1 Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thư ruột kết không polyp di truyền ở người Việt Nam Lê Thị Lan Anh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS chuyên ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70 Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Thu thập các mẫu bệnh phẩm (máu và mô) của các bệnh nhân đã được xác định ung thư đại trực tràng và dạ dày. Nhân bản một số exon quan tâm của gen MLH1 bằng kỹ thuật (phản ứng chuỗi nhờ polymeraza) PCR. Phân tích và xác định các đột biến ở một số exon nghiên cứu bằng (phân tích đa hình cấu hình sợi đơn) SSCP và (tính đa hình độ dài đoạn giới hạn) RFLP. Giải trình tự ADN một số mẫu đã được xác định đột biến bằng sàng lọc ở bước trên. Keywords: Di truyền học; Di truyền học phân tử; Đột biến gen; Ung thư ruột kết Content MỞ ĐẦU Trong hơn 20 năm qua, những phát minh to lớn của di truyền học phân tử đã góp phần thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác ngày càng được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc phát hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh, trong đó có bệnh ung thư. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ước tính hàng năm trên thế giới có khoảng 10,1 triệu trường hợp mắc ung thư và có khoảng trên 6,7 triệu người chết do ung thư. Riêng tại Việt Nam, mỗi năm phát hiện mới khoảng 200.000 người và khoảng 75.000 người chết vì bệnh ung thư [47]. Ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer), còn được gọi là hội chứng Lynch chiếm 15% các trường hợp ung thư đại trực tràng. 2 Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về gen MLH1 được thực hiện ở rất nhiều quần thể người khác nhau. Tại Việt Nam, xét nghiệm di truyền trong chẩn đoán ung thư nói chung và ung thu đại trực tràng nói riêng hầu như chưa được thực hiện. Việc phát hiện những biến đổi di truyền trong các gen MMR liên quan đến ung thư đại trực tràng có khuynh hướng di truyền, nhằm đưa ra những kết quả nghiên cứu bước đầu về gen MLH1 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng tại Việt Nam góp phần cung cấp dữ liệu về đột biến ở gen này và mở ra hướng nghiên cứu về các gen MMR khác, ứng dụng trong chẩn đoán sớm ung thư ruột kết không polyp di truyền tại Việt Nam là rất cần thiết. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thƣ ruột kết không polyp di truyền ở ngƣời Việt Nam”. Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Phân tích di truyền thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Khoa Sinh học và Phòng Sinh học thụ thể và phát triển thuốc thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Di truyền ung thƣ 1.1.1. Khái niệm ung thư Ung thư không phải là bệnh mà là một tên chung cho một nhóm các bệnh phát sinh từ các tế bào có tốc độ tăng trưởng không kiểm soát được, có được sự bất tử, xâm lấn và khả năng di căn. Thuật ngữ “ung thư” theo nghĩa hẹp được dùng để chỉ những khối u có khả năng xâm lấn các mô xung quanh gồm các tế bào bình thường [17]. 1.1.2. Gen ung thư và gen ức chế khối u Gen ung thư (oncogenes) có thể định nghĩa là dạng gen đột biến làm tăng nguy cơ ung thư hoặc làm thúc đẩy sự phát sinh ung thư. Các gen ung thư cũng có thể được coi như các dạng alen đặc biệt của các gen bình thường xuất hiện do kết quả của đột biến [3]. Gen ức chế khối u là những gen khi bị bất hoạt không còn ức chế sự sinh sản của tế bào có thể gây tổn thương ADN và do đó cung cấp cho các khối u một lợi thế tăng trưởng. 3 1.2. Hội chứng ung thƣ ruột kết Ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer – CRC) được chia thành 3 dạng chính là rải rác, gia đình và di truyền. Ung thư đại trực tràng di truyền lại được chia thành 3 nhóm chính: Sinh polyp u tuyến theo dòng họ (FAP), Ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hội chứng Lynch) và Hội chứng giống Lynch. Hội chứng Lynch được lấy theo tên nhà khoa học đầu tiên công bố về căn bệnh này. 1.3. Hội chứng ung thƣ ruột kết không polyp di truyền (Hội chứng Lynch) 1.3.1. Đặc điểm di truyền của HNPCC HNPCC là một hội chứng di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, gây nên bởi những đột biến dòng mầm gây bất hoạt ở những gen tham gia vào hệ thống sửa chữa bắt cặp sai (MMR): MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2, trong đó chủ yếu là gen MLH1 và MSH2 [14]. 1.3.2. Đặc điểm lâm sàng và phổ khối u Không giống với FAP, HNPCC không được đặc trưng bởi số lượng tăng lên của các polyp. Ở các bệnh nhân HNPCC, thường thì số các u tuyến giống với tỉ lệ chung của quần thể. Tuy vậy, các u tuyến xuất hiện ở các bệnh nhân HNPCC có nguy cơ tiến triển thành ung thư cao hơn nhiều. [17, 36] . 1.3.3. Chẩn đoán lâm sàng Những bệnh nhân mắc HNPCC thường hình thành ung thư khi còn khá trẻ, tuổi trung bình của chẩn đoán ung thư dạ dày là 56 tuổi, với ung thư u biểu mô đường ruột là loại bệnh lý phổ biến nhất được báo cáo. HNPCC kết hợp với ung thư buồng trứng có độ tuổi chẩn đoán trung bình là 42,5, khoảng 30% được chẩn đoán trước tuổi 40 [33]. 1.4. Cơ sở phân tử của HNPCC 1.4.1. Tính bất ổn định vi vệ tinh Các vi vệ tinh được lặp lại đơn giản, thường là hai nucleotit, trên vùng không mã hóa của ADN, cũng có thể nằm trong gen hoặc ở giữa gen. Các trình tự vi vệ tinh ở các tế bào sai hỏng MMR dễ bị ảnh hưởng và có xu hướng mở rộng hoặc thu hẹp chiều dài của trình tự vi vệ tinh từ thế hệ này sang thế hệ khác. Dạng siêu đột biến dễ phát hiện này được gọi là tính bất ổn vi vệ tinh (microsatellite instability - MSI) [25, 55]. 4 1.4.2. Cơ chế sửa chữa ADN bắt cặp sai (MMR - Mismatch Repair) Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai được phát hiện đầu tiên ở vi khuẩn E. coli được gọi là con đường MutHLS. Giai đoạn đầu của MMR liên quan đến 3 gen là mutS, mutL và mutH mã hóa cho 3 protein tương ứng là MutS, MutL, MutH (H[3]. Cơ chế MMR ở eukaryota cũng hoạt động tương tự như cơ chế hoạt động ở vi khuẩn (E. coli). Ở người đã xác định được các gen có liên quan đến hoạt động của MMR gồm có các gen human mutL homolog 1 (hMLH1), human mutL homolog 3 (hMLH3), human mutS homolog 2 (hMSH2), human mutS homolog 3 (hMSH3), human mutS homolog 6 (hMSH6), human postmeiotic segregation increased 2 (hPMS2), human postmeiotic segregation increased 1 (hPMS1) [13]. Trong đó phức hợp chứa gen hMSH2 có chức năng tương đương với mutS ở E. coli, phức hợp chứa gen hMLH1 có chức năng tương ứng với mutL ở E. coli. 1.4.3. Đột biến gen MMR và nguy cơ ung thư Phân tích di truyền các gen MMR ở người cho thấy rằng trên 90% bệnh nhân mắc HNPCC là do đột biến ở hai gen MLH1 và MSH2. Riêng gen MLH1 có tần số đạt đến 1/400 và gen MSH2 là 1/500 ở nhiều quần thể [41]. Trong số tất cả các đột biến dòng mầm được báo cáo trong hội chứng Lynch, gen MLH1 có ảnh hưởng lớn nhất, ước tính chiếm khoảng 50% tổng số trường hợp, sau đó là đến MSH2 (40%), MSH6 (10%) và PMS2 (<5%). Như vậy, gen MLH1 là gen quan trọng nhất trong nghiên cứu ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC). 1.4.4. Gen MLH1 Gen MLH1 nằm trên NST số 3p21, tương ứng với vùng gen MutL ở E. coli, nằm giữa các gen TRANK1 và LRRFIP2 với 19 exon, có kích thước khoảng 57,36 kb, mARN dài 2524 bp và protein được tổng hợp từ gen MLH1 gồm 756 axit amin. 1.5. Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong nghiên cứu HNPCC 1.5.1. Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism) Kỹ thuật RFLP là một kỹ thuật phổ biến được sử dụng trong sinh học phân tử. Sản phẩm PCR sau khi được nhân lên sẽ được tiến hành cắt bằng enzym giới hạn phù hợp thành các đoạn ngắn hơn, dựa vào số lượng và kích thước của các đoạn ADN thu được mà có thể phát hiện ra những sai khác di truyền xuất hiện trong đoạn gen đó. 1.5.2. Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn (SSCP: Single Strand Conformation Polymorphism) 5 Nguyên tắc: Trong điều kiện điện di không biến tính, các mạch đơn ADN sẽ có một cấu hình nhất định tùy theo trình tự của nó. Cấu hình này được xác định bởi các liên kết nội phân tử. Các cấu hình sẽ khác ngay cả khi chỉ khác một nucleotit. Sự khác biệt này dẫn đến sự khác về khả năng di chuyển trong gel polyacrylamide. 1.5.4. Phương pháp giải trình tự ADN Nguyên tắc của phương pháp dideoxy dựa trên việc bổ sung các dẫn xuất tương ứng của các dNTP là 2’, 3’ – dideoxynucleotit (viết tắt là ddNTP) vào thành phần phản ứng tổng hợp ADN trong ống nghiệm. Do ddNTP thiếu nhóm C3’- OH nên một khi nó được gắn vào mạch ADN đang tổng hợp thì quá trình tổng hợp sẽ dừng lại. Do đó, thu được một hỗn hợp nhiều phân tử ADN được sao chép không hoàn chỉnh giống nhau ở đầu 5’ được đánh dấu và khác nhau ở đầu 3’ về chiều dài và loại nucleotit kết thúc chuỗi. Sau đó, các sản phẩm này được phân tách trên bản điện di [4]. 1.6. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài 1.6.1. Mục tiêu nghiên cứu Sàng lọc các đột biến ở một số exon trên gen MLH1 bằng các kĩ thuật PCR-RFLP và PCR-SSCP, góp phần cung cấp dữ liệu về đột biến ở gen này và mở ra hướng nghiên cứu tiếp theo cho các gen MMR khác nhằm ứng dụng trong chẩn đoán sớm ung thư đại trực tràng không polyp di truyền tại Việt Nam. 1.6.2. Nội dung nghiên cứu của đề tài  Các nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm: 1. Thu thập các mẫu bệnh phẩm (máu và mô) của các bệnh nhân đã được xác định ung thư đại trực tràng và dạ dày. 2. Nhân bản một số exon quan tâm của gen MLH1 bằng kỹ thuật PCR. 3. Phân tích và xác định các đột biến ở một số exon nghiên cứu bằng SSCP và RFLP. 4. Giải trình tự ADN một số mẫu đã được xác định đột biến bằng sàng lọc ở bước trên. Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng 6 Mẫu mô và mẫu máu được thu thập từ các bệnh nhân ung thư đại trực tràng, dạ dày đến khám và điều trị tại Bệnh viện K và Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. Mẫu đối chứng được lấy từ người không mắc bệnh được cung cấp bởi Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. 2.1.2. Hóa chất  Nhóm hóa chất dùng cho tách ADN tổng số  Nhóm hóa chất dùng cho PCR  Nhóm enzym giới hạn dùng cho phản ứng cắt: MspI, CviQI.  Nhóm hóa chất dùng cho điện di gel agarose, nhóm hóa chất SSCP  Nhóm hóa chất nhuộm và một số hóa chất khác Các hóa chất đảm bảo độ tinh sạch sử dụng trong sinh học phân tử và được cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới. 2.1.3. Thiết bị Các loại máy móc thiết bị, dụng cụ chính được sử dụng: ống eppendorf, các loại đầu côn, pipet. Máy li tâm thường, máy li tâm lạnh, máy vortex, máy Spin down, bể ổn nhiệt, cân phân tích, tủ lạnh -20 0 C, tủ hút, máy làm đá, máy PCR AmpGen 9700 (Perkin – Elmet), bộ điện di nhỏ, bộ điện di đứng, máy soi gel… 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu 2.2.2. Phương pháp tách chiết ADN tổng số 2.2.3. Xác định độ tinh sạch và hàm lượng ADN tổng số 2.2.4. Kỹ thuật PCR 2.2.5. Phân tích đa hình sợi đơn (SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism) 2.2.6. Phản ứng cắt bằng enzym giới hạn 2.2.7. Giải trình tự gen 7 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết ADN tổng số (A) (B) Hình 1. (A) Kết quả tách ADN tổng số từ mẫu mô. (B) Kết quả tách ADN tổng số từ mẫu máu. Kết quả điện di cho thấy, ADN tổng số được tách chiết từ các mẫu khác nhau đều chỉ cho 1 băng duy nhất, đậm nét với kích thước xấp xỉ băng 23,1 kb của thang chuẩn λ/ Hind III. Các mẫu ADN tổng số đảm bảo yêu cầu chất lượng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2. Phản ứng PCR 3.2.1. Kết quả tối ưu phản ứng PCR Chúng tôi đã thu được nhiệt độ gắn mồi cho kết quả tốt nhất và ổn định nhất cho mỗi exon như sau: exon 19 T m = 58 0 C, exon 18 T m = 52 0 C, exon 17 T m = 60 0 C, exon 16 T m = 61 0 C, exon 14 T m = 51 0 C, exon 13 T m = 57 0 C, exon 8 T m = 61 0 C 3.2.2. Nhân bản các exon quan tâm bằng kỹ thuật PCR (A) (B) Hình 2. (A) Sản phẩm PCR exon 8 gen MLH1. (B) Sản phẩm PCR exon 13 gen MLH1 8 (A) (B) Hình 3. (A) Sản phẩm PCR exon 14 gen MLH1. (B) Sản phẩm PCR exon 16 gen MLH1 (A) (B) Hình 4. (A) Sản phẩm PCR exon 17 gen MLH1. (B) Sản phẩm PCR exon 18 gen MLH1 (A) (B) Hình 5. (A), (B) Sản phẩm PCR exon 19 gen MLH1 Từ các kết quả thu được, có thể kết luận chúng tôi đã tiến hành nhân bản thành công 7 exon của gen MLH1: exon 8, exon 13, exon 14, exon 16, exon 17, exon 18 và exon 19 đúng kích 9 thước và rất đặc hiệu. Sản phẩm PCR nhân bản các exon có thể sử dụng được cho các bước sàng lọc đột biến gen MLH1 tiếp theo. 3.3. Kết quả phân tích SSCP (A) (B) Hình 6. (A) Kết quả phân tích SSCP exon 8 gen MLH1. (B) Kết quả phân tích SSCP exon 13 gen MLH1. Hình chữ nhật màu đỏ chỉ vị trí đột biến (A) (B) Hình 7. (A) Kết quả phân tích SSCP exon 16 gen MLH1. (B) Kết quả phân tích SSCP exon 14 gen MLH1. Hình chữ nhật màu đỏ chỉ vị trí đột biến 10 (A) (B) Hình 8. (A) Kết quả phân tích SSCP exon 17 gen MLH1. (B) Kết quả phân tích SSCP exon 18 gen MLH1. Hình 9. Kết quả phân tích SSCP exon 19 gen MLH1 Qua các kết quả phân tích SSCP thu được cho thấy, chúng tôi không phát hiện được sự sai khác nào từ các mẫu nghiên cứu của các exon 8, exon 16, exon 17, exon 18 và exon 19 gen MLH1. Tuy nhiên, ở các exon 13 (mẫu 13T6) và exon 14 (mẫu 14T19, 14T20) chúng tôi đã phát hiện được sự sai khác về số lượng băng sợi đơn so với các mẫu khác và mẫu đối chứng của người bình thường tương ứng 3.4. Kết quả phân tích đột biến bằng PCR – RFLP 3.4.1. Kết quả xử lý exon 16 bằng enzym MspI Ảnh điện di Hinh 10 cho thấy trong 50 mẫu chúng tôi nghiên cứu không có mẫu nào mang gen đột biến ở vị trí bộ ba mã hóa 582 của exon 16 gen MLH1. Tất cả các mẫu đều mang kiểu gen đồng hợp về alen kiểu dại C/C. [...]... Tiếp tục tiến hành phân tích đột biến ở các exon còn lại của gen MLH1 bằng kỹ thuật PCR-SSCP và các kỹ thuật di truyền khác (SSR, HET, DGGE ) để xác định các dạng đột biến thuộc gen MLH1 có thể có ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam 2 Mở rộng nghiên cứu các gen MMR khác (MSH2, MSH6…) nhằm xây dựng một cơ sở dữ liệu về đột biến gen MMR ở người Việt Nam References Tiếng Việt 1 Trịnh Đình Đạt (2009),... TTTCAAAACA 18T19R 18B19R 18B19R 18B19R Hình 16 Kết quả so sánh trình tự exon 18 của mẫu máu và mẫu mô từ bệnh nhân số 19 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Từ những kết quả thu được với việc ứng dụng kỹ thuật PCR-SSCP và PCR-RFLP trong phân tích đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thư đại trực tràng không polyp di truyền, chúng tôi đưa ra kết luận như sau: 15 1 Đã tách chiết thành công... băng điện di khác biệt ở exon 18 gen MLH1 từ các bệnh nhân số 19 và bệnh nhân số 20 khi so sánh với đối chứng, sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP 5 Đã phát hiện được một đột biến ở thể dị hợp tử thay thế nucleotit G>A tại vị trí 203 trên exon 13 từ mẫu mô bệnh phẩm của bệnh nhân số 6 (mẫu 13T6), một đột biến thay thế nucleotit C>G tại vị trí 176 và một đột biến thay thế T>A ở vị trí 185 thuộc exon 14 gen MLH1 từ... exon 14 gen MLH1 từ mẫu mô bệnh phẩm người số 19 (mẫu 14T19) bằng giải trình tự gen 6 Những sai khác về mô hình điện di SSCP và RLFP cũng như những thay đổi trình tự nucleotit đều được phát hiện ở các mẫu mô, không phát hiện được ở các mẫu máu tương ứng Điều này chứng tỏ những đột biến mà chúng tôi xác định được đều là các đột biến soma II KIẾN NGHỊ Trên cơ sở kết quả nghiên cứu này, chúng tôi có một... thành công 7 exon quan tâm của gen MLH1, bao gồm việc thiết kế các cặp mồi đặc hiệu và tối ưu hóa phản ứng PCR 3 Đã phát hiện được các mẫu phân đoạn gen MLH1 từ những bệnh nhân có mô hình phân tích băng điện di khác biệt ở các exon 13 (mẫu 13T6) và exon 14 (mẫu 14T18 và 14T19) gen MLH1 khi so sánh với đối chứng, sử dụng kỹ thuật PCR-SSCP 4 Đã phát hiện được các mẫu phân đoạn gen MLH1 từ những bệnh... và sản phẩm PCR exon 16 điện di trên gel agarose 2% 3.4.2 Kết quả xử lý exon 19 bằng enzym CviQI Hình 11 Sản phẩm cắt exon 19 bằng enzym CviQI điện di trên gel polyacrylamide 12% Kết quả trên tương ứng với dự đoán là tất cả các đối tượng nghiên cứu đều mang kiểu gen đồng hợp tử C/C, tức là không có cá thể nào mang gen đột biến ở vị trí bộ ba mã hóa 718 của exon 19 3.4.3 Kết quả xử lý exon 18 bằng enzym... “Hereditary colorectal cancer” Semin Oncol, 18: 337 – 366 34 Lynch HT, de la Chapelle A (1999), “Genetic susceptibility to nonpolyposis colorectal cancer”, J Med Genet; 36: 801-818 19 35 Manuel Perucho, (2000), “Genetic and Epigenetic Modification of MLH1 , American Journal of Pathology, 157: 1052-1053 36 Marra G, Boland CR (1995), “Hereditary nonpolyposis colorectal cancer: the syndrome, the genes... điện di trên gel polyacrylamide 12%, Hình chữ nhật màu đỏ chỉ vị trí đột biến 11 Kết quả chúng tôi thu được khi tiến hành phản ứng cắt với mẫu T19 và T20 có số lượng băng giống với kết quả chúng tôi dự đoán nếu có đột biến xảy ra tại vị trí nucleotit 2104 (G A) với kiểu gen dị hợp G/A Để khẳng định kết quả thu được, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự ADN exon 18 từ hai bệnh nhân này 3.5 Kết quả... 13T6-R ĐC 13T6-R (B) Hình 13 (A) Kết quả so sánh trình tự exon 13 của đối chứng và bệnh nhân số 6 (mẫu 13T6-R) (B) Trình tự ngược của exon 13 gen MLH1 cho thấy có đột biến ở thể dị hợp tử thay thế tại vị trí 203 G>A (vị trí mũi tên) 3.5.2 Kết quả phân tích trình tự exon 14 từ mẫu T19 Khi so sánh với trình tự ADN đối chứng, chúng tôi nhận thấy có hai biến đổi ở trình tự gen của bệnh nhân 19 so với đối... (A) (B) 13 14T19F ĐC 14T19F Hình 14 (A) Kết quả so sánh trình tự exon 14 của đối chứng và bệnh nhân số 19 (mẫu 14T19) (B) Trình tự xuôi của exon 14 gen MLH1 cho thấy có đột biến thay thế tại vị trí 176C>G và một đột biến thay thế ở vị trí 185T>A 3.5.3 Phân tích trình tự exon 18 từ mẫu T20 Chúng tôi nhận thấy có sự tương đồng 100% giữa ADN của exon 18 ở hai mô này Kết quả cho thấy sự phát sinh khối u tại . 1 Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thư ruột kết không polyp di truyền ở người Việt Nam Lê Thị Lan. hiện đề tài Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thƣ ruột kết không polyp di truyền ở ngƣời Việt Nam . Đề tài được thực