Giáo trình Thực tập dược liệu BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO KHOA DƯỢC GIÁO TRÌNH THỰC TẬP DƯỢC LIỆU (Dành cho sinh viên dược) ĐÀ NẴNG 2018 Giáo trình Thực tập dược liệu Giáo trình Thực tập dược liệu NỘI QUY PHỊNG THÍ NGHIỆM Sự an tồn phịng thí nghiệm vấn đề đặt lên hàng đầu Vì vậy, tất sinh viên thực hành phịng thí nghiệm cán giảng dạy, cán làm cơng tác nghiên cứu phịng thí nghiệm phải thực theo nội quy sau: 1.Đọc kỹ tài liệu thực tập, nắm vững nguyên tắc, vật liệu, phương pháp thực hành tập trước bước vào phịng thí nghiệm thực theo nội quy phịng thí nghiệm q trình thực tập, nghiên cứu 2.Mặc áo blouse suốt thời gian thực tập nghiên cứu phịng thí nghiệm Chỉ mang tài liệu tối thiểu cần thiết cho thực tập vào chỗ làm, tất vật dụng khác phải để vị trí cách ly riêng 3.Khơng ăn uống, hút thuốc, trang điểm, nghe nhạc, đùa giởn phịng thí nghịêm 4.Phải vệ sinh thật vị trí thực tập, thiết bị, dụng cụ thí nghiệm trước sau thực tập, nghiên cứu 5.Đổ hố chất ngồi phải lau ngay, chai hố chất phải có tên hố chất Tuyệt đối không dùng dụng cụ lấy lúc nhiều loại hố chất 6.Cấm tuyệt đối khơng dùng miệng để hút hố chất, khơng dùng mũi ngửi hố chất Pha dung môi chất độc hại tủ hút khí độc có mang trang găng tay chống khí độc Đeo kính bảo hộ thực phản ứng, phản ứng với dung môi độc acid đậm đặc phải thực tủ hút Không hút thuốc dùng lửa trần phịng thí nghiệm khu vực lân cận 9.Tn thủ nghiêm túc hướng dẫn cán phụ trách phịng thí nghiệm việc sử dụng hố chất, dụng cụ thiết bị Nếu có trường Giáo trình Thực tập dược liệu hợp xảy tai nạn, cố phải báo cho cán phụ trách để có biện pháp xử lý kịp thời VÌ AN TOÀN CHO CÁ NHÂN BẠN VÀ MỌI NGƯỜI, HÃY TUÂN THỦ ĐÚNG QUY ĐỊNH Giáo trình Thực tập dược liệu KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA ALKALOID I CƠ SỞ LÝ THUYẾT CHUNG Các alkaloid (alcaloid) base hữu thường dễ tan dung môi hữu (như ether, benzen, cloroform, aceton, methanol, ethanol) Đa số alkaloid base thực tế không tan nước Một vài alkloid khơng có oxy tồn trạng thái lỏng tan nước Một số alkaloid dạng lỏng bay lơi theo nước Một số alkaloid khơng có oxy dạng rắn thăng hoa áp suất thường Một số alkaloid có –OH phenol tan phần dung dịch kiềm mạnh Dưới dạng muối, alkaloid thường tan nước, cồn (ethanol, methanol) hay hỗn hợp cồn nước; chúng không tan tan dung môi hữu phân cực (ether, benzen, cloroform) II TÍNH CHẤT CHUNG CỦA ALKALOID Alkaloid thường base yếu, tan dung môi hữu cơ, không tan nước Khi cho alkaloid tác dụng với acid thu alkaloid dạng muối Các muối alkaloid thường dễ tan nước Các muối dễ bị chất kiềm vô (NH4OH, NaOH) chí cá muối khác (Na2CO3, đơi NaHCO3) đẩy khỏi muối cho lại alkaloid ban đầu Alkaloid phản ứng với thuốc thử chung (thuốc thử tạo tủa) tạo thành muối khó tan (dạng kết tinh hay vơ định hình) ứng dụng định tính alkaloid Giáo trình Thực tập dược liệu Một số alkaloid hay nhóm alkaloid cho màu sắc đặc trưng với số thuốc thử gọi thuốc thử đặc hiệu alkaloid (thuốc thử tạo màu) ứng dụng định tính làm thuốc thử phát sắc ký III KIỂM ĐỊNH CÁC ALKALOID Trong kiểm định dược liệu chứa alkaloid, tiêu kiểm định chung cho dược liệu, người ta phải tiến hành định tính định lượng alkaloid dược liệu Có thể định tính alkaloid trực tiếp mô thực vật hay dịch chiết dược liệu Để định tính alkaloid vi phẫu thực vật, người ta quan sát tủa alkaloid với thuốc thử Bouchardat kính hiển vi Đơi định tính trực tiếp alkaloid mặt cắt dược liệu thuốc thử đặc hiệu Để định tính alkaloid dịch chiết dược liệu, thuốc thử chung, thuốc thử tạo màu sắc ký lớp mỏng phương pháp thường dùng Có nhiều phương pháp định lượng alkaloid dược liệu phương pháp cân, phương pháp thể tích, phương pháp quang phổ Tùy trường hợp mà lựa chọn phương pháp thích hợp Cũng kết hợp phương pháp phân tách (thường phương pháp sắc ký) với việc định lượng (thường phương pháp quang phổ) để định lượng riêng hay vài alkaloid hỗn hợp alkaloid tồn phần Kết biểu thị - % alkaloid tồn phần có dược liệu (phương pháp cân trực tiếp) - % cuả alkaloid toàn phần có dược liệu quy theo alkaloid (phương pháp cân gián tiếp, phương pháp chuẩn độ acid-base, phương pháp quang phổ) Giáo trình Thực tập dược liệu - % alkaloid có dược liệu (phương pháp kết hợp sắc ký- quang phổ) IV CHIẾT XUẤT CÁC ALKALOID Trong cây, alkaloid thường tồn dạng muối hòa tan với acid hữu vô hay dạng kết hợp với tanin Người ta chiết alkaloid khỏi nguyên liệu thực vật nhiều cách nhìn chung quy cách là: - Chiết alkaloid khỏi dược liệu dạng alkaloid base dung môi hữu - Chiết alkaloid khỏi dược liệu dạng muối dung môi phân cực (nước, cồn, hỗn hợp cồn nước acid hóa) Với vài alkaloid đặc biệt, người ta chiết xuất cách: - Phương pháp cất kéo lôi theo nước (chiết xuất nicotin từ Thuốc lá) - Phương pháp thăng hoa (chiết cafein từ Trà) Dựa vào tính tan khác dạng base dạng muối alkaloid dung mơi, người ta loại phần tạp chất khỏi dịch chiết trước định tính, định lượng hay phân lập alkaloid tinh khiết Các quy trình chiết thường sử dụng chiết xuất alkaloid từ nguyên liệu thực vật dùng cho định tính alkaloid Ghi chú: thể tích dung mơi chiết, thời gian chiết phương pháp thay đổi tùy thuộc vào dược liệu phương tiện sử dụng Giáo trình Thực tập dược liệu Chiết dung môi hữu môi trường kiềm (Phương pháp 1) Bột dược liệu (5g) - Kiềm hóa NH4OH đậm đặc (vừa đủ ẩm) - Chiết nóng 20-30ml CHCl3 (đun nóng nhẹ/BM 10 phút, lọc chiết Sohxlet) Dịch chiết CHCl3 H2SO4 2% (5ml x lần) Dịch chiết nước acid NH4OH đậm đặc → pH 10 Định tính thuốc thử chung Định tính thuốc thử đặc hiệu Chiết CHCl3 (10ml x 2-3 lần) Dịch chiết CHCl3 Định tính phương pháp sắc ký Bốc tới cắn khô Cắn alkaloid base Định tính thuốc thử đặc hiệu Giáo trình Thực tập dược liệu Chiết nước acid (Phương pháp 2) Bột dược liệu (5g) 20ml dung dịch H2SO4 2% Đun BM 15 phút, lọc (2 lần x 20ml) Dịch chiết nước acid NH4OH đậm đặc → pH 10 CHCl310ml x lần Dịch chiết CHCl3 Định tính phương pháp sắc ký Định tính thuốc thử đặc hiệu H2SO4 2% (5ml x lần) Dịch chiết nước acid Định tính thuốc thử chung Định tính thuốc thử đặc hiệu Giáo trình Thực tập dược liệu Chiết cồn acid (Phương pháp 3) Bột dược liệu (5g) 20-30ml cồn có 5% acid (sulfuric, hydrochlorid, acetic) Đun hồi lưu/BM 10 phút, lọc Dịch chiết cồn acid - Trung hòa đến pH 5-6 (nếu cần) - Bay cồn bếp cách thủy đến cắn - Hòa tan cắn nước nóng (10mlx lần), lọc Dịch chiết nước acid Định tính thuốc thử chung Định tính thuốc thử đặc hiệu NH4OH đậm đặc → pH 10 Chiết CHCl3 (10ml x 2-3 lần) Dịch chiết CHCl3 Định tính phương pháp sắc ký Định tính thuốc thử đặc hiệu Chiết với H2SO4 2% (5ml x lần) Dịch chiết nước acid Định tính thuốc thử chung Định tính thuốc thử đặc hiệu 10 Giáo trình Thực tập dược liệu 6.1 Bột dược liệu - Bột có màu vàng, khơng mùi, vị đắng Quan sát kính hiển vi thấy: - Mảnh bần tế bào hình chữ nhật, vách dày, xếp đồng tâm xuyên tâm - Sợi (có loại vách dày, có loại vách mỏng) - Sợi vách mỏng có chứa nhiều hạt tinh bột - Khối nhựa vơ định hình, màu vàng - Đám tế bào mơ cứng hình chữ nhật hay hình nhiều cạnh có vách dày, có ống trao đổi - Mảnh mạch điểm - Hạt tinh bột hình nhiều cạnh có vách dày, có tễ hình chấm hay hình - Mảnh mơ mềm tế bào hình chữ nhật, vách mỏng, xếp xen kẽ 6.2 Định tính phản ứng đặc hiệu Định tính berberin Vàng đắng Trong erlen 50ml, lắc 0,5g bột Vàng đắng với 5ml dung dịch acid Sufuric 0,5% vài phút Lọc lấy dịch chiết qua giấy lọc Cho vào ống nghiệm 3-4ml dịch chiết nước acid nhỏ vào giọt nước Javel, lắc nhẹ, dung dịch có màu đỏ máu Nếu cho thừa nước Javel màu đỏ biến 29 Giáo trình Thực tập dược liệu KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA TINH DẦU BÀI KIỂM NGHIỆM TINH DẦU SẢ CHANH VÀ TINH DẦU TRÀM Mục tiêu Sau thực hành, sinh viên phải: - Kiểm nghiệm chất pha trộn tinh dầu để phát giả mạo - Định tính citral tinh dầu sả - Định tính cineol tinh dầu tràm I CƠ SỞ LÝ THUYẾT Tính chất chung tinh dầu Tinh dầu hỗn hợp chất bay phức tạp, có cấu tạo chủ yếu hydrocarbon mono sesquiterpen, thường có mùi thơm, thu chủ yếu từ thực vật, cất kéo theo nước Đa số tinh dầu khơng có màu hay màu vàng nhạt, dạng lỏng nhiệt độ thường, tỉ trọng 1) Khi bị oxy hóa, tinh dầu bị hóa nhựa làm thay đổi tính chất lý hóa tinh dầu Các tinh dầu dễ tan dung môi phân cực ether dầu hỏa, n-hexan, benzen, cloroform, ether; tan dung môi phân cực aceton, cồn; gần không tan nước Tinh dầu thường có hay vài thành phần có hàm lượng trội hẳn thành phần lại, gọi cấu tử tinh dầu Ở trạng thái tinh khiết, cấu tử tinh dầu chất lỏng hay rắn nhiệt độ thường 30 Giáo trình Thực tập dược liệu Có thể lấy tinh dầu khỏi dược liệu chưng cất lôi theo nước, ép, chiết dung mơi hay hấp phụ, phương pháp chưng cất thông dụng Kiểm định tinh dầu Trong kiểm định tinh dầu, người ta thường thực nội dung sau: Cảm quan: màu sắc, mùi, vị thể chất tinh dầu Xác định số vật lý tinh dầu: số khúc xạ, suất quay cực, tỉ trọng, độ hòa tan cồn độ cồn khác (70%, 95% )… Các số tinh dầu thường nằm giới hạn cụ thể Xác định số góp phần vào việc kiểm nghiệm mức độ tinh khiết tinh dầu Thử tinh khiết: nhằm phát tạp chất có tinh dầu Tạp chất chất vốn khơng có (hay có giới hạn đó) thành phần tinh dầu Sự diện giới hạn cho phép tạp chất tinh dầu q trình chế tạo, bảo quản hay cố ý giả mạo Các tạp chất thường tìm kiểm nghiệm tinh dầu nước, cồn chất béo Các tạp chất cịn dầu hỏa, tinh dầu rẻ tiền… hay sản phẩm oxy hóa tinh dầu q trình bảo quản Các tạp chất nhận biết phương pháp vật lý hay hóa học Định tính, định lượng thành phần đặc trưng tinh dầu: dựa vào tính chất lý hóa đặc trưng chất, nhóm chất để xác định có mặt chất (nhóm chất) tinh dầu, gián tiếp xác nhận tinh dầu Tương tự, xác định định lượng thành phần để đánh giá chất lượng tinh dầu Đại cương tinh dầu Sả chanh citral 31 Giáo trình Thực tập dược liệu Các loài Sả chia thành nhóm sả chính, là: Sả chanh cho citral, Sả hoa hồng Sả cho citronellal Tinh dầu Sả chanh tinh dầu thu cách cất lôi nước số loài Sả [Cymbopogon citratus Stapf., C.flexuosusStapf hay C.pendulus (Ness ex Steud.) Wats., Poaceae] Tinh dầu Sả chanh chất lỏng suốt, không màu hay màu vàng nhạt, có mùi thơm đặc trưng Các số vật lý tinh dầu Sả chanh: - Chỉ số khúc xạ 20oC : 1,4910 - Năng suất quay cực 20oC : -0,62o - Tỉ trọng 20oC : 0,8986 Thành phần chủ yếu tinh dầu Sả chanh citral Citral hỗn hợp gồm đồng phân citral a citral b Citral chất lỏng khơng màu, có mùi đặc biệt Đại cương tinh dầu Tràm cineol Tinh dầu Tràm tinh dầu thu cách cất lôi nước Tràm (Melaleuca leucadendron L., Myrtaceae) Tinh dầu Tràm chất lỏng suốt, khơng màu hay màu vàng nhạt, có mùi thơm đặc trưng Các số vật lý tinh dầu Tràm: - Chỉ số khúc xạ 20oC : 1,466 - 1,472 - Năng suất quay cực 20oC : (-3o) -(-1o) - Tỉ trọng 20oC : 0,900 - 0,925 Thành phần chủ yếu tinh dầu Tràm cineol (= eucalyptol hay cajeputol) Cineol chất lỏng không màu, có mùi đặc biệt, T s: 176 - 177oC, Tnc: 1oC 32 Giáo trình Thực tập dược liệu Do cặp điện tử tự nguyên tử oxy, cineol có vai trị base Lewis, tạo hợp chất cộng hợp với brom, iod, HCl, HBr, H3PO4, resorcin…Các sản phẩm hợp chất cộng hợp bền II THỰC HÀNH Dược liệu - Tinh dầu Sả chanh - Tinh dầu Tràm Kiểm nghiệm tạp chất 2.1 Tìm nước Cho vào ống nghiệm thật khơ 1ml tinh dầu, thêm tinh thể Na2SO4 khan, lắc kỹ Nếu thấyNa2SO4 chảy ướt tinh dầu có nước Có thể dùng CuSO4 khan thay cho Na2SO4 Nếu tinh dầu có nước làm CuSO4 chuyển từ màu lam nhạt sang màu xanh dương đậm CuSO4.5H2O 2.2 Tìm dầu mỡ Nhỏ giọt tinh dầu lên miếng giấy mỏng Hơ nhẹ bếp điện cho bay hết tinh dầu Nếu tờ giấy cịn lại vết mờ có dầu mỡ Cho vào ống nghiệm 1ml tinh dầu 8ml cồn 95%, lắc Tinh dầu tan vào cồn, chất béo không tan cồn bị đẩy dạng giọt lắng xuống hay bám thành nghiệm Nếu lượng chất béo thấy dung dịch bị đục 2.3 Tìm alcol Cho vào ống nghiệm lớn, khơ 2ml tinh dầu Nút miệng ống nghiệm (không chặt) miêng bơng có gói vài tinh thể fuschin Hơ nhẹ ống 33 Giáo trình Thực tập dược liệu nghiệm đèn cồn cho hỗ hợp bốc (không đun sôi ống nghiệm) Nếu nút nhuộm đỏ tinh dầu có alcol Dùng bình Cassia có dung tích 50ml, thể tích cổ khắc vạch 1,5ml Cho vào bình 1,5ml tinh dầu cần thử 30ml nước, lắc kỹ Để yên 30 phút Tiếp tục thêm nước vào bình để đưa mức lớp tinh dầu nằm vạch số khoảng có khắc vạch cổ bình Đọc thể tích tinh dầu cịn lại Nếu thể tích tinh dầu nhỏ 1,5ml tinh dầu có alcol Định tính aldehyd tinh dầu Sả Cho vào ống nghiệm 2ml tinh dầu Sả, 2ml dung dịch NaHSO bão hòa (mới pha) Đặt ống nghiệm vào hỗn hợp sinh hàn, khuấy kỹ vài phút hợp chất cộng tạo chất giống kem Định tính cineol tinh dầu Tràm Cho vào ống nghiệm 1ml tinh dầu Tràm 1ml H3PO4 đậm đặc Đặt ống nghiệm vào hỗn hợp sinh hàn, khuấy kỹ vài phút Phức chất cộng cineol phosphat tạo thành chất kem, màu từ trắng ngà đến đỏ cam tùy theo độ tinh khiết tinh dầu 34 Giáo trình Thực tập dược liệu KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA CHẤT BÉO BÀI ĐỊNH TÍNH CHẤT BÉO XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ IOD CỦA DẦU MỠ Mục tiêu Sau thực hành, sinh viên phải: - Trình bày nguyên tắc định tính chất béo định tính số loại dầu béo - Xác định số iod dầu béo định - Trình bày ý nghĩa số iod qua đánh giá chất lượng chất béo (kết hợp với tiêu kiểm nghiệm khác) I CƠ SỞ LÝ THUYẾT Tính chất chung chất béo Chất béo sản phẩm tự nhiên, gặp động thực vật, có thành phần cấu tạo chung ester acid béo với alcol (đôi amid với amino alcol) Chất béo phổ biến ester acid béo với glycerin (glycerid hay alcyl glycerol) Chất béo dễ tan dung môi hữu phân cực yếu hay trung bình ether dầu hỏa, n-hexan, benzen, toluen, xylen, cloroform, ether…;ít tan dung mơi hữu phân cực mạnh alcol; không tan nước Có thể lấy dầu béo khỏi nguyên liệu cách ép (ở nhiệt độ thường hay nhiệt độ cao), phương pháp chiết dung môi hay phương pháp nhiệt (thắng, rán mỡ) Phương pháp ép phương pháp thông dụng điều chế dầu béo từ nguyên liệu thực vật Các chất béo có tỉ trọng