Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano đƣợc chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán Virus Epstein Barr Phạm Thị Trà Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, khoa Sinh học Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm; Mã số: 60.42.30 Cán bộ hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyê ̃ n Thị Vân Anh Năm bảo vệ: 2011 Abstract: Xây dựng phƣơng pháp phát hiện định tính và định lƣợng EBV bằng PCR và Real-time PCR. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng tách chiết ADN của EBV trong mẫu máu bằng bộ kít tự chế tạo (Virus Magnet Nano Kit) gồm hạt từ nano đƣợc chức năng hóa bề mặt (cụ thể là hạt từ nano đƣợc bọc silica hay còn ký hiệu MagSi nano) và bộ đệm kèm theo (kế thừa kết quả của nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh học Nano và Ứng dụng thử nghiệm trên đối tƣợng HBV, HCV). So sánh khả năng tách chiết ADN EBV bằng kỹ thuật PCR, Real-time PCR với nguồn ADN khuôn tách bằng ba bộ kít: MinElute® Virus Spin Kit của hãng Qiagen, Dynabead Myone Silane® Kit của hãng Invitrogen, Virus Magnet Nano Kit trong cùng điều kiện thí nghiệm Keywords: Hạt từ nano; Sinh học thực nghiệm; Chẩn đoán; Virus Content Việc tinh sạch axít nucleic của vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm là một bƣớc rất quan trọng vì các nghiên cứu, xét nghiệm sinh học phân tử đều cần đến nguồn axit nucleic tinh sạch. Vì vậy, rất nhiều phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch axít nucleic đã đƣợc nghiên cứu, phát triển và ứng dụng rộng rãi, trong đó phƣơng pháp do René Boom và cộng sự phát minh vào năm 1990. Nguyên lý của phƣơng pháp này dựa trên khả năng hình thành liên kết bền vững của hạt silica với axít nucleic thông qua cầu nối cation trong môi trƣờng có nồng độ muối cao [8, 9]. Một cải tiến mang tính đột phá của phƣơng pháp Boom là sử dụng hạt nano từ tính bọc silica để tinh sạch axít nucleic, giúp nâng cao hiệu quả tách chiết và tiết kiệm thời gian thao tác. Giá thành của các bộ kít tinh sạch axít nucleic bằng hạt nano từ bọc silica rất cao. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển bộ kít tách chiết axit dựa trên nguyên lý hạt từ bọc silica có ý nghĩa khoa học và ứng dụng thực tiễn cao giúp cho việc giảm chi phí trong khâu tách chiết, chủ động cung cấp kít tách chiết axit nucleic khi cần. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xử lý hạt từ nano đƣợc chức năng hóa bề mặt bằng silica (Silica-coated magnetic nano-particles) hay còn gọi là hạt Magsi nano do nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm Khoa học Vật liệu của Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên chế tạo và bộ đệm thích hợp (kế thừa kết quả của nhóm nghiên cứu phòng Sinh học nano và Ứng dụng) để thử nghiệm khả năng tách chiết axit nucleic của virus Epstein Barr trong các bệnh phẩm của bệnh nhân ghi nhiễm EBV. EBV là virus truyền nhiễm trên ngƣời, lây truyền qua đƣờng ăn uống, tiếp xúc. EBV liên quan đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng nhƣ: ung thƣ vòm họng, Burkitt lymphoma, ung thƣ lymphoma và các trạng thái biến đổi tế bào lympho. ADN tách chiết bởi bộ kít Virus Magnet Nano Kit bao gồm hạt Magsi nano và bộ đệm thích hợp sẽ đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR và Real-time PCR để phát hiện và định lƣợng nồng độ EBV trong máu hay các mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm, hỗ trợ trong công tác chẩn đoán, điều trị, tiên lƣợng các bệnh liên quan đến EBV. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán Virus Epstein Barr’’ với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng phƣơng pháp phát hiện định tính và định lƣợng EBV bằng PCR và Real- time PCR. 2. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng tách chiết ADN của EBV trong mẫu máu bằng bộ kít tự chế tạo (Virus Magnet Nano Kit) gồm hạt từ nano đƣợc chức năng hóa bề mặt (cụ thể là hạt từ nano đƣợc bọc silica hay còn ký hiệu MagSi nano) và bộ đệm kèm theo (kế thừa kết quả của nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh học Nano và Ứng dụng thử nghiệm trên đối tƣợng HBV, HCV). 3. So sánh khả năng tách chiết ADN EBV bằng kỹ thuật PCR, Real-time PCR với nguồn ADN khuôn tách bằng ba bộ kít: MinElute ® Virus Spin Kit của hãng Qiagen, Dynabead Myone Silane ® Kit của hãng Invitrogen, Virus Magnet Nano Kit trong cùng điều kiện thí nghiệm II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu 2.1. Mẫu máu 30 mẫu máu có xét nghiệm VCA-IgG dƣơng tính đƣợc cung cấp bởi Khoa Vi Sinh bệnh Viện Bạch Mai. 10 mẫu máu của bệnh nhân đƣợc chẩn đoán ung thƣ vòm họng đƣợc cung cấp bởi Khoa Vi sinh, bệnh viện Quân Y 103. 2.1.2. Mồi Mồi đƣợc thiết kế để phát hiện EBV trong huyết thanh bằng PCR và Real-time PCR dựa trên các trình tự đặc hiệu cho EBV 2.1.3. Các hóa chất, nguyên liệu khác - Hạt từ nano bọc silica đƣợc cung cấp bởi Trung tâm Khoa học Vật liệu của Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên; MinElute ® Virus Spin kit của hãng Qiagen; Dynabeads Myone SILANE® của hãng Invitrogen 2.2. PHƢƠNG PHÁP - Tách chiết axit nucleic: Axit nucleic của EBV đƣợc tách chiết theo ba bộ kít MinElute ® Virus Spin Kit, Dynabead Myone SILANE ® , Virus Magnet Nano Kit từ 200 µl huyết thanh của cùng bệnh nhân nghi nhiễm EBV; Nhân bản đoạn gen đích đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR; Nhân dòng sản phẩm PCR vào vector pGEM-T easy; Giải trình trình tự gen đã đƣợc nhân dòng; Định lƣợng gen đích bằng kỹ thuật PCR tại thời điểm (Real-time PCR) III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. NHÂN DÒNG ĐẶC HIỆU ĐOẠN GEN EBNA-2/250 3.1.1. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của EBV bằng nested PCR với hai lần phản ứng PCR độc lập Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm nested PCR với hai lần phản ứng PCR độc lập đặc hiệu cho gen EBNA-2/250 bp 300 200 100 M 1 2 250 M: thang chuẩn ADN 100 bp; Đƣờng chạy 1: đối chứng âm (không có ADN khuôn) Đƣờng chạy 2: khuôn là ADN tinh sạch từ mẫu máu nhiễm EBV Theo công bố của Van B. D. và cs năm 2010, phản ứng nested PCR nhân bản đoạn gen EBNA-2/250 đặc hiệu của EBV đƣợc thực hiện với hai lần phản ứng PCR độc lập. Sản phẩm nested PCR này đƣợc điện di trên gel Agarose 1,5%. Kết quả điện di sản phẩm nested PCR đƣợc thể hiện trên hình 3.1 cho thấy, ở đƣờng chạy 1 ứng với sản phẩm PCR của đối chứng âm không xuất hiện băng sản phẩm PCR, còn đƣờng chạy 2 tƣơng ứng với khuôn là ADN tách từ mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm EBV xuất hiện duy nhất một băng có kích thƣớc khoảng 250 bp phù hợp với tính toán theo lý thuyết của đoạn gen EBNA-2. Kết quả trên bƣớc đầu cho phép chúng tôi tạm kết luận là đã nhân bản thành công đoạn gen EBNA-2 kích thƣớc 250 bp. 3.1.2. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của EBV bằng nested PCR với một lần PCR và một chu trình nhiệt duy nhất Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm nested PCR với các điều kiện tối ưu đặc hiệu cho gen EBNA-2/250 Đƣờng chạy M: Thang ADN chuẩn 100 bp Đƣờng chạy (-): 5 µl H2O Đƣờng chạy 1, 2: 5 µl ADN EBV tinh sạch Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu tối ƣu hóa, trình tự mồi, lƣợng khuôn, lƣợng mồi, chu trình nhiệt để gộp các phản ứng trong PCR ở mục 3.1.1 thành một phản ứng với một M (-) 1 2 300 200 100 250 bp chu trình nhiệt duy nhất. Với chu trình nhiệt và thành phần phản ứng đã tối ƣu chúng tôi thu đƣợc kết quả nested PCR mới (hình 3.2). Từ kết quả điện di trên hình 3.2 ta thấy trên đƣờng chạy số 1 và 2 chỉ xuất hiện duy nhất một băng ADN duy nhất có kích thƣớc khoảng 250 bp trùng với kích thƣớc dự đoán lý thuyết của đoạn gen EBNA-2/250, còn đƣờng chạy đối chứng âm không xuất hiện băng ADN nào. Do vậy chúng tôi có thể kết luận đã tối ƣu hóa đƣợc điều kiện phản ứng nested PCR một lần phản ứng và một chu trình nhiệt duy nhất. Sản phẩm nested PCR một vòng nhân bản đặc hiệu đoạn gen EBNA-2/250 đƣợc nhân dòng vào vector pGEM-T và chọn lọc dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp. Plasmis tái tổ hợp sau đó đƣợc giải trình tự đoạn gen EBNA- 2/250 đã đƣợc nhân dòng. Kết quả giả trình tự và so sánh cho thấy đoạn gen EBNA-2/250 trên vector pGEM-T tái tổ hợp có độ tƣơng đồng 100% với đoạn gen trên EBNA-2 chủng AG876 của Quảng Đông Trung Quốc. Từ các kết quả trên chúng tôi có thể kết luận đã nhân dòng thành công đoạn gen EBNA-2/250 vào vector pGEM-T. 3.2. KẾT QUẢ NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN EBV- 74 Phản ứng PCR nhân bản đặc hiệu đoạn gen EBV-74. Kết quả PCR đƣợc thể hiện trên hình 3.9 cho thấy ở đƣờng chạy số 1 là sản phẩm PCR bằng cặp mồi EBV Fw3Rv3 với khuôn là ADN EBV xuất hiện băng ADN kích thƣớc khoảng 74 bp, phù hợp với dự đoán lý thuyết đoạn ADN đƣợc nhân bản với cặp mồi EBV Fw3/Rv3 có kích thƣớc 74 bp. Còn đƣờng chạy chứng âm với mẫu chứng âm là H 2 O không xuất hiện băng ADN. Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi EBV Fw3Rv3 trên gel polyacrylamid 12% M (-) 1 bp 100 75 50 74 Đƣờng chạy M: Low range Marker Đƣờng chạy (-): chứng âm (5 µl H 2 O) Đƣờng chạy 1: ADN EBV tinh sạch Từ kết quả trên cho chúng tôi kết luận đã nhân bản thành công đoạn gen EBV-74. Đoạn gen này sau đó cũng đƣợc nhân dòng vào vector pGEM-T để làm đối chứng dƣơng và chất chuẩn trong các thí nghiệm định lƣợng bằng Real-time PCR tiếp theo. 3.3. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN EBV BẰNG BỘ KÍT TỰ CHẾ TẠO VIRUS MAGNET NANO KIT Quy trình tách chiết ADN EBV bao gồm các bƣớc từ xử lý hạt MagSi nano cho tới bƣớc ly giải virus, gắn kết ADN/ARN với hạt MagSi nano, rửa sạch để loại bỏ các tạp chất ra khỏi phức hệ ADN-MagSi nano và cuối cùng là tách thu đƣợc ADN tinh sạch. Sử dụng 5 µl ADN của EBV thu đƣơc để PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho EBV. Hình 3.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đặc hiệu đoạn gen EBNA-2/250 với nguồn ADN của EBV tách bằng Virus Magnet Nano Kit Đƣờng chạy (-): chứng âm Đƣờng chạy (+): chứng dƣơng với khuôn là ADN plasmid EBNA-2/250 Đƣờng chạy 1: khuôn ADN tách từ mẫu bệnh phẩm nhiễm EBV bằng bộ kít Virus Magnet Nano Kit Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen EBNA-2/250 thể hiện trên hình 3.4 cho thấy trên đƣờng chạy số 1 với khuôn là ADN EBV tách bằng bộ kít Virus Magnet Nano Kit cho kết quả duy nhất một băng ADN có kích thƣớc khoảng 250 bp, bp 300 200 100 250 (-) M (+) 1 trùng với băng ADN trên đƣờng chạy của đối chứng dƣơng là khuôn ADN plasmid EBNA- 2/250. Từ kết quả trên cho phép chúng tôi kết luận đã tách chiết đƣợc ADN EBV bằng bộ kít Virus Magnet Nano Kit. 3.4. ĐÁNH GIÁ ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA BỘ KÍT VIRUS MAGNET NANO KIT VỚI HAI BỘ KÍT THƢƠNG MẠI BẰNG PCR Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR đặc hiệu cho EBNA-2/250 dùng khuôn ADN EBV từ mẫu bệnh phẩm tách bằng Virus Magnet Nano kit (A), MinElute ® Spin Virus Kit (B), Dynabead myone Silane ® Kit (C) Đƣờng chạy (+): khuôn là ADN plasmid EBNA-2/250 M: Thang chuẩn ADN 1 kb Đƣờng chạy (-): chứng âm Đƣờng chạy 1-10: khuôn là 5 µl ADN tách từ các mẫu bệnh phẩm 1-10 Chúng tôi đã tiến hành tách chiết đồng thời ADN của 40 mẫu huyết thanh của bệnh nhân nghi nhiễm EBV bằng bộ kít tự chế tạo Virus Magnet Nano Kit và hai bộ kít thƣơng mại chuyên dùng cho tách ADN/ARN của virus là MinElute ® Virus Spin Kit của hãng ( + ) M (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A bp 500 250 B C 500 250 500 250 250 250 250 Qiagen, Dynabeads Myone SILANE ® của Invitrogen trong cùng các điều kiện thí nghiệm. Kết quả thực tế chỉ có 2 mẫu ADN tách chiết từ các mẫu máu nghi nhiễm EBV cho băng điện di sản phẩm PCR với kích thƣớc 250. Trên hình 3.5 thể hiện kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy, ở đƣờng chạy của đối chứng âm không có khuôn nên không cho băng sản phẩm PCR, còn đƣờng chạy chứng dƣơng với khuôn là ADN plasmid chứa đoạn gen EBNA-2/250 có băng ADN kích thƣớc 250 bp, các đƣờng chạy 7, 10 tƣơng ứng với khuôn là ADN tách chiết từ mẫu số 7 của bệnh nhân Nguyễn Ngọc D và Nguyễn Văn Đ xuất hiện băng ADN có kích thƣớc 250 bp trùng với kích thƣớc băng ADN ở đối chứng dƣơng ở cả ba bản điện di ứng với ba bộ kít, chỉ khác nhau về độ đậm nhạt của băng điện di. Điều này cho thấy với nguồn ADN của 40 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân xét nghiệm EBV với cả ba kit cần so sánh đều phát hiện đƣợc tỷ lệ 2 mẫu dƣơng tính trên tổng 40 mẫu bằng phƣơng pháp. 3.5. SO SÁNH KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT ADN EBV CỦA VIRUS MAGNET NANO KIT VỚI HAI BỘ KÍT THƢƠNG MẠI BẰNG REAL-TIME PCR Phƣơng pháp real - time PCR với các ƣu điểm nhanh, độ nhạy và độ chính xác cao, đƣợc sử dụng để định lƣợng và so sánh khả năng tách chiết ADN EBV của Virus Magnet Nano Kit với hai bộ kít thƣơng mại thể hiện bằng số bản sao ADN EBV mà các bộ kít tách đƣợc. Hình 3.6: Kết quả Real-time PCR với nguồn ADN EBV của hai mẫu bệnh phẩm số 7, 10 tách bằng ba bộ kít Virus Magnet Nano Kit, MinElute Virus Spin Kit, Dynabead PC 10 8 10 6 10 7 10 5 10 4 10 3 A B myone Silane ® Kit và chất chuẩn A: Đồ thị biểu diễn quá trình nhân bản đoạn gen EBV-74 đặc hiệu cho EBV B: Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên sự pha loãng nồng độ plasmid EBV-74 ban đầu, nồng độ các mẫu ADN cần so sánh, trục x biểu thị giá trị logarit số lƣợng bản copies ban đầu và các mẫu ADN, trục y biểu diễn giá trị chu kỳ ngƣỡng (C T ) Kết quả Real-time PCR định lƣợng thể hiện trên hình 3.14 có hệ số tƣơng quan R 2 = 0.996 cho thấy đƣờng chuẩn xây dựng đƣợc từ chất chuẩn ADN plasmid mang đoạn gen EBV- 74 với dải nồng 10 3 đến 10 8 copies/ml trong thí nghiệm có độ tin cậy cao đủ tiêu chuẩn cho việc định lƣợng số copies ADN EBV tách bằng ba bộ kít cần so sánh. Kết quả định lƣợng nồng độ ADN EBV tách đƣợc bằng ba bộ kít đƣợc cụ thể trong bảng 3.1. Bảng 3.1: Kết quả real–time PCR định lượng ADN EBV tách bằng ba bộ kít Mẫu C T (chu kỳ ngƣỡng) Số copies/ml M7 Q 35.6 9,64x10 3 M7 Mgsi 36.2 7,17x10 3 M7 I 40.62 6,53x10 2 M10 Q 25,96 1.84x10 6 M10 Mgsi 26,78 1.18x10 6 M10 I 27,73 7.04x10 5 Từ kết quả real-time PCR trên ta thấy số bản sao ADN EBV tách theo bộ kít Virus Magnet Nano Kit của cả hai mẫu 7 và 10 tƣơng ứng M7 Mgsi =7.17x10 3 , M10 Mgsi = 1.18x10 6 copies/ml cao hơn lƣợng ADN EBV của hai mẫu này tách bằng bộ kít Dynabead Myone Silane ® của Invitrogen (M7I = 6,53x10 2 , M10I = 7.04x10 5 ) và thấp hơn lƣợng ADN EBV tách bằng MinElute ® Virus Spin Kit của Qiagen (M7Q = 9.64x10 3 , M10Q = 1.84x10 6 ). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với độ đậm của băng điện di sản phẩm PCR đã đƣợc phân tích trong mục kết quả 3.4. IV. KẾT LUẬN Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra đƣợc những kết luận nhƣ sau: 1. Xây dựng phƣơng pháp phát hiện định tính và định lƣợng EBV bằng PCR và Real-time PCR i). Nhân bản thành công đoạn gen EBNA-2 kích thƣớc 250 bp đặc hiệu dùng cho chẩn đoán EBV bằng nested PCR. Thiết kế thành công cặp mồi EBVex2 Fw/Rv và tối ƣu điều kiện phản ứng nested PCR một lần phản ứng với một chu trình nhiệt duy nhất. Chế độ nhiệt cho phản ứng PCR này: Vòng một với 5 chu kỳ 94 0 C trong 1 phút, 60 0 C trong 1 phút, 72 0 C trong 2 phút; vòng 2 với 30 chu kỳ 94 0 C - 30 giây, 54 0 C - 1 phút, 72 0 C - 1 phút. Nhân dòng đƣợc đoạn gen EBNA-2/250 tạo chứng dƣơng cho các phản ứng phát hiện EBV bằng PCR. ii). Đã nhân dòng thành công đoạn gen mã hóa cho protein màng BRNF1 p143 không chứa nhóm glycosyl đặc hiệu cho EBV kích thƣớc 74 bp (EBV-74) dùng cho chẩn đoán EBV bằng Real-time PCR. 2. Đã tách chiết đƣợc ADN EBV bằng hạt từ nano đƣợc chức năng hóa bề mặt (hay còn gọi là hạt Magsi nano) và có thể sử dụng trong phát hiện EBV bằng phản ứng PCR, Real- time PCR. 3. Bộ kít Virus Magnet Nano Kit cho phép tinh sạch ADN EBV (M7Mgsi = 7.17x10 3 copies/ml) gần tƣơng đƣơng với bộ kít MinElute ® Virus Spin Kit của hãng Qiagen (M7Q = 9.64x10 3 copies/ml) và Dynabead myone Silane ® của hãng Invitrogen (M7I = 6.53x10 2 copies/ml). References TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Đái Duy Ban (2002), Sinh học phân tử của ung thư vòm họng, NXB Khoa học và kỹ thuật. 2. Hồ Quỳnh Thùy Dƣơng (2000), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội. 3. Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Hoàng Hải, Trần Mậu Danh, “Chế tạo và ứng dụng hạt nano từ bọc silica trong Y – Sinh học”, Báo cáo Hội nghị Vật lý toàn quốc lần thứ VI, Hà Nội ngày 23-25 tháng 11 năm 2005. 4. Phạm Hùng Vân (2009), PCR và real-time PCR Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, NXB Y học. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 5. Bajij BG., Murakami M., Robertson ES. (2007) “Molecular biology of EBV on the lationship to AIDS-assosiated oncogenesis”, Cancer Treat Res. 133: 141-62. 6. Bhushan B. (2004), HADNbook of Nanotechnology, Spinger – Verlag, Berlin, Germany, 279-371. 7. Boom R., Sol C. J. A., Salimans M. M. M., Jansen C. L., Wertheim P. M. E. (1990), “Rapid ADN simple method for purification of nucleic acids”, J. Clinic. Microbiol. 28: 495-503. 8. Boom R., Sol C. J. A., Salimans M. M. M., Jansen C. L., Wertheim P. M. E. (1990), “Rapid ADN simple method for purification of nucleic acids”, J. Clinic. Microbiol. 28: 495-503. 9. Boom R., Sol C., Beld M., Weel J., Goudsmit J. ADN Dillen P. W. V. (1999), “Improved Silica-Guanidiniumthiocyanate ADN Isolation Procedure Based on Selective Binding of Bovine Alpha-Casein to Silica Particles”, J. Clinic. Microbiol. 37: 615-619. [...]... Revolution, Elsevier Academic Press, California, USA, 567-599 13 Cohen JI (2006), “Virology ADN molecular biology of Epstein barr virus , 21-37 14 Elisabeth S., Aravind P (2007), BioNanotechnology 1st edit., Morgan & Claypool , Conecticut, USA, 31-79 15 Epstein MA., Barr YM ADN Achong BG (1964), Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma’’, The Lancet 1: 702-703 16 Gerstein S A (2001),... Winkler CA (2006), “Genetic factors leading to chronic Epstein- Barr virus infection ADN nasopharyngeal carcinoma in South East China: study design, methods ADN feasibility”, Huma Geno 2: 365-75 18 Hecht JL., ADN Aster JC (2000), “Molecular biology of Burkitt’s lymphoma”, J Clin Oncol 18: 3707-21 19 Henle G., Henle W., ADN Horowitz C A (1997), "Epstein- Barr Virus Specific Diagnosis: Tests in Infectious Mononucleosis",... Van den Brule AJ., Meijer CJ (2003), “Phathogenic role for Epstein Barr virus (EBV) gene products in EBV- associated proliferactive disorders”, Crit Rev Oncol Hematol 4: 1-36 26 Niesters HG., Van Esser J., Fries E., Wolthers KC., Cornelissen J., Osterhaus AD (2000), “Development of a real-time quantitative assay for detection of Epstein- Barr virus , J Clin Microbiol 38: 712-715 27 Obata K., Segawa O.,... http://www.jle.com/fr/revues/bio_rech/vir/e-docs/00/04/26/E0/article.phtml 45 http://complementaryoncology.com/reports/breast-cancer/detection-of -epstein- barrvirus-in-invasive-breast-cancers 46 http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/Herpes.htm 47 http://www.celebrities-with-diseases.com/health-conditions/what-is -epstein- barr -virus6 795.html ... MR., Miedema F., Van Oers MH (1999), “Direct Epstein- Barr virus (EBV) typing on peripheral blood mononuclear cells: no association between EBV type 2 infection or superinfection ADN the development of acquired immunodeficiency syndrome-related non-Hodgkin's lymphoma’’, J Clini Microbiol 93 :3949-55’’ 33 Vinod Lab., DiADNra L (2007), Biomedical Applications of Nanotechnology, John Wiley & Sons Inc, New... Format”, Analyt Biochem 283: 175-191 21 Laura L.V., SADNerson R D ADN Koch K R (2006), “Magnetic nanoparticles: Properties ADN potential applications”, Pure Appl Chem 78: 1793-1801 22 Lee YC., Hwang YC., Chen KC., Lin YS., Huang DY., Huang TW., Kao CY., Wu HC., Lin CT., Huang CY (2007), “Effect of Epstein- Barr virus infection on global gene expression in nasopharyngeal carcinoma” Funct Integr Geno 7:79-93... Microbiol 93 :3949-55’’ 33 Vinod Lab., DiADNra L (2007), Biomedical Applications of Nanotechnology, John Wiley & Sons Inc, New Jersey, USA 34 Zhong BL., Zong YS., Lin SX., Zhang M., Liang YJ., (2006), Epstein Barr virus infection in precursor lesions of nasopharyngeal carcinoma”, Ai Zheng, 25: 136-142 TÀI LIỆU INTERNET 35 http://agencourt.com/technical 36 http://www.roche-diagnostics.us/press_room/2001/100501.htm... Acids Purification”, J Biosci & Bioenginer 91: 500-503 28 Pankhurst Q.A., Connolly J., Jones S.K., ADN Dobson J (2003), “Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine”, J Physic D: Appl Physic 36: 167-181 29 Rajshri M., Tarala D (2007), “Application of nanotechnology in biomedicine”, Indi J Exper Bio 45: 160-165 30 Sambrook J., Russel D (2003), Molecular Cloning 3rd edit., Cold Spring Harbor Laboratory . Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành: Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán Virus Epstein Barr ’ với. Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano đƣợc chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán Virus Epstein Barr Phạm Thị Trà Trƣờng