Phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn E. coli Nguyễn Văn Phòng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn: PGS.TS. Nông Văn Hải Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Tách chiết được RNA tổng số từ mô gan sinh thiết của người. Phân lập được đoạn cDNA mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô người. Thiết kế được vector biểu hiện mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người. Chuyển và biểu hiện vector mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn E. coli. Keywords: Sinh học phân tử; Gen mã hóa; Di truyền học hóa sinh Content MỞ ĐẦU “Thu hẹp khoảng cách - Kết nối cộng đồng” là thông điệp được đưa ra tại Lễ mít tinh hưởng ứng ngày Hemophilia thế giới (17/4/) diễn ra tại Hà Nội, với mong muốn cải thiện tình hình chăm sóc bệnh nhân bị bệnh Hemophilia (hay còn gọi là bệnh máu khó đông) trên phạm vi toàn cầu, hướng tới mục tiêu tất cả người bệnh máu khó đông đều có cơ hội được điều trị và chăm sóc tốt. Ở Việt Nam, theo thống kê của Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương ước tính hiện nay có khoảng 6.000 bệnh nhân bị bệnh Hemophilia, trong đó mới chỉ 20% bệnh nhân được phát hiện và chăm sóc thường xuyên. Hemophilia là một rối loạn chảy máu di truyền do bất thường gen gây nên, bệnh nhân bị chảy máu khó cầm ở khắp các bộ phận trên cơ thể, đặc biệt là cơ và khớp. Bệnh xuất hiện do cơ thể thiếu hụt hoặc không có đủ các yếu tố làm đông máu, thường gặp là yếu tố VIII (hemophilia A) và IX (hemophilia B). Trên thế giới, việc nghiên cứu và sử dụng các thuốc giúp làm máu đông nhanh để điều trị bệnh Hemophilia bằng công nghệ sinh học đã được bắt đầu từ cuối năm 1980. Cho tới nay, việc áp dụng những kỹ thuật hiện đại của công nghệ gen và protein để phân lập và tách dòng cDNA nhằm sản xuất các chể phẩm protein tái tổ hợp VIII và IX trong các tế bào vi khuẩn và tế bào động vật đã phát triển vượt bậc. Người ta đã sản xuất được các chế phẩm VIII và IX có giá trị trong điều trị với giá thành hạ, sản lượng tăng, độ tinh sạch cao đáp ứng những nhu cầu cấp bách của thực tiễn. Cho đến nay, ở nước ta vẫn chưa có một công bố hay đề tài nào về nghiên cứu sản xuất yếu tố đông ma ́ u IX tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn hay tế bào động vật được thực hiện . Do 2 như ̃ ng nhu cầu cấp thiết trong điều tri ̣ bê ̣ nh Hemophilia , chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: “Phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn E. coli”, nhằm tạo ra một bước tiền đề hướng tới việc nghiên cứu và phát triển chế phẩm yếu tố đông máu IX tái tổ hợp, góp phần vào việc chăm sóc sức khỏe bệnh nhân Hemophilia trong tương lai. Đề tài thực hiện với mục tiêu cụ thể sau: 1. Tách chiết được RNA tổng số từ mô gan sinh thiết của người. 2. Phân lập được đoạn cDNA mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô người. 3. Thiết kế được vector biểu hiện mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người. 4. Chuyển và biểu hiện vector mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn E. coli. Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về bệnh Hemophilia 1.1.1. Giới thiệu chung về bệnh Hemophilia Hemophilia là một bệnh rối loạn đông máu di truyền mà trong dân gian thường hay gọi là “bệnh máu loãng”, “bệnh máu không đông” hoặc “bệnh máu khó cầm”. Bệnh này đặc trưng bởi sự thiếu hụt hoặc không có một trong các protein cần thiết cho quá trình đông máu. Một số người mắc bệnh Hemophilia do thiếu hụt yếu tố đông máu VIII, được gọi là Hemophilia A. Một số khác do thiếu yếu tố đông máu IX, được gọi là Hemophilia B. Ngoài ra, có tỷ lệ rất hiếm người mắc bệnh Hemophilia C, bệnh do thiếu hụt yếu tố đông máu XI. 1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh Hemophilia Hemophilia là bệnh rối loạn chảy máu di truyền, được gây ra bởi đột biến trong các gen mã hóa cho các yếu tố đông máu VIII, IX và XI. Tuy nhiên, có khoảng 30% trường hợp mắc bệnh Hemophilia được sinh ra từ một gia đình không có tiền sử về bệnh Hemophilia trước đó. 1.1.3. Phân loại Hemophilia Bệnh Hemophilia có thể được chia làm 3 loại chính: Hemophilia A, Hemophilia B và Hemophilia C. 1.1.4. Biểu hiện của bệnh Hemophilia Biểu hiện của bệnh rất đa dạng: chảy máu bất thường, tự nhiên hoặc sau phẫu thuật, có thể xảy ra ở bất cứ vị trí nào trên cơ thể tuy nhiên cơ và khớp thường hay bị chảy máu hơn đến nỗi nhiều người bệnh nhầm tưởng là bệnh của cơ, khớp. 1.1.5. Phƣơng pháp điều trị bệnh Hemophilia 3 Đến nay, bệnh này vẫn chưa thể điều trị tận gốc. Người bệnh phải phụ thuộc vào các loại thuốc đặc trị và bổ sung suốt đời các yếu tố đông máu lấy từ nguồn máu hiến và họ có thể chung sống với bệnh. 1.2. Vai trò của yếu tố đông máu IX trong quá trình đông máu Được tổng hợp chủ yếu ở gan sau đó được tiết vào máu, yếu tố đông máu IX đóng vai trò rất quan trọng trong việc hoạt hóa yếu tố đông máu X thành dạng hoạt hóa Fxa. 1.3. Cấu trúc gen mã hóa yếu tố đông máu IX Gen FIX là gen mã hóa cho yếu tố đông máu IX (human factor IX, protein FIX), nằm trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể giới tính X tại vị trí Xq27.1. Gen FIX có kích thước khoảng 34 kb gồm 8 exon và 7 intron. 1.4. Cấu trúc và những biến đổi sau dịch mã của yếu tố đông máu IX 1.4.1. Cấu trúc của phân tử protein FIX Ở người, phân tử protein FIX là một protein phụ thuộc vào vitamin K, tham gia vào quá trình đông máu. Phân tử protein FIX được tổng hợp ở các tế bào của mô gan dưới dạng một protein tiền chất của một serine protease-FIXa. Sau khi được tổng hợp, protein tiền chất này là một chuỗi polypeptide đơn gồm 461 amino acid, khối lượng khoảng 56 kDa. 1.4.2. Những biến đổi sau dịch mã của phân tử protein FIX 1.5. Sự hoạt hóa yếu tố đông máu IX Để yếu tố đông máu IX (protein FIX) trở thành một protease chức năng trong quá trình đông máu, đoạn peptide hoạt hóa phải được loại bỏ khỏi chuỗi polypeptide của protein FIX tiền chất. Phân tử protein FIX có thể được hoạt hóa trở thành dạng protease (protein FIXaβ) bởi phức hợp TF/FVIIa hoặc FXIa (dạng hoạt hóa của yếu tố XI) cùng với sự có mặt của màng phospholipid và ion Ca 2+ . 1.6. Vector biểu hiện pET32a Vector pET32a là một vector thuộc hệ vector pET của hãng Novagen. Đây là vector được thiết kế với mục đích để chọn dòng và biểu hiện ở mức độ cao của các gen ngoại lai ở vi khuẩn E. coli. Vector pET32a (5.900 bp) thường được sử dụng với mục đích chính là biểu hiện gen. 1.7. Chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3) E. coli BL21 là chủng được bắt nguồn từ E. coli B, được phát hiện vào năm 1946. E. coli là vi khuẩn Gram âm, kị khí tùy tiện và không sinh bào tử. Tế bào E. coli có khả năng sinh sản với tốc độ nhanh trên môi trường nuôi cấy tối thiểu, trung bình khoảng 20 phút chúng lại phân chia một lần. 1.8. Các hệ thống biểu hiện dùng trong tạo protein tái tổ hợp 4 Đối với dược phẩm sinh học tái tổ hợp, hệ thống biểu hiện có thể là hệ thống nhân sơ (prokaryote) hoặc nhân chuẩn (eukaryote). 1.9. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc Hướng nghiên cứu biểu hiện gen/protein có giá trị để tiến tới sản xuất sinh phẩm sử dụng trong y dược là hướng rất quan trọng, cấp thiết mới được tiếp cận nghiên cứu ở nước ta trong thời gian gần đây. Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu  Mẫu nghiên cứu Các mẫu gan sinh thiết được lấy từ những người Việt Nam khỏe mạnh do bệnh viện K cung cấp.  Chủng vi sinh vật  Chủng E.coli DH5α của hãng Invitrogen được sử dụng để chọn dòng và nhân dòng gen.  Chủng E. coli BL21(DE3) của hãng Bio-Rad được sử dụng để biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông máu IX ở người.  Các vector  Vector tách dòng: pJET1.2/blunt (Fermentas).  Vector biểu hiện: pET32a (Novagen).  Các cặp mồi Các cặp mồi dùng để phân lập, chọn dòng và biểu hiện gen được thiết kế dựa trên trình tự cDNA chuẩn công bố trên Genbank (NM_000133) và đặt tổng hợp hãng IDT (Mỹ) có trình tự như sau: Bảng 1. Trình tự các cặp mồi được sử dụng. STT Tên mồi Trình tự nucleotide 1 FIX-F1 5’- GCT AGC AAA GGT TAT GCA GCG C- 3’ FIX-R1 5’- GGA AAT CCA TCT TTC ATT AAG TG- 3’ 2 FIX-F4-NcoI 5’-TTC TGG TGC ACC ATG GTT TTT CTT GAT CAT GAA AAC GCC-3’ FIX-R5- XhoI 5’- ATATG CTC GAG TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG AGT GAG CTT TGT TTT TTC C- 3’ Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết kế cặp mồi (F1/R1) để nhân toàn bộ cDNA mã hóa FIX từ mRNA được tách từ mô gan sinh thiết ở người. Trong khi biểu hiện, chúng tôi thiết kế cặp mồi (F4/R5) với mục đích nhân đoạn cDNA mã hóa FIX với chuỗi polypeptide cắt vùng tín hiệu tiết (signal peptide) ở đầu N để biểu hiện đoạn cDNA này trong tế bào vi khuẩn E. coli. Protein mã hóa từ cDNA được nhân với cặp mồi (F4/R5), kí hiệu là FIX noSP .  Hóa chất 5  Các enzyme giới hạn NcoI, XbaI, XhoI ; các hóa chất dùng cho kỹ thuật PCR (đệm, MgCl 2 , dNTPs, enzyme Taq DNA polymerase, enzyme Pfu DNA polymerase được đặt mua tại hãng Fermentas.  Các hóa chất dùng để tách RNA, DNA plasmid hay điện di protein của hãng Amersham Bioscien (Anh), BioRad (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merk (Đức).  Các bộ Kit tổng hợp cDNA, tinh sạch sản phẩm PCR, tinh sạch DNA plasmid của hãng Promega (Mỹ), Invitrogen (Mỹ).  Trang thiết bị Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các trang thiết bị của Viện Công nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu hệ gen. 2.2. Phƣơng pháp 2.2.1. Tách chiết RNA tổng số Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô gan sinh thiết người bằng Trizol. 2.2.2. Tổng hợp cDNA cDNA sợi một được tổng hợp từ khuôn RNA tổng số được tiến hành theo hướng dẫn của Kit tổng hợp cDNA SuperScript TM First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). 2.2.3. Nhân đoạn cDNA bằng phản ứng PCR 2.2.4. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose 2.2.5. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế Sử dụng các enzyme giới hạn cắt phân tử DNA thành hai mảnh dạng đầu bằng hay đầu dính tại các vị trí xác định nhờ trình tự nhận biết đặc hiệu. 2.2.6. Tinh chế các đoạn DNA trên gel agarose Các sản phẩm PCR bằng cách điện di chúng trên gel 0,8% agarose, sau đó cắt phần gel có băng DNA mong muốn và thu lại DNA bằng Kit tinh sạch Wizard ® SV. 2.2.7. Ghép nối DNA Dưới sự xúc tác của enzyme T4 DNA ligase, các cầu nối phosphodieste sẽ được hình thành giữa hai nucleotide sát cạnh nhau trên cùng một mạch (gốc phosphat đầu 5’ của nucleotide đoạn DNA này với gốc hydroxyl đầu 3’ của nucleotide của đoạn DNA kia), đồng thời giải phóng một phân tử nước. 2.2.8. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phƣơng pháp sốc nhiệt Dưới tác dụng của CaCl 2 0,1 M, thành tế bào vi khuẩn E.coli đang ở giai đoạn sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua các lỗ xốp trên màng tế bào chất khi thay đổi nhiệt độ đột ngột. 2.2.9. Tách chiết DNA plasmid 6 Phương pháp tách chiết DNA plasmid dựa trên nguyên lý sử dụng các hóa chất (SDS, NaOH) có tác dụng phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn, biến tính các phân tử protein và giải phóng các plasmid của vi khuẩn. 2.2.10. Xác định trình tự DNA Trình tự nucleotide quan tâm được xác định trên nguyên tắc của phương pháp Sanger. 2.2.11. Biểu hiện gen mã hóa cho protein FIX Sau khi các plasmid tái tổ hợp (pET32a; pET32a/FIX noSP ) được biến nạp vào chủng E. coli BL 21(DE3), chọn các khuẩn lạc phát triển tốt nhất trên đĩa môi trường chọn lọc LBA và nuôi cấy lắc qua đêm vào môi trường LBA qua đêm ở 37 o C, 200 vòng/phút. Hòa dịch nuôi cấy qua đêm vào môi trường LBA theo tỷ lệ 1% và nuôi cấy ở cùng điều kiện trên trong khoảng thời gian 2h đến khi OD 600nm của dịch tế bào đạt 0,6 - 0,8 thì bổ sung IPTG vào môi trường nuôi cấy với nồng độ cuối cùng là 0,5 mM. Nuôi tiếp tục khoảng 3h ở 37 o C, 200 vòng/phút để tổng hợp FIX noSP -Trx. Mẫu tế bào được thu ở các thời điểm 0h, 1h và 3h sau cảm ứng. Tế bào được thu bằng cách ly tâm 6.000 vòng/phút trong thời gian 5 phút. Màng ngoài tế bào được phá bằng siêu âm. Mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE. 2.2.12. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE SDS-PAGE được thực hiện theo phương pháp của Laemmli UK, 1970 với các thiết bị của hãng Bio-Rad. Để phân tách các protein có trọng lượng từ 12 - 68 kDa, chúng ta sử dụng gel ở nồng độ 12,6% (w/v). 2.3.1. Sơ đồ thí nghiệm Nội dung nghiên cứu được chia làm hai phần và thực hiện qua các bước sau: a. Phân lập gen mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô gan sinh thiết ở người. b. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa FIX noSP và biểu hiện trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21(DE3). Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập gen mã hóa yêu tố đông máu IX ở ngƣời 3.1.1. Thu thập mẫu mô gan sinh thiết ngƣời Do yếu tố đông máu IX người được tổng hợp chủ yếu ở các tế bào mô gan nên chúng tôi đã chọn mô gan làm nguyên liệu nghiên cứu. Phối hợp với Bệnh viện K, chúng tôi đã chọn được mẫu mô gan sinh thiết từ 2 trong số 7 người. 3.1.2. Tách chiết RNA tổng số Sản phẩm RNA tổng số tách chiết từ 2 mẫu mô gan sinh thiết bằng phương pháp trizol được điện di biến tính trên gel agarose 1% (Hình 1). Kết quả điện di thể hiện rõ các băng 28S, 18S và 5S rRNA, không có hiện tượng bị phân hủy do quá trình tách chiết. 7 Hình 1. Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số trên gel agarose 1%. 1 - 2: Sản phẩm RNA tổng số của 2 mẫu mô gan sinh thiết người. Như vậy, chúng tôi đã tách chiết được RNA tổng số từ 2 mẫu mô sinh tiết gan ở người. Mẫu RNA tổng số tách từ mẫu mô gan sinh thiết của Lương Mỹ H. được sử dụng làm nguyên liệu cho việc tổng hợp cDNA mã hóa FIX ở người. 3.1.3. Tạo dòng và xác định trình tự gen FIX  Thiết kế cặp mồi và PCR Trên cơ sở trình tự mRNA mã hóa protein FIX của người đã công bố trên Ngân hàng trình tự gen Quốc tế GENBANK/DDBJ/EMBL (mã số NM_000133), chúng tôi đã thiết kế cặp mồi nhân cDNA mã hóa FIX là F1/R1. Sản phẩm RT-PCR sau đó được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 2). Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR thu được một băng đặc hiệu có kích thước khoảng 1,4 kb phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết của cDNA mã hóa cho FIX. Như vậy, sản phẩm PCR đã đạt độ đặc hiệu về kích thước và đảm bảo về nồng độ để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình 2. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen cDNA mã hóa FIX trên gel agarose 0,8%. M: Marker 1 kb (Fermentas); 1: Sản phẩm PCR nhân gen FIX.  Tạo dòng đoạn cDNA mã hóa protein FIX trong vector pJET1.2 Để tạo cơ sở cho thí nghiệm thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa cho FIX, chúng tôi đã tiến hành tạo dòng phân tử sản phẩm RT-PCR (tức là nhân bản chúng trong tế bào chủ dưới dạng một plasmid tái tổ hợp mang đoạn cDNA này). 8  Tinh sạch sản phẩm PCR và gắn vào vector tách dòng  Tách chiết DNA plasmid Chúng tôi đã tiến hành tách chiết plasmid từ 11 khuẩn lạc. Sản phẩm tách chiết plasmid được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 3). Các plasmid có kích thước lớn hơn kích thước của plasmid đối chứng âm là các plasmid có khả năng mang sản phẩm RT-PCR. Từ kết quả điện di sản phẩm DNA plasmid, chúng tôi có thể sơ bộ kết luận các dòng vi khuẩn (2, 4 và 9) chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn sản phẩm RT-PCR. Hình 3. Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 0,8%. 1: Đối chứng âm (vector pJET1.2 không mang đoạn đoạn sản phẩm RT-PCR); 2- 12: Plasmid tái tổ hợp của 3 dòng vi khuẩn mang (giếng số 2, 4 và 9) và không mang sản phẩm RT-PCR (giếng số 3, 5, 6, 7, 8, 10, 11 và 12).  Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hạn chế Hình 4. Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang cDNA của gen FIX bằng enzyme hạn chế XbaI và XhoI. M: Marker 1kb (Fermentas); 1: Sản phẩm PCR của cDNA mã hóa FIX; 2, 3, 4: Sản phẩm xử lý pJET1.2/FIX_p18; pJET1.2/FIX_p19, pJET1.2/FIX_p22 bằng XbaI + XhoI; 5: Sản phẩm xử lý pJET1.2/XbaI + XhoI. Chúng tôi đã tiến hành xử lý plasmid của các dòng số hai, bốn và chín (ký hiệu: dòng pJET1.2/FIX_p18, pJET1.2/FIX_p19 và pJET1/FIX_p22) bằng hai enzyme hạn chế XbaI và XhoI. Kết quả cho thấy, plasmid của 3 dòng này khi được xử lý bằng hai enzyme nói trên đã cho hai băng: một băng có kích thước khoảng 3,0 kb (tương đương với kích thước của vector pJET1.2) và một băng có kích thước khoảng 1,4 kb (tương đương kích thước của sản phẩm PCR) (Hình 4). 9 Như vậy, đoạn cDNA mã hóa cho protein FIX đã được tách dòng thành công trong vector pJET1.2. Các plasmid tái tổ hợp được tách chiết với lượng lớn và được tinh sạch cho phản ứng xác định trình tự.  Trình tự nucleotide của FIX Để khẳng định chính xác sản phẩm tách dòng là đoạn cDNA của gen FIX, sản phẩm được tiếp tục xác định trình tự nucleotide. Sau khi phân tích trình tự cả 3 dòng plasmid tái tổ hợp, đoạn cDNA có chiều dài 1386 bp, khung dịch mã được xác định mã hóa yếu tố đông máu IX gồm 461 amino acid kể cả mã kết thúc. Khi so sánh trình tự cDNA đầy đủ của gen FIX được phân lập từ mô gan sinh thiết của người Việt Nam với trình tự trên ngân hàng GenBank (NM_000133), chúng tôi thấy ở dòng p19 có độ tương đồng là 100% ở cả mức độ nucleotide và amino acid. 3.2. Thiết kế vector biểu hiện FIX (pET32a/FIX noSP ) 3.2.1. Khuếch đại cDNA mã hóa FIX noSP Trong nghiên cứu này, vector pJET1.2/FIX_p19 đã được sử dụng làm khuôn để nhân bản gen cần biểu hiện. Trên cơ sở trình tự mRNA mã hóa FIX của người công bố trên Ngân hàng trình tự gen Quốc tế GenBank (NM_000133), chúng tôi đã thiết kế cặp mồi nhân cDNA mã hóa FIX noSP là F4/R5. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di được thể hiện ở Hình 5. Kết quả điện di đồ cho thấy, sản phẩm PCR thu được có kích thước phân tử khoảng 1,3 kb, kích thước này phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết. Băng sản phẩm PCR sáng, đậm và rõ nét đủ điều kiện cho việc tạo dòng vector tái tổ hợp. Sản phẩm PCR này được xử lý với enzyme hạn chế NcoI và XhoI, sau đó tinh sạch trước khi sử dụng để tiến hành ghép nối gen. Hình 5. Ảnh điện di đồ sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa FIX noSP . M: Marker 1 kb (Fermentas); 1 : Sản phẩm PCR của cDNA mã hóa FIX noSP nhân từ khuôn là pJET1.2/FIX (p19). 3.2.2. Ghép nối cDNA mã hóa FIX noSP vào vector biểu hiện pET32a Vector pET32a và sản phẩm PCR sau khi được xử lý với hai enzyme hạn chế (NcoI và XhoI) sẽ được tinh sạch và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trước khi thực hiện phản ứng ghép nối với nhau (Hình 6). 10 Hình 6. Ảnh điện đi đồ sản phẩm PCR và vector pET32a sau khi tinh sạch trên gel agarose 0,8%. M: Marker 1 kb (Fermentas); 1: Sản phẩm PCR (FIX noSP )/ (NcoI và XhoI); 2: Vector pET32a/( NcoI và XhoI). Trên cơ sở kết quả điện di (Hình 6), vector pET32a và cDNA mã hóa FIX noSP được ghép nối với nhau nhờ xúc tác của enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm phản ứng ghép nối gen được biến nạp vào tế bào E.coli DH5 bằng phương pháp sốc nhiệt và chọn lọc trên môi trường có bổ xung kháng sinh Amp với nồng độ 100 μg/ml. Kết quả, chúng tôi đã nhận được một số dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp. 3.2.3. Kiểm tra sự có mặt của cDNA mã hóa FIX noSP trong vector pET32a Để xác định các dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp mong muốn, chúng tôi tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc mọc trên môi trường có kháng sinh Amp, nuôi cấy thu sinh khối để tách DNA plasmid của các khuẩn lạc, cắt kiểm tra các plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hạn chế (NcoI và XhoI) và giải trình tự gen. a. Tách chiết DNA plasmid Chúng tôi tiến hành nhặt 5 khuẩn lạc và sản phẩm tách chiết plasmid được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 7). Từ kết quả điện di sản phẩm DNA plasmid, chúng tôi thấy cả 5 dòng vi khuẩn (2 3, 4 và 5) đều có kích thước lớn hơn kích thước đối chứng (1). Từ đó, chúng tôi có thể sơ bộ kết luận 5 dòng vi khuẩn này chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn cDNA mã hóa FIX noSP . Hình 7. Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 0,8%. 1: Đối chứng âm (vector pET32a không mang đoạn DNA ngoại lai); 2 - 6: DNA plasmid của 5 dòng vi khuẩn. b. Kiểm tra các plasmid bằng enzyme giới hạn [...]... ứng khoảng 1,4 kb mã hóa 461 amino acid đã được tách dòng và giải trình tự  Đã thiết kế được vector biểu hiện pET32a/FIXnoSP mang đoạn cDNA mã hóa FIXnoSP và biểu hiện được gen mã hóa cho yếu tố đông máu IX ở E coli Kiến nghị  Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện cDNA mã hóa FIX noSP trong vector pET32a ở vi khuẩn E. coli  Nghiên cứu phương pháp biến tính, hồi tính cho protein dung hợp FIX noSP-Trx thể vùi... a vitamin K dependent carboxylase: evidence from protein engineering of amino acid -4", Nucleic Acids Res, 15(22), pp 9505-9513 34 Green P M., Bentley D R., Mibashan R S., Nilsson I M., Giannelli F (1989), "Molecular pathology of haemophilia B", EMBO J, 8(4), pp 1067-1072 35 Hoag H., Gore J., Barry D., Mueller C (1999), "Gene therapy expression vectors based on the clotting Factor IX promoter", Gene... "Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes", J Mol Biol, 189(1), pp 113-130 57 Sunnerhagen M S., Persson E. , Dahlqvist I., Drakenberg T., Stenflo J., Mayhew M., Robin M., Handford P., Tilley J W., Campbell I D., et al (1993), "The effect of aspartate hydroxylation on calcium binding to epidermal growth factor-like modules in coagulation factors IX. .. journal of pharma ceutical review and rechear, 5, pp 18-26 55 Stenina O., Pudota B N., McNally B A., Hommema E L., Berkner K L (2001), "Tethered processivity of the vitamin K-dependent carboxylase: factor IX is efficiently modified in a mechanism which distinguishes Gla's from Glu's and which accounts for comprehensive carboxylation in vivo", Biochemistry, 40(34), pp 10301-10309 56 Studier F W., Moffatt... (1985), "An intragenic deletion of the factor IX gene in a family with hemophilia B", J Clin Invest, 76(6), pp 2161-2164 26 Derian C K., VanDusen W., Przysiecki C T., Walsh P N., Berkner K L., Kaufman R J., Friedman P A (1989), "Inhibitors of 2-ketoglutarate-dependent dioxygenases block aspartyl beta-hydroxylation of recombinant human factor IX in several mammalian expression systems", J Biol Chem, 264(12),... Kaufman R J (1993), "PACE/furin can process the vitamin K-dependent pro-factor IX precursor within the secretory pathway", J Biol Chem, 268(12), pp 8458-8465 61 Wojcik E G., Van Den Berg M., Poort S R., Bertina R M (1997), "Modification of the N-terminus of human factor IX by defective propeptide cleavage or acetylation results in a destabilized calcium-induced conformation: effects on phospholipid binding... Website 64 http://ghr.nlm.nih.gov/gene/F9 65 http://hemoviet.org.vn/detail-disease-c4-i9.html 66 http://hemoviet.org.vn/detail-intro-c4-i22.html 67 http://scholar.lib.vt.edu/theses/available/edt-12212004-143333/unrestricted/chap ter2-Backgroupd.pdf 68 http://www.cdc.gov/ncbddd/hemophilia/diagnosis.html (Accessed June 19, 2012) 69 http://www.daviddarling.info/encyclopedia/H/hemophilia.html (Accessed... by factor XIa", Biochem J, 323 (3), pp 629-636 62 Wolberg A S., Morris D P., Stafford D W (1997), "Factor IX activation by factor XIa proceeds without release of a free intermediate", Biochemistry, 36(14), pp 4074-4079 17 63 Yoshitake S., Schach B G., Foster D C., Davie E W., Kurachi K (1985), "Nucleotide sequence of the gene for human factor IX (antihemophilic factor B)", Biochemistry, 24(14), pp 3736-3750... http://www.daviddarling.info/encyclopedia/H/hemophilia.html (Accessed December 29, 2009) 70.http://www.hemophilia.org/NHFWeb/MainPgs/MainNHF.aspx?menuid=180&contentid=4 5&rptname=bleeding (Accessed December 18, 2009) 71.http://www.hemophilia.org/NHFWeb/MainPgs/MainNHF.aspx?menuid=181&conentid=4 6&rptname=bleeding (Accessed December 18, 2009) 72 http://www.umds.ac.uk 73 http://www.wfh.org/index.asp?lang=EN (Accessed March 8, 2012) 74 www.ahcdc.ca/publications.html... "Antibody-probed conformational transitions in the protease domain of human factor IX upon calcium binding and zymogen activation: putative high-affinity Ca2+-binding site in the protease domain", Proc Natl Acad Sci U S A, 89(1), pp 152-156 19 Bovill E G., Mann K G (1987), "Warfarin and the biochemistry of the vitamin K dependent proteins", Adv Exp Med Biol, 214, pp 17-46 20 Brandstetter H., Bauer M., Huber R., . trong vi c hoạt hóa yếu tố đông máu X thành dạng hoạt hóa Fxa. 1.3. Cấu trúc gen mã hóa yếu tố đông máu IX Gen FIX là gen mã hóa cho yếu tố đông máu IX. Chuyển và biểu hiện vector mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn E. coli. Keywords: Sinh học phân tử; Gen mã hóa; Di