Phân tích đột biến gen tARN ND3 ADN ty thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng Nguyễn Thị Ngọc Tú Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn: PGS.TS Trịnh Hồng Thái Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Tổng quan đột biến Gen tARN ND3 ADN ty thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng: Ty thể; Ung thư đại trực tràng; Đột biến ADN ty thể bệnh ung thư đại trực tràng Tiến hành nghiên cứu: Tách chiết ADN tổng số từ mô; Khuế ch đa ̣i đoa ̣n gen 10398 đoạn gen 3243 ADN ty thể bằ ng PCR ; Phân tích RFLP; Điện di kiểm tra sản phẩm PCR sản phẩm cắt enzym giới hạn; Tinh ADN Trình bày đánh giá kết đạt được: Kết phân tích đột biến điểm A3243G Gen tARN Ty thể kỹ thuật PCR-RFLP; Kết phân tích đa hình A10398G Gen ND3 ADN Ty thể kỹ thuật PCR-RFLP Keywords: Sinh học thực nghiệm; Đột biến gen; Ung thư đại trực tràng; Ty truyền học hóa sinh thể; Di Content MỞ ĐẦU Ty thể bào quan phổ biến tế bào nhân chuẩn Ty thể coi trung tâm lượng tế bào, diễn q trình chuyển hóa hợp chất hữu thành lượng mà tế bào sử dụng ATP Ngoài ra, ty thể cịn đóng vai trị quan trọng nhiều q trình chuyển hóa khác apoptosis (q trình tự chết tế bào), điều khiển tín hiệu Calci, điều khiển trình trao đổi chất tế bào, tổng hợp nhân Heme, tổng hợp Steroid [32] Cho đến nay, người ta thống kê 150 bệnh di truyền theo mẫu hệ khác ADN ty thể định Các bệnh rối loạn ADN ty thể thường biểu đa dạng, chúng liên quan đến rối loạn q trình mã hóa protein đơn đột biến thay đổi nucleotide [57] Trong vài năm trở lại đây, rối loạn ty thể liên quan đến bệnh ty thể xem mục tiêu nghiên cứu di truyền học y học Đặc biệt, hướng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể thị sinh học phát triển nhanh chóng nhiều lĩnh vực khác liên quan đến bệnh chuyển hóa gặp, lão hóa, xác định đặc tính di truyền quần thể sử dụng dấu chuẩn di truyền mẹ… Trong số lĩnh vực phải kể đến ung thư – đề tài thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học Ung thư đại trực tràng loại ung thư phổ biến giới, đứng hàng thứ hai sau ung thư phế quản nam giới ung thư vú nữ giới Trên giới có khoảng 3,5 triệu bệnh nhân mắc bệnh hàng năm có thêm khoảng 600000 trường hợp phát [79] Ở Việt Nam, ung thư đại trực tràng chiếm tỷ lệ cao, đứng thứ hai tỷ lệ mắc bệnh ung thư đường tiêu hóa, đứng sau ung thư dày Để đạt hiệu điều trị tốt bệnh nhân cần chẩn đoán sớm tốt Với phát triển khoa học, ngày nghiên cứu mức độ phân tử, có nghiên cứu đột biến ADN ty thể, ngày góp phần vào cơng tác chẩn đốn điều trị bệnh có hiệu Trong khuôn khổ luận văn này, tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân tích đột biến gen tARN ND3 ADN ty thể bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng” với mục đích:  Phát đột biến gen tARN ND ADN ty thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng kỹ thuật PCR-RFLP  Đánh giá mối liên quan giữa đột biến gen tARN ND ADN ty thể với đặc điểm lâm sàng bê ̣nh ung thư đại trực tràng người Việt Nam Đề tài thực phòng Proteomics Sinh học cấu trúc thuộc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Chƣơng 1- TỔNG QUAN 1.1 TY THỂ 1.1.1 Hệ genome ty thể Ty thể có chứa ADN, hệ di truyền tự lập khác với hệ di truyền nhân tế bào ADN ty thể phân tử sợi kép, dạng vịng có kích thước 16569bp, gồm hai chuỗi khác thành phần nucleotide: chuỗi nặng có chứa nhiều guanine, chuỗi nhẹ chứa nhiều cytosine Chuỗi nặng mã hóa cho 28 gen, chuỗi nhẹ mã cho gen tổng số 37 gen hệ gen ty thể Trong 37 gen có 13 gen ghi mã cho 13 chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa Số gen cịn lại ghi mã cho 22 tARN, rARN có vai trị dịch mã ty thể [10] (hình 1) Các chuỗi polypeptide cịn lại cần thiết cho cấu trúc chức ty thể ghi mã genome nhân tổng hợp ribosome tế bào chất Các nghiên cứu ADN ty thể cho thấy hệ gen ty thể có đặc trưng riêng, phân biệt với hệ gen nhân Hệ gen ty thể có đặc tính di truyền theo dịng mẹ, có từ vài trăm đến vài nghìn copy tế bào Các tế bào khác có số lượng copy khác nhau, tùy thuộc vào nhu cầu lượng mô [60] Hệ gen ty thể khơng có vùng intron gen khơng có, có bazo khơng mã hóa chúng Trong nhiều trường hợp khơng xuất codon kết thúc mà có polyadenin hóa sau phiên mã D- Loop vùng hệ gen ty thể không tham gia mã hóa Vùng D-Loop có kích thước 1,1 kb chứa yếu tố quan trọng cho trình phiên mã dịch mã chứa promoter phiên mã chuỗi nặng chuỗi nhẹ, có vùng gắn với yếu tố phiên mã ADN ty thể…Khi vùng D-Loop xảy đột biến ảnh hưởng tới tính tồn vẹn chuỗi polypeptide mã hóa ty thể [41] Hình Sơ đồ cấu tạo ADN ty thể ngƣời [ 75] Các đặc điểm hệ gen ty thể khơng có intron, khơng có histon bảo vệ, lại phân bố gần chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa, nơi mà gốc tự tạo trình phosphoryl hóa oxy hóa, làm cho khả bị đột biến ADN ty thể cao nhân (khoảng 10 lần) [51] Bởi ADN ty thể có nhiều nên phân tử bị đột biến tồn với dạng dại (wild type) không bị đột biến, tạo nên tượng không đồng (heteroplasmy) ADN ty thể dạng đồng (homoplasmy) tất genome ty thể Trong nhiều trường hợp, đột biến dạng heteroplasmy không gây biểu lâm sàng hay biểu hóa sinh đạt tới ngưỡng đột biến [51] Vì vậy, xác định mức độ không đồng đột biến ADN ty thể có ý nghĩa cao chẩn đốn bệnh ty thể 1.1.2 Đột biến ADN ty thể bệnh ty thể Những đặc điểm hệ gen ty thể phát từ đầu năm 1980, tới năm 1988 đột biến có liên quan tới bệnh tìm thấy [68] Bệnh ty thể thuật ngữ dùng để nhóm bệnh gây hư hại trình tạo ATP Khi lượng ATP sinh thấp nhu cầu tối thiểu mơ bệnh ty thể xuất hư hỏng protein tham gia vào chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa Số lượng phân tử ADN mô, quan khác có nhu cầu lượng khác Bởi vậy, mô bị ảnh hưởng nhiều đột biến ADN ty thể hệ thống thần kinh trung ương, xương, tim, thận, gan, tụy Các bệnh mô tả rõ dựa biểu lâm sàng, hình thái hóa sinh, bệnh khó nhận biểu lâm sàng bệnh biến đổi khởi đầu bệnh diễn âm thầm, đặc biệt giai đoạn đứa trẻ nhỏ [57] Tuy nhiên, nay, tiến phương pháp sinh học phân tử, việc xác định bệnh ty thể có nhiều khả quan Các nghiên cứu dịch tễ học năm gần cho thấy bệnh ty thể bệnh liên quan đến đột biến gen phổ biến người, ảnh hưởng tới 5000 người quần cư dân [22] (hình 2) Hình Các bệnh liên quan đến rối loạn ADN ty thể [64] Cho đến có 150 đột biến ADN ty thể gây bệnh người phát Các bệnh xuất giai đoạn đời, từ đứa bé sinh đến người trưởng thành lứa tuổi Ngoài ra, nhiều đột biến di truyền theo dòng mẹ, mà chẩn đốn cho người dùng cho nhiều hệ gia đình [57] Các nghiên cứu cho thấy đột biến ADN ty thể có liên quan đến tình trạng cơ, thần kinh tim mạch Các đột biến ty thể gây bệnh bao gồm đột biến điểm đột biến đoạn có liên quan tới bệnh người, hầu hết số ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương ngoại biên 1.1.3 Đột biến ADN ty thể bệnh ung thƣ Mối liên quan chức ty thể với bệnh ung thư Otto Warburg lần phát từ năm 1930, ông giả thiết tăng tốc độ q trình đường phân hiếu khí nhiều loại mô u hư hại chuỗi hô hấp tế bào [70] Theo Warburg, số biến đổi ty thể có liên quan đến ung thư đột biến ADN ty thể, biến đổi biểu hoạt động tiểu đơn vị chuỗi hô hấp Hoạt động chuỗi hơ hấp ty thể có liên quan với tạo thành loại oxy phản ứng (Reactive oxygen species _ ROS) Trong điều kiện electron bị thừa mức (ví dụ nhu cầu calo tăng lên), ức chế phức hệ enzym chuỗi hô hấp, ROS tạo nhiều Sự tăng ROS, stress oxy hóa gây đột biến ADN ty thể nhân, làm hư hại thành phần lipid protein nội bào Hệ gen ty thể đặc biệt dễ dàng chịu tác dụng ROS phân bố gần chuỗi hô hấp, khả sửa chữa sai hỏng bị giới hạn [51] Đột biến ADN ty thể gây biểu khác thường tiểu đơn vị thuộc chuỗi vận chuyển điện tử mã hóa ADN ty thể, dẫn đến làm giảm độ hoạt động chuỗi vận chuyển điện tử, giảm khả phosphoryl hóa oxy hóa Khi chuỗi vận chuyển điện tử bị suy giảm chức năng, tác động đến trình tạo thành ATP ROS, làm biến ðổi biểu số gen nhân, tác động đến q trình điều hịa protein q trình tổng hợp nucleotide tế bào Như biến đổi hệ gen ty thể có liên quan đến bệnh ung thư [27] Một số đột biến ADN ty thể xác định nhiều loại ung thư khác nhau, ung thư vú, đại trực tràng, buồng trứng, ruột, gan, tụy, tuyến tiền liệt, phổi…Đột biến ADN ty thể xuất vùng ghi mã vùng khơng ghi mã [19] (hình 3) Cho đến nhiều dạng biến đổi ADN ty thể xác định ung thư Các biến đổi bao gồm: đột biến điểm, thêm base, lặp đoạn, đoạn thay đổi số lượng ADN ty thể Hình Genome ty thể với đột biến bệnh ung thƣ [19] Đột biến điểm Phân tích đột biến ADN ty thể bệnh ung thư vú, Tan cs (2002) giải trình tự genome ty thể 19 cặp mơ ung thư mơ bình thường bệnh nhân cho thấy có 74% bệnh nhân mang đột biến soma, có 81,5% đột biến thuộc vùng D-loop, phần lại (18,5%) xác định gen 16S rRNA, ND2 ATPase [58] Trong số đột biến trên, đột biến thêm base chiếm 42% thuộc vùng D-Loop, lại 52% đột biến điểm thuộc vùng ghi mã không ghi mã [55] Đột biến ADN ty thể tìm thấy bệnh ung thư đại trực tràng Polyak cs tìm thấy đột biến ADN ty thể vùng ghi mã ND1, ND4, ND5, cytochrome b, COXI, COXII COXIII, gen rRNA 12S 16S [53] Với bệnh ung thư buồng trứng, Liu cs xác định 60% đột biến ADN ty thể, phần lớn dạng đồng (homoplasmy) hầu hết đột biến điểm T→C G→A Bốn vùng có đột biến D-Loop, 12sRNA, 16S rRNA cytochrome b, chứng tỏ vùng vùng nóng có khả bị đột biến cao bệnh ung thư buồng trứng [45] Phân tích bệnh ung thư dày, Wu cs xác định 48% mang đột biến soma vùng D-Loop, số có tới 67% đột biến thêm base vị trí nucleotide 303309 (vị trí D310) [72] Mất đoạn ADN ty thể bị đoạn lớn, đoạn 4977 bp, xác định ung thư vú [14], ung thư đại trực tràng [21] Trong nghiên cứu khác, Burgart cs tìm thấy đột biến đoạn nhỏ (50bp) vùng D-Loop 4/32 (12,5%) bệnh nhân ung thư dày [17] Thêm đoạn Wu cs xác định đột biến thêm đoạn nhỏ (≈260bp ≈520bp) vùng DLoop ADN ty thể mô ung thư bệnh nhân ung thư dày [72] Hai đột biến đặc trưng có đoạn lặp lại Thay đổi số ADN ty thể Biến đổi số ADN ty thể phát nhiều loại bệnh ung thư Số ADN ty thể tăng ung thư tuyến giáp [47], ung thư phổi [15], ung thư đại trực tràng [44] Biến đổi theo hướng giảm số ADN ty thể xác định thấy bệnh ung thư vú [63], ung thư biểu mô tế bào gan [42], ung thư buồng trứng [69] Như biến đổi hàm lượng ADN ty thể có liên quan với loại ung thư Người ta cho số lượng ADN ty thể bệnh ung thư phụ thuộc vị trí đột biến bệnh ung thư Ví dụ đột biến vùng D-Loop, điều khiển nhân ADN ty thể làm giảm số copy Mặt khác, đột biến ADN ty thể gen mã hóa cho protein chuỗi phosphoryl hóa oxy hóa lại làm tăng số copy, cách để đáp ứng lại chức ty thể [38] 1.2 UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.2.1 Khái quát ung thƣ đại trực tràng Ung thư đại trực tràng hay gọi ung thư ruột kết (colon cancer) bao gồm ung thư đại tràng ung thư trực tràng Đại tràng phần ruột lớn hình chữ N bao gồm đoạn ruột kết lên (ascending colon), đoạn ngang (transverse colon) đoạn xuống (descending colon) Trực tràng (rectum) phần ruột thẳng để chứa phân, nối đại tràng hậu mơn (hình 4) Ung thư thường xảy đoạn nối đại tràng trực tràng, thường hai loại ung thư có liên hệ với khó xác định ung thư xảy trước, ung thư xảy sau thường gọi chung ung thư đại trực tràng [79] Hình Hình ảnh đại trực tràng [76] Ung thư đại trực tràng loại ung thư phổ biến giới nay, chiếm tỉ lệ cao thứ trường hợp chẩn đoán ung thư Hàng năm, giới có khoảng triệu ca mắc nửa triệu ca tử vong Tỉ lệ mắc bệnh không giống nhau, ước tính tỉ lệ bệnh nhân nước phát triển (Mỹ, Nhật) cao gấp 4–10 lần nước phát triển Trên thực tế, số lượng bệnh nhân hai nhóm nước gia tăng nhanh chóng già hóa dân số đời sống ngày nâng cao Ung thư đại trực tràng thường được phát giai đoạn sau 45–50 tuổi, tuổi 70 đa số (khoảng ½ số người), nhiên bệnh có xu hướng trẻ hóa chế độ ăn uống, sinh hoạt, sử dụng nhiều rượu bia, thuốc [78] 1.3 ĐỘT BIẾN ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.3.1 Đột biến gen tARN ADN ty thể Đột biến điểm tARN ty thể đột biến chiếm phần lớn đột biến ty thể gây bệnh ty thể Hai đột biến tARN phát A8344G tRNALys A3243G tARN Leu(UUR) phổ biến nghiên cứu nhiều Đột biến A3243G có liên quan đến nhiều biểu lâm sàng thường gây hội chứng MELAS [31] MELAS bị gây đột biến khác tARN Leu(UUR) Đột biến A8344G liên quan đến chứng MERRF, bệnh thần kinh Bệnh cịn bị gây vài đột biến khác tRNALys [56] Ngồi ra, kể đến đột biến A7445G tARNSer(UCN) có liên quan đến bệnh thính giác [54], đột biến A4269G tRNAIle gây bệnh liệt tim liệt mắt tiến triển mãn (CPEO) [59] (hình 6) Hình Một số đột biến điểm tARN ty thể ngƣời [59] Đột biến A 3243G gen MT -TL1 mã hóa cho tRNA tiên là mô ̣t nguyên nhân di truyề n của b Leu (UUR) đã được phát hi ện đầ u ệnh MELAS [31] Đột biến A 3243G liên quan tới MELAS là mô ̣t tro ng số những đô ̣t biế n gây bê ̣nh phổ biế n nhấ t của ty thể với tầ n số đư ợc xác định khoảng từ 0,95- 18,4/100000 dân số B ắc Âu [22] Đột biến điểm mtDNA A 3243G được gây bởi sự thay thế Adenine ở vi trí ̣ 3243 thành Guanine gen mã hóa cho tRNA Leu (UUR) ADN ty thể Đột biến làm thay đổi nucleotide ba đối mã dẫn đến ảnh hưởng tới trình tổng hợp protein ty thể và giảm hoa ̣t đô ̣ng của ph ức hệ chuỗi hô hấ p [28] 1.3.2 Đa hình A10398G Vị trí nucleotide 10398 gen ND3 hệ genom ty thể người có tính đa hình cao Đa hinh làm biến đổi Threonine (alen A) thành Alanine (alen G) đầu C đơn vị ̀ ND3 phức hệ I chuỗi hô hấp Đa hình 10398A tăng bệnh thối hóa thần kinh tuổi già bệnh Parkinson [66], Alzheimer [65], bệnh teo xơ cứng [48] Ngoài nghiên cứu nhà khoa học Trung Quốc đã cho thấ y alen G thay thế 10398AG làm tăng nguy gây hội chứng chuyển hóa [34] A10398G SNP thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học có liên quan với việc tạo thành khối u Canter cs (2005) lần phát mối liên quan đa hình 10398A với bệnh ung thư vú người phụ nữ Mỹ gốc Phi, không thấy mối liên hệ người Mỹ da trắng Các tác giả cho tương tác yếu tố gen mơi trường gây khác tộc người [18] Tuy vậy, số nghiên cứu khác đối tượng phụ nữ Mỹ gốc Phi khơng thấy vai trị đa hình 10398A phát triển ung thư vú [55] Trong nghiên cứu này, tác giả giải thích khác kết nghiên cứu khác điều kiện khu vực địa lý khác Bai cs (2007) nghiên cứu 156 người phụ nữ Mỹ gốc Âu mắc bệnh ung thư vú 260 mẫu đối chứng thấy 10398G có liên quan với làm tăng nguy ung thư vú [12] Một nghiên cứu độc lập khác phát 10398G có liên quan với phát triển ung thư vú đối tượng người Ba Lan [25] Khi nghiên cứu đối tượng người Mỹ gốc Phi mắc ung thư tiền liệt tuyến, người ta thấy 10398G làm tăng tỷ lệ mức độ ác tính bệnh Trong nghiên cứu khác, 10398G tìm thấy bệnh ung thư tuyến giáp [74] Nghiên cứu Choi cs (2011) xác định vị trí 10398 gen ND3 điểm nóng gây đột biến bệnh ung thư phổi [23] Theo trình tự ADN ty thể sửa lại Cambridge, base kiểu dại A, nhiều quần thể G lại kiểu dại [11] Kết nghiên cứu đa hình A10398G cịn nhiều trái ngược chưa kết luận alen có liên quan đến bệnh lý 1.3.3 Các phương pháp phát đột biến gen ty thể giúp chẩn đoán bệnh Các đột biến ADN ty thể phần lớn dạng không đồng (heteroplasmy), đặc điểm lâm sàng bệnh biểu tỷ lệ không đồng đạt đến mức độ định tùy thuộc vào loại mô, tế bào Bởi để chẩn đốn bệnh xác kịp thời, người ta thường sử dụng kỹ thuật phân tích trực tiếp ADN ty thể Phương pháp PCR-RFLP Phương pháp sử dụng phổ biến để xác định đột biến điểm ADN ty thể PCR-RFLP Đây kết hợp kỹ thuật PCR với kỹ thuật xác định đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (RFLP) Đầu tiên, đoạn ADN ty thể có chứa đột biến nhân lên PCR với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR sau cắt enzym giới hạn thích hợp Cuối cùng, đột biến nhận biết qua phổ băng điện di Phương pháp PCR-RFLP giúp phát đột biến thuận lợi, nhanh chóng khơng địi hỏi trang thiết bị đắt tiền Phương pháp giải trình tự Để khẳng định xác đột biến, người ta phải xác định trình tự nucleotide đoạn ADN mang đột biến Nguyên tắc hầu hết phương pháp giải trình tự dựa phương pháp Sanger cộng công bố năm 1977, gọi phương pháp dideoxyribonuleotide (gọi tắt phương pháp dideoxy) Phương pháp Realtime PCR Realtime PCR sử dụng phân tử phát huỳnh quang để ghi lại trình tăng lượng ADN nhân lên phản ứng PCR tỷ lệ thuận với tăng tín hiệu huỳnh quang PCR định lượng cho phép xác định số ADN ty thể ban đầu có mẫu với độ xác độ nhạy cao Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao biến tính (DHPLC) Phương pháp DHPLC sử dụng cột sắc ký kỵ nước sở sắc ký lỏng pha đảo để phân tách ADN dị sợi kép (heteroduplex) với đồng sợi kép (homoduplex) nhiệt độ tối ưu Các mạch ADN phân tách nhiệt độ cao, sau hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với hình thành ADN dị sợi kép chứa cặp ghép đơi khơng xác Các phân tử dị sợi kép có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thường [43] Nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp để sàng lọc toàn genome ty thể, vùng định ADN ty thể để xác định đột biến Để định lượng mức độ không đồng ty thể, người ta xác định mối quan hệ diện tích đỉnh sắc ký có dị sợi kép mức độ khơng đồng ty thể Phương pháp DHPLC cho phép định lượng đột biến ADN ty thể thấp tới 1% [43] 1.3.4 Tình hình nghiên cứu nƣớc Cho đến nghiên cứu đột biến ADN ty thể người Việt Nam chưa nhiều, số liệu cịn hạn chế chưa có tính hệ thống Phan Văn Chi cs (2004) nghiên cứu giải mã genome ty thể tộc người Việt Nam tìm thấy số biến đổi ADN ty thể người Việt Nam thuộc vùng D-loop, gen ND1, ND2, ND5, ND6, cytochrome b, rRNA 12S, rRNA 16S, COXI, COXII, COXIII, ATP6, ATP8 Ngoài ra, nghiên cứu tìm thấy đột biến A3243G bệnh nhân mắc bệnh MELAS (2/34 bệnh nhân mang đột biến) [2] Chu Văn Mẫn cs (2009) sử dụng phương pháp PCR-RFLP kết hợp giải trình tự ADN xác định thấy đột biến A3243G có mặt bệnh nhân mẹ bệnh nhân gia đình có người mắc hội chứng MELAS [4] Phạm Hùng Vân cs (2010) sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp ADN ty thể tách chiết từ máu bệnh nhân mang bệnh LEBER, xác định thấy 9/12 ca có đột biến ADN ty thể, số ca mang đột biến G11778A đột biến nặng thường gặp nhất, ca lại mang đột biến T14484C [8] Nhóm nghiên cứu Nguyễn Hữu Nghĩa sử dụng phương pháp giải trình tự tách dịng, xác định thấy nhiều đột biến (tại 14 vị trí) vùng D-Loop người lao động thường xuyên tiếp xúc với xạ ion hóa [5] Liên quan đến xác định đột biến ADN ty thể bệnh nhân ung thư người Việt Nam, kết thu cịn Cho đến nay, chúng tơi tìm thấy nghiên cứu đối tượng bệnh nhân ung thư vú [1] Nghiên cứu thực với số mẫu hạn chế (2 bệnh nhân) Kết phân tích cho thấy có đột biến điểm đột biến đoạn 280 bp vùng D-loop bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam Như vậy, tổng quan trên, nghiên cứu điều tra giới cho thấy đột biến ADN ty thể liên quan chặt chẽ với nhiều loại bệnh, bệnh ty thể bệnh ung thư Đối với bệnh ung thư đại trực tràng, để đạt hiệu điều trị tốt bệnh nhân cần chẩn đốn sớm, tốt Trong khn khổ luận văn này, tiến hành nghiên cứu biến đổi gen tARN ND3 ADN ty thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng với mục đích tìm mối liên quan biến đổi với đặc điểm lâm sàng bệnh, từ giúp cho việc việc chẩn đốn sớm theo dõi sau điều trị bệnh ung thư đại trực tràng tốt CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu mẫu mô bệnh nhân ung thư đại trực tràng lấy vị trí khối u vị trí lân cận khối u (cách khối u khoảng 5-10 cm) Mẫu mô sử dụng nghiên cứu gồm 61 mẫu Khoa Tế bào – Giải phẫu bệnh, bệnh viện K Tam Hiệp – Hà Nội Khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức – Hà Nội cung cấp thời gian từ tháng năm 2010 đến tháng năm 2012 Mẫu sử dụng thống kê bảng Mẫu mô đựng ống eppendorf, vận chuyển từ bệnh viện nitơ lỏng bảo quản tủ lạnh sâu âm 80C tiến hành nghiên cứu 2.1.2 Hóa chất Các hóa chất sử dụng nghiên cứu liệt kê bảng Bảng Các hóa chất đƣơ ̣c sử dụng nghiên cƣu ́ Hóa chất Mục đích Hãng cung cấp QIA amp DNA minikit QIAGEN (Đức) Tách ADN tổng số QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN (Đức) Tinh ADN Agarose Invitrogen (Mỹ) Pharmacia SDS, Acrylamide, Bis-Acrylamide (Thụy Điện di Điển) Các cặp mồi 10398, 3243 IDT (Mỹ) Master Mix 2X NEB (Mỹ) PCR Enzyme Fastdigest® HaeIII Fermentas (Đức) RFLP Enzyme Fastdigest®DdeI Các hóa chất khác như: acid boric, Tris – base, EDTA, kali phosphate, ethanol, natri carbonat, bạc nitrat… sử dụng có độ phân tích 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Để tiến hành phân tích đột biến A3243G A10398G, thực phương pháp PCR-RFLP Trước hết ADN tổng số tách chiết từ mô u mơ lân cận u Tiếp đó, đoạn ADN chứa đột biến nhân lên PCR với cặp mồi đặc hiệu Sự có mặt đoạn gen chứa đột biến kiểm tra phương pháp điện di Bước thực cắt đoạn gen enzym giới hạn thích hợp để nhận biết đột biến qua phổ băng điện di Để khẳng định kết quả, đoạn gen chứa đột biến tinh gửi giải trình tự Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN ĐIỂM A3243G CỦA GEN tARN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP 3.1.1 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô ung thƣ đại trực tràng Sử dụng kit tách chiết ADN QIAamp DNA Mini Kit hãng QIAGEN (Đức), tách chiết ADN từ 61 cặp mẫu mô (mẫu u mẫu lân cận u) 61 bệnh nhân ung thư đại trực tràng Kế t quả tách chiế t ADN tổ ng số từ các mẫu mơ minh họa hình Hình Hình ảnh điện di ADN t số tách chiết từ mô (điê ̣n di gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide) Giếng 1, 3, 5: ADN tổng số mẫu mô lân cận u Giếng 2, 4, 6: ADN tổng số mẫu mơ u Qua hình ảnh điện di ta thấy băng ADN tổng số tương đối sáng, gọn chứng tỏ hàm lượng ADN mẫu cao sạch, đủ điều kiện để tiến hành thí nghiệm 3.1.2 Kết nhân đoạn gen 3243 ADN ty thể Sử dụng cặp mồi đặc hiệu 3243 với khuôn ADN tổng số từ mơ, đoạn gen chứa vị trí 3243 ADN ty thể khuếch đại phản ứng PCR Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1,7%, nhuộm ethidium bromide, quan sát tia cực tím Kết điện di thể hình Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 3243 (điê ̣n di gel agarose 1,7%, nhuộm ethidium bromide) Giếng M100: thang chuẩn ADN 100bp Giếng (-): Đối chứng âm Giếng 1, 3, 5: Sản phẩm PCR mẫu mô lân cận u Giếng 2, 4, 6: Sản phẩm PCR mẫu mô u Kết điện di cho thấy thu sản phẩm PCR có kích thước 218bp, băng sáng, rõ nét không xuất băng phụ chứng tỏ khơng có tượng bắt cặp khơng đặc hiệu Sản phẩm PCR tiếp tục phân tích kỹ thuật RFLP để xác định đột biến 3.1.3 Kết phân tích RFLP đoạn gen chứa vị trí 3243 ADN ty thể Để xác định đột biến điểm A3243G, sử dụng phương pháp RFLP Chúng tiến hành xử lý sản phẩm PCR đoạn gen 3243 với enzyme giới hạn HaeIII HaeIII enzyme endonuclease nhận biết ADN trình tự: Trong trường hợp không có đô ̣t biế n thì đoa ̣n gen 218 bp có chứa hai vị trí nhận biết enzyme , sẽ bi cắ t thành ba đoa ̣n nhỏ có kich thước ̣ ́ 22 bp, 27 bp và 169 bp Trong trường hợp đô ̣t biế n A  G xảy thì đoa ̣n gen 218 bp sẽ có thêm m ột vị trí nhận biết enzyme giới hạn, kết đoạn gen bị cắt thành đoạn nhỏ có kích thước 22 bp, 27 bp, 72 bp và 97 bp Sản phẩm trình xử lý với enzyme cắt điện di kiểm tra với sản phẩm PCR polyacrylamide 6%, nhuộm ethidium bromide quan sát tia UV bước sóng 245 nm (hình 9) Hình Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 3243 với enzyme HaeIII (điê ̣n di gel polyacrylamide 6%, nhuộm ethidium bromide) Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp Giếng 2, 4: sản phẩm sau cắt HaeIII từ Giếng 3, 5: sản phẩm PCR từ mô u mẫu mô u Giếng 7: sản phẩm PCR từ mô lân cận u Giếng 6: sản phẩm sau cắt HaeIII từ mẫu mô lân cận u Từ kết thu hình chúng tơi nhận thấy sản phẩm PCR sau cắt HaeIII điện di xuất băng kích thước 169 bp Hai băng kích thước 22 bp, 27 bp không quan sát gel không phân tách Như giếng không xuất đột biến Chúng tiến hành cắt enzym với 61 cặp mẫu, kết thu đột biến Đột biến A 3243G gen MT -TL1 mã hóa cho tRNA tiên là mơ ̣t nguyên nhân di truyề n của b Leu (UUR) đã được phát hi ện đầ u ệnh MELAS [31] Cho đến nghiên cứu đột biến A3243G tập trung vào số bệnh thần kinh, tiểu đường Chỉ có nghiên cứu phát đột biến A3243G bệnh nhân ung thư trực tràng Lorenc cs (năm 2003) nghiên cứu đột biến ADN ty thể gồm đột biến tRNA, rRNA số gen ty thể số mẫu ung thư, phát mẫu ung thư trực tràng có đột biến A3243G dạng đồng (homoplasmic) [46] Như thấy đột biến A3243G gặp bệnh ung thư 3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA HÌNH A10398G CỦA GEN ND3 ADN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP 3.2.1 Kết nhân đoạn gen 10398 ADN ty thể Sử dụng cặp mồi đặc hiệu 10398 với khuôn ADN tổng số từ mơ, đoạn gen mang đa hình A10398G khuếch đại phản ứng PCR Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1,7%, nhuộm ethidium bromide, quan sát tia cực tím Kết điện di thể hình 10 Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 10398 (điê ̣n di gel agarose 1,7%, nhuộm ethidium bromide) Giếng (-): Đối chứng âm Giếng M100: thang chuẩn ADN 100bp Giếng 1, 3, 5: Sản phẩm PCR mẫu mô lân cận u Giếng 2, 4, 6: Sản phẩm PCR mẫu mô u Kết điện di cho thấy thu sản phẩm PCR có kích thước 246bp, băng sáng, rõ nét không xuất băng phụ chứng tỏ khơng có tượng bắt cặp khơng đặc hiệu Sản phẩm PCR tiếp tục phân tích RFLP để xác định đột biến 3.2.2 Kết phân tích RFLP đoạn gen mang đa hình A10398G Chúng tơi tiến hành xử lý sản phẩm PCR đoạn gen 10398 với enzyme giới hạn DdeI DdeI enzyme endonuclease nhận biết ADN trình tự: 5’…C/TNAG…3’ 3’…GANT/C…5’ Trong trường hợp alen A xuất vị trí 10398, enzyme DdeI có vị trí nhận biết đoạn gen khuếch đại, kết cắt hai băng kích thước 50 bp và 196 bp Trường hợp alen G xuất hiện, có thêm vị trí nhận biết DdeI, kết thu ba băng có kích thước 38 bp, 50 bp và 158 bp Các sản phẩm sau cắt điện di với sản phẩm PCR gel polyacrylamide 6%, nhuộm Ethidium bromide quan sát tia UV bước sóng 245 nm (hình 11) Hình 10 Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 10398 với enzyme DdeI (điê ̣n di gel polyacrylamide 6%, nhuộm ethidium bromide) Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp Giếng 2, 4: sản phẩm sau cắt DdeI từ Giếng 3, 5: sản phẩm PCR từ mẫu mang alen mẫu mang alen G vị trí 10398 G vị trí 10398 Giếng 6: sản phẩm sau cắt DdeI từ mẫu Giếng 7: sản phẩm PCR từ mẫu mang alen A mang alen A vị trí 10398 vị trí 10398 Từ kết thu hình chúng tơi nhận thấy sản phẩm PCR sau cắt DdeI điện di giếng số xuất băng kích thước 196 bp Như giếng là 10398A Mặt khác giếng số 2, sản phẩm PCR sau cắt xuất băng 158bp, 50bp, 38bp Đây mẫu mang alen G vị trí 10398 Chúng tiến hành cắt enzym với 61 cặp mẫu thu kết có 28 cặp mẫu mang alen A vị trí 10398 33 cặp mẫu mang alen G vị trí 3.2.3 Kết giải trình tự đoạn gen mang đột biến A10398G Sử dụng kỹ thuật RFLP, xác định đột biến A10398G số cặp mẫu Để khẳng định kết quả, tiến hành tinh sản phẩm PCR Sản phẩm PCR sau tinh lấy kiểm tra diện băng ADN Theo tính tốn, lượng ADN tinh thu nằm khoảng 200-400 ng/µl Lượng ADN đủ có đủ lượng để đem giải trình tự Sử dụng phần mềm Sequence Scanner để phân tích kế t quả giải trình tự và sử du ̣ng chương trình BLAST để so sánh trình tự thu được v ới trình tự ADN chuẩn ty thể công bố ngân hàng gen NCBI (NC_012920), xác định ểm đột biến hệ gen ty thể Với đoạn gen 10398, gửi giải trình tự mẫu (gồm hai mẫu không đột biến hai mẫu đột biến) (xem phụ lục 2) Kết giải trình tự mẫu khơng mang đột biến biểu diễn hình 12 So sánh trình tự thu được v ới trình tự ADN chuẩn ty thể công bố ngân hàng gen NCBI, thu đư ợc kết hình 13 Kết qủa giải trình tự mẫu mang đột biến A10398G biểu diễn hình 14 So sánh trình tự thu được v ới trình tự ADN chuẩn ty thể công bố ngân hàng gen NCBI , thu đư ợc kết hình 15 Hình 11 Kết so sánh trình tự mẫu mang đột biến với trình tự ADN chuẩn ty thể Kết từ hình 15 cho thấy alen G xuất vị trí 10398 mẫu mang đột biến (alen G bôi xanh) Điều cho thấy có xuất đột biến A→G Kết hoàn toàn phù hợp với kết phân tích RFLP Như kỹ thuật giải trình tự, chúng tơi xác định điểm đột biến hệ gen ty thể vị trí 10398 Kế t quả giải trinh tự còn cho thấ y có dạng biến thể khác T 10370C và C10400T Dựa ̀ vào liệu công bố Mitomap (ngân hàng liệu genome ty thể) thấy hai dạng biến thể không liên quan tới đột biến gây bệnh, mà đa hình nhóm đơn bội Đa hình C10400T thuộc siêu nhóm đơn bội M [62], cịn biến thể T10370C thuộc dạng biến thể thường, không gây bệnh [50] 3.2.4 Phân tích mố i liên quan giƣ̃a đa hinh A 10398G với các đă ̣c điể m bênh ho ̣c lâm sàng ̣ ̀ bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng Kế t quả phân tích PCR–RFLP 122 mẫu ADN tổng số 61 bệnh nhân ung thư đại trực tràng (trong có 61 mẫu ADN tở ng số của mô u 61 mẫu ADN tổ ng số của mô lân câ ̣n u) đã cho thấy có xuất đột biến ADN ty thể vị trí 10398 Tiến hành phân tích mối liên quan đột biến điểm A10398G ADN ty thể 61 bệnh nhân ung thư đại trực tràng với đặc điểm lâm sàng khác, thu kết bảng 12 Bảng Phân bố đa hình A10398G ADN ty thể bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo đặc điểm bệnh học lâm sàng Phân bố A10398G Đặc điểm Số lƣợng A 31 ≥ 50 46 < 50 15 Đại tràng 30 Trực tràng 29 (15) (15) 41,9 58,1 (18) 47,8 52,2 (22) (24) 40 60 (9) 56,7 43,3 (17) Nữ 50,0 (6) 30 50,0 (13) Nam G (13) 37,9 62,1 (11) (18) 100 Giới tính Tuổi Vị trí ung thƣ Giữa đại trực tràng (0)  5cm 22 Kích thƣớc u Giai đoạn I 16 T1-2N0M0 Giai đoạn II T3-4N0M0 Phân loại TNM 20 (9) (6) 37 63 (17) 64,3 (10) (18) 59 41 (13) (9) 37,5 62,5 (10) 40 (12) (8) 42,9 57,1 (9) (12) 100 (0) (3) 60 40 (3) (2) 52,4 47,6 (11) 28 40 60 3 Hạch 66,7 (2) (2) (9) 100 (0) (2) Giai đoạn III N1-2M0 21 T Giai đoạn IV M1 T, N Cao Mức độ biệt hóa Vừa 20 Kém ́ KÊT LUẬN Từ những kế t quả thu được chúng rút mô ̣t số kế t luâ ̣n sau : Đã tách ADN tổ ng số từ 61 cặp mẫu mô bệnh nhân ung thư đại trực tràng (bao gồm mô u mô lân cận bệnh nhân) ADN thu đạt độ cần thiết, đáp ứng yêu cầu thí nghiệm Sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại thành công các đoa ̣n gen ch ứa vị trí đột biến 3243 (kích thước 218 bp) 10398 (kích thước 246 bp) ADN ty thể từ mẫu mô bệnh nhân ung thư đại trực tràng Phân tích RFLP đã xá c đinh được tầ n xuấ t alen 10398G 54 % mô u , 54 % mô lân câ ̣n u ̣ Tính chung 54% Phân bớ đ a hình A 10398G không phu ̣ thuô ̣c vào đặc điểm bệnh học lâm sàng vị trí mơ, t̉ i, giới tinh , kích thước u, số hạch lympho, giai đoạn tiến triển bệnh, mức độ biệt hóa ́ (p>0,05) Không tim thấ y đô ̣t biế n A 3243G của ADN ty thể ở các bê ̣nh nhân ung thư đ ại trực tràng được ̀ nghiên cứu References Tài liệu tiếng Việt Đái Duy Ban (2003), "Bước đầu nghiên cứu ung thư vú bệnh nhân Việt Nam phương pháp sinh học phân tử sử dụng thị di truyền hệ gen ty thể vùng D- Loop", Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, nghiên cứu sinh học, nông nghiệp, y học, pp 825-830 Phan Văn Chi (2006), "Nghiên cứu giải mã genome ty thể tộc người Việt Nam định hướng ứng dụng" Báo cáo đề tài cấp nhà nước (mã số: KC-04-25) Nguyễn Như Hiền (2010), Giáo trình sinh học tế bào, Nhà xuất giáo dục Việt Nam Chu Văn Mẫn (2009), "Tìm hiểu bệnh ty thể người phương pháp sinh học phân tử" Báo cáo đề tài ĐHQGHN (mã số: QT-08-31) Nguyễn Hữu Nghĩa, Đặng Trần Trung Tống Quang Vinh (2008), "Đột biến hệ gen ty thể vùng D-Loop người lao động thường xuyên tiếp xúc với xạ ion hóa", Tạp chí Y học Việt Nam, 351, pp 29-34 Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình hóa sinh học thực nghiệm, Nhà xuất giáo dục Việt Nam Lê Đình Roanh Nguyễn Văn Chủ (2008), Bệnh học khối u, Nhà xuất y học Hà Nội 8 Phạm Hùng Vân, Hoàng Hiếu Ngọc Võ Quang Hồng Điểm (2010), "Các trường hợp bệnh lý thần kinh nhãn cầu LEBER xác định kỹ thuật giải trình tự DNA ty thể tách chiết từ bạch cầu bệnh nhân để phát đột biến gây bệnh", Kỷ yếu hội nghị Sinh học phân tử hóa sinh y học, pp 285-289 Tài liệu tiếng Anh Alonso A., Martin P., and Albarran C et al (1997), "Detection of somatic mutations in the mitochondrial DNA control region of colorectal and gastric tumors by heteroduplex and single-strand conformation analysis", Electrophoresis, 18, pp 682-685 10 Anderson S., Bankier A T., and Barrell B G (1981), "Sequence and organization of the human mitochondrial genome", Nature, 290(1), pp 457-465 11 Andrew R M., Kubacka I., and Chinnery P F (1999), "Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA", Nature Genetics, 23(147) 12 Bai R K., Leal S M., and Covarrubias D (2007), "Mitochondrial genetic background modifies breast cancer risk", Cancer Research, 67, pp 4687-4694 13 Bassam B J., Caetano-Anollés G., and Gresshoff P M (1991), "Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels", Analytical Biochemistry, 196, pp 80-83 14 Bianchi M S., Bianchi N O., and Bailliet G (1995), "Mitochondrial DNA mutations in normal and tumor tissues from breast cancer patients", Cytogenetics and Cell Genetics , 71(1), pp 99-103 15 Bonner M R et al (2009), "Mitochondrial DNA Content and Lung Cancer Risk", Lung Cancer, 63(3), pp 331-334 16 Booker L M et al (2006), "North American white mitochondrial haplogroups in prostate and renal cancer", Journal of Urology, 175(2), pp 468-472 17 Burgart L J et al (1995), "Somatic mitochondrial mutation in gastric cancer", The American Journal of Pathology, 147, pp 1105-1111 18 Canter J A et al (2005), "Mitochondrial DNA G10398A polymorphism and invasive breast cancer in African-American women", Cancer Research, 65(17), pp 8028-8033 19 Chatterjee A., Mambo E., and Sidransky D (2006), "Mitochondrial DNA mutations in human cancer", Oncogene, 25, pp 4663-4674 ... ty thể [38] 1.2 UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.2.1 Khái quát ung thƣ đại trực tràng Ung thư đại trực tràng hay gọi ung thư ruột kết (colon cancer) bao gồm ung thư đại tràng ung thư trực tràng Đại tràng. .. số ADN ty thể Biến đổi số ADN ty thể phát nhiều loại bệnh ung thư Số ADN ty thể tăng ung thư tuyến giáp [47], ung thư phổi [15], ung thư đại trực tràng [44] Biến đổi theo hướng giảm số ADN ty thể. .. ND3 ADN ty thể bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng? ?? với mục đích:  Phát đột biến gen tARN ND ADN ty thể bệnh nhân ung thư đại trực tràng kỹ thuật PCR-RFLP  Đánh giá mối liên quan giữa đột biến gen