ĐẠI HỌC DUY TÂN KHOA DƯỢC BỘ MÔN Y DƯỢC HỌC CƠ SỞ TẬP BÀI GIẢNG Môn học : THỰC HÀNH CĂN BẢN VI SINH HỌC Số tín chỉ: 01 Dành cho sinh viên ngành: Dược sỹ Đại học Khoa : Dược Bậc đào tạo: Đại học – Cao đẳng Học kỳ : II Đà nẵng, tháng 01 năm 2017 Mã mơn học: MIB 251 MỤC LỤC Sử dụng kính hiển vi, loại hình thể vi khuẩn Kỹ thuật vơ khuẩn, tiệt khuẩn, khử khuẩn phịng thí nghiệm vi sinh vât Kỹ thuật làm tiêu phương pháp nhuộm vi sinh vật 17 Cách lấy, bảo quản vận chuyển bệnh phẩm chẩn đoán vi sinh vật 23 Các phương pháp phân lập xác định vi khuẩn 28 Phản ứng sinh hoá 34 Kháng sinh đồ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 Bài giảng Thực hành Vi sinh – Khoa Dược SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI CÁC LOẠI HÌNH THỂ CỦA VI KHUẨN Mục tiêu: Trình bày đặc điểm cấu tạo kính hiển vi quang học sáng Nắm cách sử dụng bảo quản sử dụng vật kính x100 Nắm loại hình thể vi sinh vật I.GIỚI THIỆU VỀ KÍNH HIỂN VI Sơ lƣợc lịch sử loại kính hiển vi 1.1 Sự phát minh kính hiển vi Anton van Leeuwenhoek (1632 – 1723), người Hà Lan, người kỷ 17 nhìn thấy vi sinh vật nhờ kính hiển vi độ phóng đại 270 – 300 lần mà ơng chế tạo (1676) Ơng chế tạo kính hiển vi cách xếp nhiều thấu kính khoảng cách khác trục quang học, kết làm phóng đại hình ảnh vật thể lên nhiều lần, ông dùng để quan sát hồng cầu, phấn hoa, mao mạch phổi sau với kính hiển vi có độ phóng đại khoảng 300 lần ông phát vi sinh vật nước 1.2 Các loại kính hiển vi Kính hiển vi quang học thƣờng: thường sử dụng phịng thí nghiệm để xét nghiệm với mục đích quan sát hình thể, tính chất bắt màu vi khuẩn Kính hiển vi đen: loại kính hiển vi quang học, phận tụ quang thay cấu trúc khác để tạo tối, hay sử dụng để quan sát di động vi khuẩn Kính hiển vi đổi pha: kính hiển vi quang học có pha đảo ngược, thường dùng Kính hiển vi huỳnh quang: kính hiển vi quang học có nguồn sáng đèn huỳnh quang, thường dùng để quan sát tiêu sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang Kính hiển vi điện tử: đời từ năm 1940, hoạt động theo nguyên lý phận đặt trụ kính tạo chân không bơm hút Trong chân không, hoạt động điện tử không bị cản trở Các điện tử bắn xuyên qua mẫu vật, Bài giảng Thực hành Vi sinh – Khoa Dược vật kính thị kính từ trường làm tản rộng (phân kỳ), sau lên huỳnh quang có máy chụp ảnh để chụp cần Cấu tạo kính hiển vi quang học Gồm có giá kính, hệ thống điều chỉnh nhanh, tinh hệ thống quang học 2.1 Giá kính Gồm có đế kính, thân kính, ống kính, bàn xoay, bàn kính - Đế kính nặng có lỗ để cắm đèn chiếu cắm gương phản chiếu - Thân kính có hình cong để cầm di chuyển dễ dàng kính hiển vi - Ống kính mang thị kính, cố định quay lúc nới lỏng ốc nhỏ bên ống kính - Bàn xoay có nhiều lỗ để lắp vật kính - Bàn kính dùng để mang tiêu bản, có ốc để di chuyển tiêu theo chiều thẳng góc với nhau, có kẹp cố định tiêu bản, có thước đo du xích để ghi toạ độ 2.2 Hệ thống điều chỉnh nhanh tinh Cần thiết để điều chỉnh tiêu Hệ thống gồm có ốc đặt trục Ốc lớn (ốc vĩ cấp) điều chỉnh nhanh làm cho ảnh ra, ốc nhỏ (ốc vi cấp) điều chỉnh chậm tinh nhằm điều chỉnh ảnh cho thật rõ Chỉ ảnh điều chỉnh ốc lớn vặn ốc nhỏ để làm rõ ảnh 2.3 Hệ thống quang học Gồm có vật kính, thị kính, kính tụ quang Đèn chiếu gương phản chiếu - Thị kính gồm hệ thống thấu kính, hướng mắt, hướng vật quan sát - Vật kính hệ thống quang học phức tạp trực tiếp phóng đại mẫu vật quan sát Nó gồm số thấu kính, thấu kính hướng vào vật quan sát gọi thấu kính trực diện - Có loại vật kính: + Vật kính thơ: Vật kính thơ có độ phóng đại nhỏ, đường kính thấu kính tương đối lớn vật kính 10, vật kính 40 + Vật kính dầu: có độ phóng đại lớn, hay dùng vật kính 100, thấu kính có đường kính nhỏ Do có phần chùm tia sáng chiếu lọt vào vật kính, phần ánh sáng bị khúc xạ ngồi nên ảnh khơng rõ Muốn có ảnh rõ phải đặt mẫu vật vật kính giọt dầu có chiết xuất n = 1,515 gần chiết xuất thuỷ tinh n =1,52 để tạo nên môi trường đồng để ánh sáng không bị khúc xạ mà thẳng vào vật kính Bài giảng Thực hành Vi sinh – Khoa Dược Muốn biết độ phóng đại thấu kính hiển vi người ta nhân độ phóng đại thị kính với độ phóng đại vật kính - Kính tụ quang gồm có hệ thống thấu kính tập trung ánh sáng hệ thống chắn sáng có nhiệm vụ giảm bớt góc hình nón ánh sáng để sau qua mẫu vật đến vật kính khơng vượt qua đường kính thấu kính trực diện - Đèn chiếu đặt tụ quang cung cấp nguồn sáng thích hợp - Gương phản chiếu: lúc khơng có điện sử dụng ánh sáng mặt trời gương phản chiếu, gương có mặt phẳng mặt lõm Mặt phẳng sử dụng để phản chiếu ánh sáng mặt trời mặt lõm sử dụng để phản chiếu ánh sáng nhân tạo ánh đèn neon Cấu tạo kính hiển vi quang học (1.Thị kính, 2.Giá điều chỉnh vật kính, 3.Vật kính, 4.Ốc vĩ cấp, 5.Ốc vi cấp, 6.Bàn kính, 7.Nguồn sáng, 8.Tụ quang, 9.Vi chỉnh) Bài giảng Thực hành Vi sinh – Khoa Dược II CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI Các bƣớc để soi kính vật kính dầu - Nhỏ giọt dầu xét lên chổ quan sát tiêu di chuyển tiêu để giọt dầu nằm vịng trịn bàn kính - Đặt vật kính 100 vào trục quang học - Mắt nhìn vào vật kính, vặn ốc vĩ cấp để nâng tiêu từ từ sát với vật kính - Bật đèn điều chỉnh tụ quang để có ánh sáng thích hợp - Mắt nhìn vào thị kính, vặn ốc vĩ cấp để hạ bàn kính từ từ xuống nhìn thấy ảnh Dùng ốc vi cấp để điều chỉnh ảnh cho thật rõ Nếu khơng nhìn thấy ảnh tiếp tục nâng bàn kính lên hạ bàn kính xuống - Mắt nhìn vào thị kính, tay vặn ốc vi cấp để điều chỉnh cần, tay vặn ốc bàn kính để quan sát tồn tiêu Ghi toạ độ điểm tiêu Để tìm trở lại điểm cần quan sát tiêu phải ghi toạ độ điểm đó, muốn đọc hồnh độ tung độ thước cia mm di động đồng thời với tiêu du xích cố định, thước di động du xích cố định thẳng góc với III CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI Sau sử dụng, kính hiển vi phải bảo quản tốt để sử dụng lâu dài, cần thực hiền đầy đủ bước sau: - Lúc sử dụng xong, phải hạ bàn kính tiêu khỏi bàn kính - Xoay vật kính dầu vị trí dễ lau - Dùng khan mềm vải mịn khan giấy để lau vật kính, nhúng góc khăn với xylen lau vật kính dầu Xong lau khơ với góc khăn - Đặt vật kính độ phóng đại nhỏ trục quang học - Điều chỉnh xe tiêu bản, tụ quang, bàn kính,… đến vị trí mà đường trượt tiếp xúc với bụi phía - Lúc di chuyển: đỡ đế kính tay, cầm thân kính tay để giữ kính vị trí thẳng đứng lúc đặt kính bàn IV CÁC LOẠI HÌNH THỂ CỦA VI KHUẨN Theo hình thái bề vi khuẩn thường chia thành loại hình thể chính: cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn Bài giảng Thực hành Vi sinh – Khoa Dược Cầu khuẩn Là vi khuẩn có hình cầu kích thước khoảng 0,5 x 1,2 µm, tuỳ theo vị trí mặt phẳng phân cắt đặc tính rời dính với sau phân cắt mà cầu khuẩn chia thành: - Đơn cầu: Thường đứng riêng tế bào một, đa số tạp khuẩn gặp nước, đất khơng khí - Song cầu: Là cầu khuẩn đứng thành đơi Có số lồi song cầu có khả gây bệnh cho người như: Streptococcus pyogenes … - Tetracoccus: Là cầu khuẩn xếp thành cụm - Sarcina: Xếp thành cụm 8-16 tế bào Một số gây bệnh cho người động vật - Tụ cầu: phân cắt theo mặt phẳng sau tụ lại với thành đám hình chùm nho Một số lồi gây bệnh người Ví dụ như: tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) Cầu khuẩn nói chung khơng có lơng khơng có khả di động Trực khuẩn Là vi khuẩn có hình que, kích thước khoảng 0,5 – 1,0 x – µm, loại trực khuẩn thường gặp là: - Trực khuẩn không sinh nha bào Ví dụ: E.coli, Shigella, Salmonella, bạch hầu, lao… - Trực khuẩn hiếu khí sinh nha bào (Bacillus) - Trực khuẩn kỵ khí sinh nha bào (Clostridium) Ví dụ trực khuẩn uốn ván, trực khuẩn gây hoại thư sinh hơi… Vi khuẩn hình xoắn Gồm có dạng sau: - Phẩy khuẩn (Vibrio): Là loại vi khuẩn xoắn nửa vịng nên có hình giống dấy phẩy Ví dụ: Phẩy khuẩn tả (Vibrio cholera) - Spirillum: Gồm vi khuẩn có đến vịng xoắn nên có hình chữ S - Xoắn khuẩn (Spirochetes): Gồm có vi khuẩn dài mảnh, có nhiều vịng xoắn Một số có khả gây bệnh cho người xoắn khuẩn giang mai (Treponema pallidum), xoắn khuẩn Leptospira, xoắn khuẩn sốt hồi quy (Borrelia) CÂU HỎI LƢỢNG GIÁ: Mô tả cấu tạo kính hiển vi quang học sáng Trình bày cách sử dụng kính hiển vi quang học sáng sử dụng vật kính x100 Nêu dạng hình thể vi khuẩn Bài giảng Thực hành Vi sinh – Khoa Dược KỸ THUẬT VƠ KHUẨN, TIỆT KHUẨN, KHỬ KHUẨN TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT Mục tiêu: Nắm thao tác kỹ thuật vô khuẩn thực hành vi sinh vật Trình bày phương pháp tiệt khuẩn phịng thí nghiệm vi sinh vật Trình bày số hố chất dùng để khử khuẩn phịng thí nghiệm vi sinh vật Biết cách xử lý dụng cụ thuỷ tinh phòng thí nghiệm vi sinh vật I KHÁI NIỆM Khử khuẩn công việc cần thiết thực ngày phịng thí nghiệm vi sinh, số thuật ngữ thường dùng ngày để công việc định nghĩa đây: Vô khuẩn (Aseptic) q trình thao tác nhằm ngăn chặn hay dự phịng xâm nhập vi sinh vật đến dụng cụ chun mơn, tới phịng mổ, buồng tiêm, buồng thay băng, buồng pha chế thuốc vết thương, vết mổ… Tiệt khuẩn (Sterilization) biện pháp vật lý, hoá học nhằm loại bỏ hoàn toàn tiêu diệt hết vi sinh vật sống dụng cụ, phương tiện, dịch truyền,… Khử khuẩn (Disinfection) dùng biện pháp vật lý, hoá học để giết chết hầu hết vi sinh vật Khử khuẩn khơng giết chết toàn dạng đề kháng vi sinh vật nha bào, vi khuẩn Mycobacteria, virut nấm Người ta chia chất khử khuẩn mức độ khác mức độ thấp, mức độ trung gian mức độ cao Sát khuẩn (Antiseptic) việc dùng hoá chất để giết chết, làm giảm số lượng vi sinh vật bề mặt da Các hoá chất dùng để sát khuẩn chọn lọc kỹ để đảm bảo tính an tồn khơng làm tổn thương tổ chức thể vật chủ phải có hiệu lực Trong chẩn đoán vi sinh vật gây bệnh yêu cầu cho người làm kỹ thuật phải đảm bảo vô khuẩn, làm tốt công tác tiệt khuẩn II THAO TÁC VÃ KỸ THUẬT VÔ KHUẨN Ý nghĩa thao tác kỹ thuật thực hành vi sinh vật - Tránh tạp nhiễm cho mẫu nghiệm đem lại kết chẩn đốn xác Bài giảng Thực hành Vi sinh – Khoa Dược - Tránh lây nhiễm cho người tiếp xúc lây lan cho môi trường xung quanh Các thao tác kỹ thuật vô khuẩn Trong thực hành vi sinh vật, để đảm bảo vô khuẩn, yêu cầu người làm kỹ thuật phải thực thao tác kỹ thuật sau: 2.1 Sử dụng que cấy - Cầm que cấy cầm bút, “ mềm” cổ tay để dễ làm thao tác - Khử khuẩn đầu kim loại que cấy lửa đèn cồn: vừa đốt vừa xoay que cấy Phải khử khuẩn đầu kim loại que cấy trước sau lấy bệnh phẩm 2.2 Sử dụng ống nghiệm - Cách cầm ống nghiệm: có cách + Cầm ngón tay 1,2,3 Thân ống nghiệm lót ngón tay Đáy ống nghiệm đặt lịng bàn tay + Cầm ngón tay 1,2 Thân ống nghiệm kẹp ngón tay Thường dùng tay trái cầm ống nghiệm Tay phải cầm que cấy - Mở nút ống nghiệm: dùng mô út bàn tay phải mở nút ống nghiệm Tay trái xoay kéo ống nghiệm khỏi nút - Đóng nút ống nghiệm: làm mở nút đẩy ống nghiệm vào nút theo hướng ngược lại mở nút - Khử khuẩn ống nghiệm: + Sau mở nút ống nghiệm, phải hơ nóng miệng ống nghiệm lửa đèn cồn trước lấy bệnh phẩm (vừa hơ vừa xoay tròn miệng ống nghiệm) + Phải khử khuẩn lại trước đậy ống nghiệm 2.3.Sử dụng hộp Petri (hộp lồng) - Cách cầm hộp Petri: (có cách) thường dùng tay trái để cầm hộp Petri + Dùng bàn tay để đỡ đáy hộp dụng ngón tay cố định lên bờ nắp hộp + Dùng ngón tay 3,4,5 đỡ đáy hộp, hai ngón vịng theo chu vi nắp hộp - Mở đóng nắp hộp Petri: dùng ngón để mở đóng nắp hộp * Chú ý: Ít mở tồn nắp hộp, thường mở phần để hạn chế vi khuẩn từ khơng khí rơi vào hộp Petri 2.4 Sử dụng ống hút - Có loại ống hút: ống hút khắc độ ống hút Pasteur - Các ống hút có bơng nút đầu, bọc giấy khử khuẩn 170 C/30 phút trước sử dụng dùng, ống hút khử khuẩn lại - Dùng bóp cao su để hút dung dịch - Cắm ống hút dùng vào bình chứa dung dịch khử khuẩn Bài giảng Thực hành Vi sinh – Khoa Dược III CÁC KỸ THUẬT TIỆT KHUẨN BẰNG NHIỆT Tiệt khuẩn nhiệt khơ 1.1 Phương pháp đốt: Dùng lị đốt nhỏ để đốt xác động vật thí nghiệm, bơng gạc bẩn Dùng cồn đốt dụng cụ tiểu phẫu thuật dùng đèn cồn, đèn gaz khử khuẩn miệng ống nghiệm, đầu kim loại que cấy 1.2 Sấy khơ khơng khí nóng (dùng tủ sấy khơ): a Ngun lý: dùng tủ kín kim loại có nguồn nhiệt nâng nhiệt độ khơng khí tủ lên tới 170-1800C Ở 1700C /60 phút 1600C /120 phút tất vi khuẩn nha bào bị diệt trình nước tế bào vi sinh vật b Cấu trúc tủ sấy: - Bộ phận điều chỉnh dòng điện - Nhiệt kế - Bộ phận ngắt tự động (phòng nhiệt độ lên mức yêu cầu) - Các đèn hiệu (để báo cho dịng điện có hoạt động hay không) c Cách sử dụng: - Cho đồ vật cần sấy vào tủ (ống nghiệm, ống hút, hộp lồng Petri,…), dụng cụ sau rửa sạch, phơi khơ, phải gói thành gói giấy Để đồ vật giá lưới thép, tránh chạm vào thành tủ nhiệt độ thành tủ cao làm cháy giấy bọc làm vỡ đồ thủy tinh - Đóng mạch điện (mở nguồn nhiệt) chờ nhiệt kế đủ nhiệt độ yêu cầu trì nhiệt độ 30 phút Tắt nguồn nhiệt - Chờ nhiệt độ hạ xuống khoảng 50-600C (mùa hè) 30-400C (mùa đông) mở tủ lấy dụng cụ * Lưu ý: + Tủ sấy dùng để sấy dụng cụ thủy tinh, không sấy đồ nhựa, cao su Dụng cụ kim loại sấy, sấy bị gỉ, giịn dể gãy + Cửa tủ sấy lổ thông phải đậy kín bắt đầu sấy Chú ý theo dõi đèn hiệu nhiệt kế nhiệt độ nâng cao không mở tủ Muốn mở tủ sấy phải mở lỗ thông trước + Sau sấy, đồ vật lấy nên để giấy, vãi, gỗ để trực tiếp xuống đá lạnh làm đồ vật dễ vỡ Có thể kiểm tra nhiệt độ sấy có đủ đảm bảo khử khuẩn khơng cách xem nút bơng: có màu nâu vừa, nút bơng cịn màu trắng nhiệt độ thấp (