã IVM • 36 cọng rạ chứa 197 trứng bò đã IVM 4 Mở đầu • 70 cọng rạ chứa 365 trứng bò chƣa trƣởng thành • 305 trứng heo đã IVM trong vi giọt • 477 trứng. .. quan trong và ngoài nƣớc • Tiếp cận với các kỹ thu t hiện đại: hệ thống máy đông lạnh và giải đông trứng, kỹ thu t vi thao tác, PCR 3 Mở đầu 4 Phƣơng phảp nghiên cứu • Phƣơng pháp trực quan (nghiên cứu trực tiếp): thu nhận trứng và xử lý trứng, đông lạnh trứng, giải đông trứng, kiểm tra, đánh giá tỷ lệ trứng sống sau khi rã đông • Phƣơng pháp tổng họp • Phƣơng pháp so sánh 5 Phạm vi nghiên cứu • Trứng. .. Chọn đƣợc 1189 trứng để nuôi chín, tỷ lệ chín đạt 65,42 ± 0,79% (779 trứng) ; Có 305 trứng đƣợc đông lạnh theo vi giọt, tỷ lệ sống đạt 46,15 ± 5,63%; 386 trứng đƣợc đông lạnh bằng cọng rạ, tỷ lệ sống đạt 47,54 ± 0,60% Kết quả nội dung 2: Thu đƣợc 909 trứng/ 50 buồng trứng, trung bình đạt 18,55 trứng/ buồng; Chọn đƣợc 684 trứng đem nuôi, tỷ lệ chín đạt 84,92 ± 0,63% (580 trứng) ; Đông lạnh 197 trứng bằng cọng... thƣơng trong cấu trúc và chức năng của trứng Trong đó, tổn thƣơng lạnh và độc tính của các chất bảo quản là những bất lợi chính quy t định đến sự bảo quản trứng thành công Do đó, để sống sau đông lạnh, trứng phải trải qua một chuỗi co và giãn nở thể tích Trứng dễ bị tổn thƣơng bởi quy trình đông lạnh: sự hình thành tinh thể đá, thẩm thấu khi loại bỏ chất bảo quản đông lạnh khỏi tế bào Vì vậy, việc đông lạnh. .. Các phương pháp đông lạnh Đông lạnh trứng là sự bảo quản thành công chức năng bình thƣờng của trứng khi giảm nhiệt độ dƣới mức phản ứng hóa học bình thƣờng xảy ra (từ 37°C, 5%CO2 (điều kiện sinh lý) xuống - 1960c (nhiệt độ không sinh lý)) Đông lạnh trứng có thể phân loại theo hai cách chung là đông lạnh cân bằng "equilibrium" với phƣơng pháp đông lạnh chậm (slow freezing) hay đông lạnh không cân bằng... gia thế giới 2 Mở đầu chƣa cao (bò 30%, ngƣời 10%,) Chính điều này là làm tốn kém và hạn chế trong công việc của nhiều nƣớc Một trong những tác nhân giới hạn thành công của kỹ thu t đông lạnh trứng là xảy ra tổn thƣơng lạnh trong suốt quá trình đông lạnh Trứng rất dễ tổn thƣơng khi tiếp xúc với nhiệt độ thấp của quá trình đông lạnh và để tránh điều này bằng cách sử dụng phƣơng pháp thủy tinh hóa (Ruffing... Vissan Tp HCM • Trứng heo từ lò mổ Vissan Tp HCM 6 Nội dung nghiên cứu • NỘI DUNG 1 : Đông lạnh trứng heo trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (PP1) và trong cọng rạ (PP2) • NỘI DNG 2 : Đông lạnh trứng bò trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ (PP2) • NỘI DNG 3 : Đông lạnh trứng bò chƣa trƣởng thành bằng phƣơng pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (PP1) và trong cọng... lệ trứng sống sau giải đông đạt 79,90 ± 2,33% Kết quả nội dung 3: Đông lạnh 477 trứng bằng vi giọt, tỷ lệ trứng sống sau giải đông là 71,92 ± 2,20%; 365 trứng đông lạnh bằng cọng rạ, tỷ lệ trứng sống sau giải đông là 65,31 ± 2,69% Từ khóa: nuôi chín trứng, đông lạnh trứng, thủy tinh hóa xii SUMMARY Project Title: "Collected bovine and porcine oocytes to improve oocyte cryopreserved protocol in Vietnamese . " ;Thu nhận trứng bò, heo để cải thiện cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam& quot;. 2.Mục tiêu đề tài - Thu nhận và nuôi trứng bò,. TP.HCM BÁO CÁO NGHIỆM THU THU NHẬN TRỨNG BÒ, HEO ĐỂ CẢI THIỆN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TRỨNG TRONG ĐIỀU KIỆN VIỆT NAM Mã số: cs.2008.19. CHỦ