Phân tích đặc điểm sinh học phân tử gen NP, gen M và gen NS của một số chủng virus cúm A/H5N1 mới xuất hiện năm 2011 tại Việt Nam Phạm Thị Duyên Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS chuyên ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40 Người hướng dẫn: PGS.TS. Lê Thanh Hoà Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Thu nhận các phân đoạn gen NP, M, NS và giải trình trình tự 3 phân đoạn gen này của một số chủng virus cúm A/H5N1 phân lập từ bệnh phẩm gây bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam năm 2011. Phân tích, so sánh sự biến đổi trình tự nucleotid của 3 phân đoạn gen NP, M, NS và trình tự amino acid suy diễn của các chủng được phân lập với một số chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới có trong Ngân hàng gen. Phân tích mối quan hệ phả hệ của các chủng virus nghiên cứu nói trên với các chủng trên thế giới dựa trên cấu trúc 3 phân đoạn gen NP, M, NS. Keywords: Sinh vật học; Vi sinh vật học; Virus cúm Content MỞ ĐẦU Virus cúm A/H5N1 thuộc nhóm virus cúm A, họ Orthomyxoviridae, bộ Mononegavirales, có đặc tính thích ứng đa vật chủ, lưu hành chủ yếu ở quần thể chim hoang dã, nguyên nhân gây bệnh đường hô hấp phổ biến và gây ra dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm từ năm 2003 đến nay. Hệ gen của virus cúm A/H5N1 có cấu trúc đặc trưng của hệ gen virus cúm A, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt mã hóa cho 11 protein khác nhau của virus. Bên cạnh các đột biến gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1) tạo ra các chủng virus mới có thể có tính kháng nguyên khác so với chủng ban đầu, sự xuất hiện đột biến và trao đổi chéo các phân đoạn gen NP, M và NS giữa các chủng virus cúm A/H5N1 đang lưu hành, có sự liên quan đến độc lực và khả năng gây bệnh của chủng virus mới. Công tác nghiên cứu giám sát chặt chẽ sự tiến hoá hệ gen cũng như các gen cấu trúc của virus cúm A/H5N1 là điều hết sức cần thiết hiện nay. Qua đó, cho phép dự báo dịch tễ học virus A/H5N1 ở mức độ sinh học phân tử giúp định hướng sử dụng vacxin phù hợp, tìm hiểu các vùng gen ổn định và đa biến giúp cho chiến lược phát triển vacxin thế hệ mới (đặc biệt là vaccine tái tổ hợp sử dụng kĩ thuật di truyền ngược (reverse genetics-based vaccine)) đặc hiệu với chủng A/H5N1 đương nhiễm. Xuất phát từ những yêu cầu trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân tích đặc điểm sinh học phân tử gen NP, gen M và gen NS của một số chủng virus cúm A/H5N1 mới xuất hiện năm 2011 tại Việt Nam”. Với các mục tiêu sau: 1- Thu nhận các phân đoạn gen NP, M, NS và giải trình trình tự 3 phân đoạn gen này của một số chủng virus cúm A/H5N1 phân lập từ bệnh phẩm gây bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam năm 2011. 2- Phân tích, so sánh sự biến đổi trình tự nucleotid của 3 phân đoạn gen NP, M, NS và trình tự amino acid suy diễn 3- Phân tích mối quan hệ phả hệ của các chủng virus nghiên cứu nói trên với các chủng trên thế giới dựa trên cấu trúc 3 phân đoạn gen NP, M, NS. CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Bệnh cúm gia cầm A/H5N1 1.1.1. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới Năm 1996, virus cúm A/H5N1 gây dịch cúm gia cầm ở Quảng Đông (Trung Quốc). Một năm sau (1997) dịch cúm gia cầm A/H5N1 xuất hiện ở Hồng Kông, đã có 6 người tử vong trong tổng số 18 người xác định nhiễm virus cúm A/H5N1 trong vụ dịch này, và là lần đầu tiên virus cúm chim lây truyền trực tiếp sang người [75]. Đặc biệt, virus cúm A/H5N1 có khả năng gây bệnh được trên người, với hàng trăm người nhiễm và tử vong trong các vụ dịch cúm gia cầm xảy ra ở các quốc gia trên thế giới [77], [80]. Virus cúm A/H5N1 được coi là virus có độc lực cao nhất cho đến nay [2], [70]. Tuy nhiên vẫn chưa có bằng chứng sinh học cho thấy chủng virus cúm A/H5N1 đang lưu hành, có khả năng dễ dàng thích ứng lây nhiễm từ gia cầm sang người và giữa người với người. Các trường hợp người nhiễm virus cúm A/H5N1 được xác định là do tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bệnh, hoặc do các yếu tố sinh học cá thể hay gia hệ có liên quan đến khả năng tăng tính cảm thụ với virus [7], [41], [80]. 1.1.2. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát lần đầu tiên vào tháng 12/2003, chỉ trong hai tháng dịch đã nhanh chóng lây lan ở 52/64 tỉnh/thành trong cả nước, đã có 3 người nhiễm và cả 3 đều bị tử vong (100%) trong vụ dịch này [53]. Cho đến nay, dịch bệnh liên tục tái bùng phát nhiều đợt hàng năm ở nhiều địa phương trong cả nước, và gần đây trong các tháng đầu năm 2012 dịch tái bùng phát trở lại ở các tỉnh: Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Sóc Trăng với 2 trường hợp tử vong trên người trong 2 tháng đầu năm 2012 [79]. 1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VIRUS CÚM A/H5N1 1.2.1. Phân loại và danh pháp virus cúm A/H5N1 - Vị trí phân loại của virus cúm A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 thuộc nhóm virus cúm A, họ Orthomyxoviridae, bộ Mononegavirales [6], virus có đặc tính thích ứng đa vật chủ, lưu hành chủ yếu ở quần thể chim hoang dã, gây bệnh đường hô hấp phổ biến và gây ra dịch cúm ở gia cầm từ năm 2003 đến nay [21]. - Kí hiệu và danh pháp virus cúm A/H5N1 Các phân nhóm virus trong nhóm virus cu ́ m A đư ợc kí hiệu theo kiểu hình phân type (serotype) kháng nguyên HA và NA , viết tắt là A/HxNy. Phân type virus cu ́ m A /H5N1 thuộc nho ́ m virus cu ́ m A , kiểu hình phân nho ́ m kha ́ ng nguyên HA la ̀ H 5 và NA là N 1, viết tắt là A/H5N1 [6], [49]. 1.2.2. Cơ chế xâm nhiễm của virus cúm A/H5N1 trong tế bào vật chủ Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm [49], [54]. 1.3. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ ĐẶC TÍNH DI TRUYỀN CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 1.3.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo của virus cúm A/H5N1 (A) (B) - Hình thái: Virus cúm A/H5N1 cũng như nhóm virus cúm A tồn tại dưới dạng các hạt virus (virions). Hạt virus (virion) có cấu trúc hình khối đa diện, đường kính khoảng 80 – 120 nm, đôi khi là dạng hình khối kéo dài thành hình sợi đường kính 20 nm và dài từ 200 - 300 nm (Hình 1.4). Phân tử lượng của một hạt virion vào khoảng 250 triệu dalton [49]. - Cấu tạo hạt virus cúm A/H5N1: Cấu tạo hạt virus cúm A/H5N1: Hạt virus cúm A/H5N1 có cấu tạo đơn giản, bao gồm: vỏ capsid và lõi là RNA sợi đơn âm (Hình 1.4). Hình 1.4. Ảnh chụp và mô hình tiểu phần virus cúm A [2]. (A: Ảnh chụp các tiểu phần virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử truyền qua. B: Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A, Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA, Capsid: vỏ virus, Lipid envelope: lớp màng bao lipid, RNA: hệ gen virus). 1.3.2. Đặc điểm sinh học phân tử hệ gen virus cúm A/H5N1 Hình 1.5. Mô hình cấu trúc hệ gen virus cúm A/H5N1 [77] (A: Các phân đoạn gen của virus cúm A. B: Cấu trúc một phân đoạn gen (RNP) của virus cúm A. PB1, PB2, PA: ba dưới đơn vị phức hợp enzym polymerase của virus). 1.3.3. Hiện tƣợng cắt - ghép mRNA ở virus cúm A/H5N1 - Đặc điểm cắt – ghép mRNA xảy ra ở phân đoạn 7 (gen M) Phân tử mRNA phân đoạn 7 của virus cúm A được cắt - ghép có biến đổi để tạo ra một số mRNA khác nhau: mRNA M2, mRNA M3 và cả mRNA4 trong một vài trường hợp (Hình 1.6) [60], [64]. Hình 1.6. Mô hình minh họa hiện tượng cắt – ghép mRNA phân đoạn gen 7 (gen M) ở virus cúm A/H5N1 [34]. Như vậy, gen M của hệ gen virus cúm A/H5N1 mã hóa cho ít nhất 2 protein là: protein nền M1 và protein nội màng - kênh ion M2, bởi các khung đọc mở khác nhau. Protein M1 gồm 252 aa được mã hóa từ một mRNA của phân đoạn M không cắt - ghép. Protein M2 gồm 97 aa được mã hóa từ mRNA M2 đã cắt - ghép từ mRNA phân đoạn MA nguyên thuỷ. - Đặc điểm cắt – ghép mRNA xảy ra ở phân đoạn 8 (gen NS) Phân đoạn gen 8 (gen NS) là phân đoạn có kích thước nhỏ nhất trong genome của virus cúm A, mã hoá 2 loại protein là protein NS1 và protein NS2 từ các mRNA riêng biệt, được tạo thành do quá trình cắt - ghép từ cùng một mRNA (Hình 1.8). Hình 1.8. Mô hình minh họa hiện tượng cắt – ghép mRNA phân đoạn gen 8 (gen NS) ở virus cúm A [34]. 1.4. CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CÁC PROTEIN NP, M VÀ NS CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 1.4.1. Protein NP (Nucleoprotein) Protein NP (nucleoprotein) là một loại protein được photphoryl hóa, biểu hiện đặc tính kháng nguyên đặc hiệu theo nhóm và tồn tại trong hạt virus liên kết với mỗi phân đoạn RNA dạng xoắn anpha, tạo thành dạng cấu trúc ribonucleoprotein [51]. Protein NP có phân tử lượng tính toán khoảng 56x10 3 Da (trên thực tế là 50- 56x10 3 Da) với khoảng 1000 phân tử /virion [45], [49]. 1.4.2. Protein đệm M (matrix protein) Protein đệm M là một trong các hợp phần chính cấu tạo của hạt virus cúm A/H5N1, gồm 2 loại: protein nền M1 và protein nội màng M2, được tạo ra bởi 2 khung đọc mở khác nhau của cùng 1 phân đoạn RNA. - Protein nền M1 Là thành phần chính của virus, phân tử lượng tính toán của M1 là 28x10 3 Da (quan sát thực tế: 25x10 3 ) có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình “nảy chồi” của virus. Với 3000 phân tử/virion, các protein nền này sẽ lót phần bên trong màng bao lipid của virion [11], [45], [49]. - Protein nội màng – kênh ion M2 Protein M2 là chuỗi polypeptide bé, có khối lượng phân tử theo tính toán là 11x10 3 Da (trên thực tế là 15x10 3 Da). 1.4.3. Protein phi cấu trúc NS (non structural protein) Protein NS1 và NS2 là hai phi cấu trúc (non structural protein) của virus cúm A được tạo ra bởi hiện tượng cắt – ghép (splicing) từ mRNA của phân đoạn gen 8 (gen NS) [54], [75] có vai trò bảo vệ hệ gen của virus, nếu thiếu chúng virus sinh ra sẽ bị thiểu năng [49]. Cụ thể: - Protein NS1: Protein NS1 được tổng hợp từ mRNA phân đoạn 8 không cắt ghép [61] trọng lượng phân tử theo tính toán là 27x10 3 Da (trên thực tế là 25x10 3 Da) [75]. NS1 có cấu trúc bậc 2 đối xứng hai bên gồm 6 nếp gấp xoắn anpha. Cấu trúc không gian 3 chiều mới của nó không giống như bất kì cấu trúc nào khác hiện tại trong cơ sở dữ liệu đặc tính protein. Mỗi chuỗi đối xứng chứa 73 aa và có khối lượng chuỗi polypeptide là 18 kDa (Hình 1.11-A) [2], [59]. 1.5. Tầm quan trọng của nghiên cứu đặc tính và biến đổi di truyền các gen NP, M và NS của virus cúm A/H5N1 Bên cạnh các đột biến xảy ra trên các gen kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) của virus cúm A/H5N1, tạo ra hiện tượng ”lệch kháng nguyên” hình thành nên các clade virus mới. Các đột biến xảy ra trên các gen NP, M và NS cùng với hiện tượng cắt – ghép gen, xảy ra ở các gen này trong hệ gen virus cúm A/H5N1, đều có liên quan đến độc tính và khả năng gây bệnh của virus. Điều đặc biệt nguy hiểm là thông qua những đột biến này cùng với sự trao đổi chéo các phân đoạn gen trong hệ gen, giữa các chủng virus cúm A/H5N1 đang lưu hành sẽ tạo ra các chủng virus mới. Các chủng virus này sẽ có thể thu nhận và tăng cường khả năng gắn vào tế bào của người bị virus xâm nhiễm. Bên cạnh đó, rất có thể những biến đổi này cũng là bước chuẩn bị cho việc phân hóa dòng virus hiện tại thành những dòng virus khác. Bởi vì đã từng có tiền lệ cho thấy, virus A/H5N1 phân hóa thành những dòng virus khác nhau như ở Trung Quốc từ 1997 tới năm 2001 có tới 6 dòng virus A/H5N1 lưu hành trên thủy cầm (đó là các dòng A, D, C, D, E và Xo). Thế nhưng đến năm 2002, xuất hiện 8 dòng virus mới là V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z+ được xác định. Cho đến nay phân type H5N1 type Z tồn tại và tiếp tục lưu hành cũng như gây dịch trên người và gia cầm và gần đây là type G, còn các type khác thì không thấy xuất hiện. Chính vì vậy, việc nghiên cứu phân tích và tìm hiểu các đặc tính di truyền ở các phân đoạn gen M, NP và NS của virus cúm A/H5N1, góp phần đánh giá khả năng biến đổi và thích nghi lây nhiễm từ gia cầm sang người, cũng như những biến đổi di truyền liên quan đến gia tăng độc lực và khả năng kháng thuốc của các chủng virus mới. Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu cũng góp phần bổ sung dữ liệu di truyền giám sát dịch tễ học phân tử virus cúm A/H5N1, làm cơ sở để nghiên cứu sản xuất vaccine thế hệ mới phòng chống dịch cúm A/H5N1 đang có diễn biến ngày càng trở nên phức tạp hiện nay. CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Mẫu bệnh phẩm Thu thập các mẫu bệnh phẩm là dịch nhày biểu mô (swab) niêm mạc hầu-họng-khí phế quản của vịt nhiễm bệnh tại các địa phương có dịch năm 2011. Mẫu được vô hoạt bằng nhiệt độ cao (đun sôi trong vài phút) và bảo quản -70 o C theo tiêu chuẩn an toàn sinh học. 2.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị 2.1.3. Hóa chất 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phương pháp thu nhận mẫu và xử lý bệnh phẩm virus cúm A/H5N1. - Phương pháp tách RNA tổng số, phương pháp thực hiện RT-PCR - Phương pháp dòng hoá sản phẩm trong vector tách dòng. - Phương pháp giải trình trình tự và truy cập Ngân hàng gen thu nhận chuỗi gen, phương pháp phân tích và xử lý chuỗi gen. - Phương pháp so sánh đối chiếu kết quả bằng chương trinh tin-sinh học. - Phương pháp xác định hệ số tương đồng và nguồn gốc phả hệ CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 2 1 M 3.1. THU NHẬN, GIẢI MÃ GEN NP, GEN M VÀ GEN NS CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 CHỦNG Dk-VN-QT800 VÀ Dk-VN- QT1603 3.1.1. Tách RNA tổng số và thực hiện phản ứng RT-PCR Hình 3.1. Kết quả kiểm tra RNA tổng số của Dk-VN-QT800 và Dk-VNQT-1603 (M: thang DNA chuẩn; giếng 1: RNA tổng số của Dk-VN-QT800; giếng 2: RNA tổng số của Dk-VN-QT1603). Kết quả hình 3.1 cho thấy, ở cả hai giếng tra mẫu RNA tổng số của Dk-VN-QT800 (giếng số 1) và Dk-VN-QT1603 (giếng số 2) đều cho kết quả là vệt sáng trắng, chứng tỏ RNA tổng số được tách chiết có chất lượng tốt. Sau khi thu được RNA tổng số sẽ được dùng làm khuôn thực hiện phản ứng RT- PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen NP, gen M và gen NS của virus cúm A/H5N1. Sử dụng bộ kit RT-PCR one- step của hãng Qiagen để thu nhận gen NP, gen M và gen NS. Tất cả các thành phần (mồi, khuôn, thành phần phản ứng) được cho vào cùng một lúc và thực hiện liên tục cả hai giai đoạn: giai đoạn chuyển đổi (RT) RNA thành cDNA và giai đoạn nhân gen (PCR). 3.1.2. Thực hiện RT-PCR, thu nhận và giải trình tự gen NP Kết quả sản phẩm RT-PCR của mỗi chủng trong nghiên cứu là một băng đơn nhất, chứng tỏ các trình tự mồi thiết kế, tiến trình thực hiện phản ứng RT-PCR, chu trình nhiệt phù hợp. Sản phẩm RT-PCR chứa toàn bộ gen NP của 2 chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN- QT1603 được thu nhận, tinh sạch sản phẩm RT-PCR và tiến hành dòng hóa vào vector tách dòng để thu nhận DNA tái tổ hợp, giải trình tự và lưu giữ gen trong plasmid. Hình 3.2B thể hiện kết quả tách DNA plasmid tái tổ hợp của gen NP tương ứng sau khi cắt bằng enzyme giới hạn EcoRI để kiểm tra đoạn DNA chèn vào. Có hai băng DNA hiển thị trên thạch agarose, một băng có kích thước khoảng 3,9 kb tương ứng với kích thước của vector pCR ® 2.1-TOPO và một băng có kích thước khoảng 1,5 kb tương ứng với đoạn DNA từ sản 2 kb 1,56 kb 2 kb 1,56 kb 3,9 kb M 1 2 A M 1 2 3 4 B 2 kb 1,027 kb 1,027 kb 3,9 kb 2 kb M 1 2 M 1 2 A B M 1 2 3 4 phẩm RT-PCR cần tách dòng. DNA plasmid tái tổ hợp được giải trình tự và thu nhận chuỗi gen NP của 2 chủng nghiên cứu. Toàn bộ gen NP gồm 1497 nucleotide mã hóa cho 498 amino acid (hình 3.3, phụ lục 1.A) Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR và DNA plasmid tái tổ hợp gen NP (A): Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR trên thạch agarose 1%, M: thang DNA chuẩn, Giếng 1 và giếng 2: sản phẩm RT-PCR chủng Dk-VN-QT800 và chủng Dk-VN- QT1603; (B): DNA plasmid tái tổ hợp cắt bằng enzym EcoRI, M: thang DNA chuẩn, giếng 1, giếng 2: DNA plasmid tái tổ hợp clone 1 và clone 2 chủng Dk-VN-QT800; giếng 3, giếng 4: DNA plasmid tái tổ hợp clone 1 và clone 2 của chủng Dk-VN-QT1603 . 3.1.3. Thực hiện RT-PCR, thu nhận và giải trình tự gen M [...]... GCACTTAAAATGCCGACTTCACGCTACCTAACTGACATGACTCTCGAAGAAATGTCAAGGGATTGGTTCATGCTC A L K M P T S R Y L T D M T L E E M S R D W F M L> TRANSLATION OF Dk-VN-QT800 -2011 -NS1 (678BP) > * 320 * 340 * 360 * ATGCCCAAGCAGAAAGTGGTGGGTTCCCTTTGCATCAAAATGGACCAGGCAATGATGGATAAAACCGTCATATTG M P K Q K V V G S L C I K M D Q A M M D K T V I L> > TRANSLATION OF Dk-VN-QT800 -2011 NS1 (678BP) 380 * 400 * 420 * 440 * AAAGCAAACTTCAGTGTGATTTTTGACCGATTAGAAACCCTAATACTGCTTAGAGCTTTCACAGAAGAAGGAGCA... AAAGCAAACTTCAGTGTGATTTTTGACCGATTAGAAACCCTAATACTGCTTAGAGCTTTCACAGAAGAAGGAGCA K A N F S V I F D R L E T L I L L R A F T E E G A> TRANSLATION OF Dk-VN-QT800 -2011 -NS1 (678BP) > 460 * 480 * 500 * 520 ATCGTGGGAGAAATCTCACCATTACCTTCTCTTTCAGGACATACTAGGGAGGATGTCAAAAATGCAATTGGCGTC I V G E I S P L P S L S G H T R E D V K N A I G V> TRANSLATION OF Dk-VN-QT800 -2011 -NS1 (678BP) > D I L G R M S K M Q L A S> DK-VN-QT800 -NS2 > Hình... DK-VN-QT800 -NS2 80 * 100 * 120 * 140 * GAACTGGGTGATGCCCCATTCCTTGACCGGCTTCGCCGAGATCAGAAGTCCCTAAGAGGAAGAGGCAACACTCTT E L G D A P F L D R L R R D Q K S L R G R G N T L> TRANSLATION OF Dk-VN-QT800 -2011 -NS1 (678BP) > 160 * 180 * 200 * 220 GGTCTGGACATCGAAACAGCTACTCGTGCGGGGAAACAGATAGTGGAGCGGATTCTGGATGAGGAATCTGATGAG G L D I E T A T R A G K Q I V E R I L D E E S D E> TRANSLATION OF Dk-VN-QT800 -2011 -NS1 (678BP)... Quốc n m 2010 (3) Phân tích m i quan hệ phả hệ từng gen riêng biệt c a toàn bộ hệ gen cho thấy chủng Dk-VNQT80 0và Dk-VN-QT1603 tập hợp trong cùng nh m với các chủng c m A/ H5N1 phân lập ở Việt Nam n m 2012 và với chủng c m A/ H5N1 phân lập trên người ở Hồ Bắc – Trung Quốc n m 2010 KIẾN NGHỊ Tiếp tục giải trình tự toàn bộ hệ gen c a các chủng virus c m A/ H5N1 m i xuất hiện trong n m 2012 và những n m tiếp... Webster R.G and Kawaoka Y (1998), "Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential", J Virol, 72, pp 73677373 36 Katz J .M (2003), "The impact of avian influenza viruses on public health", Avian Dis, 47(Suppl 3), pp 914-920 37 Keawcharoen J., Amonsin A. , Oraveerakul K., Wattanodorn S., Papravasit T., Karnda S., Lekakul K., Pattanarangsan R., Noppornpanth S., Fouchier... R .A. , Osterhaus A. D., Payungporn S., Theamboonlers A and Poovorawan Y (2005), "Characterization of the hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different avian species in Thailand", Acta Virol, 49(4), pp 277-280 38 Kodihalli S., Goto H., Kobasa D.L., Krauss S., Kawaoka Y and Webster R.G (1999), "DNA vacxin encoding hemagglutinin provides protective immunity against... clone 1 và clone 2 c a chủng Dk-VN-QT1603 DNA plasmid tái tổ hợp sau đó được giải trình tự và thu nhận được chuỗi DNA c a phân đoạn 8 ch a 2 gen NS1 g m 678 bp và NS2 g m 366 bp (Hình 3.7, phụ lục 1.C) * 20 * 40 * 60 * ATGGATTCCAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGACTGCTTCCTTTGGCATGTCCGCAAACGATTTGCAGACCAA M D S N T V S S F Q V D C F L W H V R K R F A D Q> TRANSLATION OF Dk-VN-QT800 -2011 -NS1 (678BP) > M D S N T V S S... Tsukamoto K (2011) , "NP Body Domain and PB2 Contribute to increased Virulence of H5N1 Highly Pathogenic Avian Influenza Viruses in chickens", J Virol, 85(4), pp 1834 – 1845 72 Uiprasertkul M, Kitphati R, Puthavathana P, Kriwong R, Kongchanagul A, Ungchusak K, Angkasekwinai S, Chokephaibulkit K, Srisook K, Vanprapar N, Auewarakul P (2007), "Apoptosis and pathogenesis of avian influenza A (H5N1) virus. .. nucleotide; phân đoạn gen NS có kích thước 875 nucleotide - Phân đoạn 7 (gen M) và phân đoạn 8 (gen NS) xảy ra hiện tượng cắt – nối exon (splicing) tạo ra các sản ph m gen khác nhau (2) Chủng Dk-VN-QT80 0và Dk-VN-QT1603 có m c độ đồng nhất (về nucleotide) và tương đồng (về amino acid) cao ở tất cả 3 phân đoạn gen với các chủng c m A/ H5N1 phân lập ở Việt Nam n m 2012 và với chủng c m A/ H5N1 phân lập trên... humans", Emerg Infect Dis, 13(5), pp 708- 718 73 Wagner R, Matrosovich M, Klenk H (2002), "Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections", Med Virol, 12(3), pp 159-166 74 Wasilenko JL, Lee CW, Sarmento L, Spackman E, Kapczynski DR, Suarez DL, PantinJackwood MJ (2008), "NP, PB1, and PB2 viral genes contribute to altered replication of H5N1 avian influenza viruses . Phân tích đặc đi m sinh học phân tử gen NP, gen M và gen NS c a m t số chủng virus c m A/ H5N1 m i xuất hiện n m 2011 tại Việt Nam Ph m Thị. gen NP, gen M và gen NS c a m t số chủng virus c m A/ H5N1 m i xuất hiện n m 2011 tại Việt Nam . Với các m c tiêu sau: 1- Thu nhận các phân đoạn gen NP,