Nghiên cứu tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen cry3 kháng sâu non bọ hà (Cylas formicarius) Lê Xuân Thao Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS. ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40 Người hướng dẫn: TS. Phạm Bích Ngọc Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Chương I. Tổng quan tài liệu: Vai trò và giá trị của cây khoai lang; Bọ hà hại khoai lang (Cylas formicarius); Kỹ thuật chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogens và ứng dụng; Gen có hoạt tính gây độc ở Bacillus thuringensis(Bt). Chương II. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: vật liệu, hóa chất và thiết bị; Phương pháp nghiên cứu; Chuyển gen thông qua Agrobacterium; Đánh giá cây trồng chuyển gen qua biểu hiện tạm thời của gen gus; Tách, tinh sạch DNA tổng số; Kiểm tra gen biến nạp bằng kỹ thuật PCR; Điện di sản phẩm PCR trên agarose, nhuộm ethidium bromide và đọc kết quả trên máy soi gel; tách protein tổng thực vật; Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford; Xác định hoạt lực diệt côn trùng của protein lên sâu non bọ hà; Phương pháp sử lý số liệu. Chương III. Kết quả và thảo luận: Kết quả phân tích biểu hiện tạm thời của gen gus; Kết quả chuyển gen cry3 vào khoai lang thông qua vi khuẩn A. rhizogens; Kết quả tách protein tổng số; Kết quả kiểm tra hoạt lực diệt côn trùng của protein biến nạp. Keywords. Vi sinh vật học; Khoai lang; Nghiên cứu tạo rễ; Chuyển gen Content MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Khoai lang (Ipomoea batatas) là cây lương thực quan trọng ở vùng nhiệt đới và một số khu vực ôn đới bao gồm các vùng phía nam của châu Âu và châu Mỹ. Củ khoai lang tích lũy lượng tinh bột khá cao. Khoai lang giàu năng lượng, vitamin, cũng như hàm lượng protein từ 2% đến 10% khối lượng chất khô. Tổ chức FAO đánh giá khoai lang là thực phẩm bổ dưỡng tốt của thế kỷ 21, đang được thị trường thế giới ưa chuộng Ở nước ta, khoai lang là cây trồng chiếm một vị trí quan trọng trong sản xuất lương thực, đứng thứ 3 sau lúa và ngô. Năng suất khoai lang bình quân ở nước ta là 8,73 tấn/ha, thấp hơn so với năng suất bình quân của các quốc gia ở châu Mỹ và một số nước châu Á. Năng suất thấp ngoài các nguyên nhân về giống khoai lang địa phương đã thoái hóa , việc canh tác khoai lang chưa thực hiện đúng quy trình kỹ thuật thì nguyên nhân chủ yếu là do tổn thất vì sâu bệnh , đă ̣ c biê ̣ t la ̀ do bọ hà hại khoai . Ở Việt Nam, các vùng khô hạn miền núi phía Bắc, các tỉnh miền Trung và Tây Nguyên củ khoai lang bị bọ hà gây hại rất nặng, nhất là trong các vụ hè thu tỷ lệ củ bị hại có thể lên đến 30 – 50%, thậm chí lên đến 100% . Thiệt hại chủ yếu xảy ra do sâu non bọ hà đục ăn thịt củ và thải phân ngay trong đường đục làm cho củ khoai xuất hiện những vết thâm, mùi hắc và vị đắng khi ăn. Việc chuyển gen của vi khuẩn Bacillus thuringiensis vào khoai lang thông qua hệ thống chuyển gen ở thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium đang là hướng đi mới. Tuy nhiên, cho tới nay, tạo cây khoai lang chuyển gen gặp nhiều khó khăn. Do vậy tối ưu hóa quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium, cũng như thử nghiệm hoạt động của cấu trúc gen biến nạp thông qua hệ thống nuôi cấy rễ tơ là rất cần thiết. Với mục đích làm cơ sở cho việc nghiên cứu tạo giống khoai lang kháng bọ hà, căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: ―Nghiên cứu tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen cry3 kháng sâu non bọ hà (Cylas formicarius)‖ 2. Mục tiêu của đề tài - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen vào khoai lang thông qua vi khuẩn Agrobacterium. - Tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen mang gen cry3 thông qua Agrobacterium rhizogens sử dụng làm mô hình đánh giá hoạt động cấu trúc của gen chuyển. 3. Nội dung của đề tài - Tối ưu một số yếu tố trong quy trình chuyển gen vào khoai lang KB1 nhờ vi khuẩn A.rhizogens thông qua biểu hiện của gen gus. - Chuyển gen cry3 vào khoai lang KB1 thông qua vi khuẩn A. rhizogens và kiểm tra biểu hiện của cấu trúc gen chuyển trong các dòng rễ tơ. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vai trò và giá trị của cây khoai lang 1.1.1. Sơ lược về cây khoai lang Khoai lang trồng ở vùng nhiệt đới cây thân thảo sống lâu năm, trồng ở vùng ôn đới, thường có dạng bụi. Chúng là cây giao phấn, ngày ngắn, không ra hoa khi ngày dài quá 13 giờ 30 phút, do đó ít khi ra hoa ở những vùng có vĩ độ ôn đới trên 30 độ Bắc hay Nam. Khoai lang có nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới châu Mỹ, được con người trồng cách đây trên 5000 năm. Hiện nay, khoai lang được trồng ở khắp các vùng nhiệt đới và một số vùng cận nhiệt đới, ôn đới. 1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cây khoai lang Trong 100g củ khoai lang tươi trung bình có 68g nước; 0,8g protein; 0,2g lipid; 28,5g glucid và 1,3g cellulose, có thể cung cấp cho cơ thể khoảng 122 calo. Ngoài ra trong khoai lang tươi còn có nhiều vitamin và muối khoáng. Trong 100g khoai lang khô có 11g nước, 2,2g protein, 0,5g lipid, 80g glucid, 3,6g cellulose, nhiều vitamin và muối khoáng. Theo số liệu thống kê của FAO, trên thế giới 77% khoai lang sử dụng làm lương thực, 13% làm thức ăn gia súc, 3% làm nguyên liệu chế biến thành nhiều sản phẩm khác nhau. Phần loại bỏ đi rất ít chiếm 6%, phần thân lá ngọn vừa được sử dụng làm rau xanh cho con người đồng thời là nguồn thức ăn tốt cho chăn nuôi gia súc. Do giá trị dinh dưỡng cao, thuận tiện trong chế biến với nhiều mục đích khác nhau, ngày nay cây khoai lang ngày càng khẳng định giá trị của mình trong nền kinh tế. Cho đến nay khoai lang được trồng phổ biến trên cả nước. Tuy nhiên do có những hạn chế về năng suất, bảo quản chế biến sau thu hoạch nên những năm gần đây diện tích trồng giảm, năng suất thấp và chưa ổn định. 1.2. Bọ hà hại khoai lang (Cylas formicarius) 1.2.1. Đặc điểm sinh học của bọ hà hại khoai lang Bọ hà khoai lang, Cylas formicarius, thuộc chi Ipomea. Bọ hà trưởng thành có mình thon, chân dài, đầu đen, mắt kép hình bán cầu hơi lồi ra hai bên đầu. Râu đầu 10 đốt. Ngực, đốt cuối râu và mắt màu đỏ. Bụng và cánh màu xanh đen bóng. Đốt cuối râu bọ đực trưởng thành hình ống dài, của con cái có hình trứng. Ngực trước có chiều dài gấp đôi chiều rộng, đốt đùi nở to. Bọ hà trưởng thành dài 6-8,5mm. Hình 1.1. Bọ hà trƣởng thành (nguồn: http://www.caripestnetwork.org/photogallery/?level=picture&id=165) Tuỳ thuộc vào điều kiện sống mà vòng đời của bọ hà có thể kéo dài từ 4-6 tuần. Pha trứng kéo dài từ 5-8 ngày. Sâu non có kích thước 6mm1,6mm. Ở 30 0 C thời gian phát dục của sâu non bọ hà là 15-20 ngày. Nhộng có kích thước 5,0  1,6mm, thời gian phát dục của pha nhộng là 5-7 ngày. Sau khi vũ hoá, bọ hà trưởng thành nằm trong đường đục 6-9 ngày. Khi bọ hà trưởng thành chui ra khỏi củ khoai, ăn thêm và tiến hành giao phối. Sau 2-3 ngày bọ hà trưởng thành bắt đầu đẻ trứng. 1.2.2. Tập tính sống và gây hại của bọ hà Bọ hà trưởng thành ăn phần biểu bì của lá, cuộng, dây và củ khoai khiến cho cây héo và chết. Nhưng điều này không ảnh hưởng gì đến sản lượng củ. Thiệt hại chủ yếu xảy ra do sâu non bọ hà đục ăn thịt củ và thải phân ngay trong đường đục. Để phản ứng lại sự gây hại của bọ hà, củ khoai sinh ra chất độc có mùi đặc biệt. Chất độc này có thể gây hại đối với phổi và tim của người và gia súc khi ăn củ bị hà. Do ưa ánh sáng tán xạ nên bọ hà trưởng thành có thể hoạt động cả ban ngày và ban đêm, tuy nhiên mọi hoạt động diễn ra mạnh mẽ nhất vào lúc chiều tối, ở các ruộng rậm rạp 1.3. Kỹ thuật chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogens và ứng dụng 1.3.1. Giới thiệu vi khuẩn A. rhizogens Vi khuẩn A. tunefaciens gây ra bệnh khối u (crown gall), A. rhizogenes gây bệnh lông rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm. Tác nhân gây bệnh của vi khuẩn A. tumefaciens, A. rhizogenes được xác định là do sự có mặt của plasmid Ti (tumour inducing) ở A. tumefaciens và Ri (root-inducing) ở A. rhizogenes Giống như Ti-plasmid, Ri-plasmid là phân tử DNA mạch vòng, sợi kép, có trọng lượng phân tử lớn, từ 200 - 800 kb, gồm hai vùng chính là T-DNA và vir (virulence). Hình 1.2. Cấu trúc plasmid Ri của A. rhizogenes T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine bao gồm hai vùng chính là vùng biên trái T L -DNA và biên phải T R -DNA. T L -DNA và T R -DNA. Hai vùng này đều có kích thước khoảng 15 - 20 kb và được xen kẽ bởi một đoạn DNA, đoạn DNA xen kẽ không được chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ. Vùng T R -DNA mang các gen mã hóa tổng hợp DNA, vùng T L -DNA bao gồm 18 khung đọc mở (ORFs) trong đó có bốn locus 10, 11, 12 và 15 mã hóa cho rol A, B, C và D. Các gen rolA, rolB và rolC đóng vai trò quan trọng trong quá trình cảm ứng tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật. Sự biểu hiện đồng thời của ba gen này gây nên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm. Trong 3 gen rol trên, gen rolB đóng vai trò quan trọng hơn cả trong việc cảm ứng kiểu hình rễ tơ. 1.3.2. Hệ vector nhị thể Kích thước quá lớn của Ri-plasmid và Ti-plasmid (200 đến 800kb) gây nhiều khó khăn trong quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium và trong các thao tác sử dụng để thiết kế gen vào các vector này. Nên các nhà khoa học đã cải tiến Ti-plasmid thành một hệ vector nhị thể gồm có vector chuyển gen (mang cấu trúc T-DNA) và vector bổ trợ (mang các gen vir) đảm nhiệm chức năng vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật. Hình 1.3. Hình ảnh tạo khối u gây ra do A. tumefaciens (trái) và rễ tơ do A. rhizogenes (phải) - Vector chuyển gen: Có cấu trúc từ Ti-plasmid với đoạn T-DNA được cắt bỏ hết các gen không cần thiết như gen onc và gen tổng hợp opine ở giữa hai trình tự biên trái (T-border left) và biên phải (T-border right), gắn thêm một số thành phần tạo ra cấu trúc mới gồm: - Vector bổ trợ: cấu trúc gồm các gen vir được tách và đưa vào chung một plasmit đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmit này được cải biến loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u, những vẫn duy khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật. 1.3.3. Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ Hình 1.4. Nuôi cấy rễ tơ G.glabra a: Bằng hệ thống bioreactor b, c: Thu hoạch sinh khối rễ sau 30 ngày nuôi cấy (Nguồn:http://www.ejbiotechnology.info/content/vol11/issue2/full/6/f4.jpg&imgrefurl) Rễ tơ có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng vì thế loại bỏ được dư lượng của các chất này trong sản phẩm tạo ra. Hê ̣ thống rê ̃ đa bô ̣ i la ̀ nơi ly ́ tươ ̉ ng đê ̉ sa ̉ n sinh ra ho ́ a chất thư ̣ c vâ ̣ t va ̀ chu ́ ng rất ô ̉ n đi ̣ nh về di truyền. Rễ tơ có thể được nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, sinh trươ ̉ ng nhanh. Đặc biệt hơn ở hệ thống nuôi cấy lỏng các mô tế bào thực vật việc biểu hiện dược phẩm sinh học tái tổ hợp ra ngoài môi trường nuôi cấy giúp làm đơn giản hơn rất nhiều trong quá trình tinh sạch các dược phẩm sinh học này. Cho tới nay, đã có nhiều nghiên cứu sản xuất thành công các protein tái tổ hợp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp từ hệ thống nuôi cấy rễ tơ như SEAP protein huỳnh quang kết hợp với protein ricin B (GFP-ricin B, fungal phytase, và đặc biệt hơn cả là các kháng thể và các chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của kháng thể. Hình 1.5. Một số ứng dụng của rễ tơ (nguồn: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii) 1.3.4. Yếu tố ảnh hưởng lên quá trình chuyển gen nhờ Agrobacterium Trong thực tế Agrobacterium thường chỉ gây hại ở cây hai lá mầm. Vì vậy tần suất chuyển nạp gen ở cây hai lá mầm cao hơn nhiều so với cây một lá mầm. Hiệu quả biến nạp gen thông qua Agrobacterium ở thực vật phụ thuộc vào một số yếu tố như tiền xử lý mô thực vật, nguồn vật liệu gây nhiễm, nồng độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm và đặc biệt là khả năng tái sinh của thực vật sau biến nạp 1.4. Gen có hoạt tính gây độc ở Bacillus thuringiensis (Bt) 1.4.1. Sơ lược về Bt Bt là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, kỵ khí hoặc hiếu khí tùy tiện, là chủng vi khuẩn đất điển hình. Sinh trưởng ở nhiệt độ 15-45 0 C nhưng thích hợp nhất ở nhiệt độ 29- 32 0 C. Genome của Bt có kích thước 2,4 - 5,7Mb, phần lớn có chứa một hay nhiều plasmid khác loại. Hình 1.6. Bào tử và tinh thể độc ở Bacillus thuringiensis A-Tế bào Bt dưới kính hiển vi điện tử; B - Tinh thể độc; C- Tinh thể độc phóng to; sp- bào tử; c-tinh thể độc (Nguồn: http://aem.asm.org/content/74/4/923/F1.expansion) Bt có khả năng sản sinh protein tinh thể độc ở dạng ngoại bào (, ,  - exotoxin) và nội bào (- endotoxin). Trong các protein tinh thể độc, - endotoxin là một họ protein tinh thể độc chính gây độc hệ tiêu hoá của côn trùng. Trong các loại độc tố, thì -endotoxin (Cry toxins), -exotoxin là các độc tố được nghiên cứu nhiều nhất về mặt phân tử và phổ tác dụng với côn trùng. 1.4.2. Phân loại gen mã hoá độc tố của Bt 1.4.2.1 Các gen nội độc tố cry Năm 1989, Whiteley đã xây dựng một hệ thống phân loại các gen cry. Dựa trên sự khác nhau về trọng lượng protein, phổ tác dụng với côn trùng được chia thành năm nhóm chính bao gồm: Gen thuộc lớp cry I (A, B, C) gây độc với các côn trùng thuộc Bộ Cánh vảy; Các gen thuộc lớp Cry II gây độc lên cả hai Bộ Cánh vảy và Hai cánh; Gen cry III (A, B, C, D, E) gây độc với ấu trùng thuộc Bộ Hai cánh; Các gen thuộc lớp cry IV gây độc với côn trùng thuộc Bộ hai cánh; Nhóm gen cry V có độc tính với côn trùng thuộc Bộ Cánh cứng và Cánh vảy Bảng 1.2. Phân loại độc tố cry (Nguồn: Tổ chức y tế thế giới, 1999) Gene Hình dạng tinh thể độc Trọng lƣợng protein (kDa) Tác động lên côn trùng Cry I [phân nhóm: A(a), A(b), B, C, D, E, F, G] Thoi 130-160 Bộ cánh vảy Cry II [phân nhóm A, B, C] Tháp 68-71 Bộ cánh vảy, hai cánh Cry III [phân nhóm A, B, C] Thoi 66-73 Bộ hai cánh Cry IV [phân nhóm A, B, C, D] Thoi/tháp 72-135 Bộ hai cánh Cry V-IX Nhiều loại 35-129 Nhiều loại 1.4.2.2. Các gen ngoại độc tố khác Gen cytA: Là gen tổng hợp nên protein độc với tế bào động vật có xương sống và không xương sống, hồng cầu động vật có vú. Nhóm gen vip: Gen vip mã hoá các protein trong pha sinh dưỡng trong chu trình phát triển của vi khuẩn Bt và Bc có hoạt lực diệt côn trùng có phổ tác dụng mạnh hơn các protein độc do gen cry mã hóa. Cơ chế tác dụng độc của các loại protein Vip bước đầu cho thấy giống như cách tác dụng của tinh thể - endotoxins. 1.4.3. Cấu trúc và cơ chế tác động của protein cry gây độc cho côn trùng Tinh thể độc có thể chiếm đến trên 25% trọng lượng khô của tế bào có bản chất là protein, được tổng hợp trong pha cân bằng của Bt Hình 1.7. Cấu trúc của độc tố Cry 3A (nguồn: http:// www.bioc.cam.ac.uk/UTOs/Ellar.html) Các protein độc của Bt hoạt động có chung một cơ chế tác động gây độc chung với côn trùng gồm 3 bước chính: Hoạt hóa tiền độc tố; Gắn độc tố lên các tế bào biểu bì ruột; Làm mất cân bằng áp suất thẩm thấu và phá vỡ tế bào làm côn trùng chết. Hình 1.8. Mô hình hoạt động của protein Cry gây độc đối với côn trùng [56] 1.4.4. Một số thành tựu tạo cây khoai lang chuyển gen Có rất nhiều các nghiên cứu nhằm tăng cường khả năng tái sinh cây khoai lang in vitro và các nghiên cứu hệ thống chuyển gen sử dụng vector chỉ thị bằng phương pháp bắn gen hay thông qua Agrobacterium. Gần đây, một số công trình nghiên cứu đã công bố về tạo cây khoai lang chuyển gen có ích như gen cry kháng côn trùng qua hệ thống chuyển gen bằng Agrobacterium Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về hệ thống tái sinh và hệ thống chuyển gen vào cây khoai lang sử dụng vector mang gen chỉ thị để nhằm mục đích hoàn thiện qui trình chuyển gen làm cơ sở cho bước chuyển gen sau này. CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị 2.1.1. Vật liệu a. Thực vật: Thực vật được sử dụng trong nghiên cứu là các mảnh lá, đoạn thân và chồi giống khoai lang KB1 thu thập từ Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam, nuôi cấy trong điều kiện in vitro. b. Chủng vi khuẩn: - Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC15834/PTN289 (Viện Sinh học phân tử và Dược học, Trường Đại học Heidelberg, CHLB Đức) - Chủng Agrobacterium rhizogenes pIBT/cry3 2.1.2. Hóa chất Các môi trường nuôi cấy: - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: YMP - Môi trường nuôi cấy thực vật MS - Môi trường đồng nuôi cấy và cảm ứng tạo rễ tơ: WPM Các loại kháng sinh: Kanamycine, Cefotaxime, Spectinomycine. Các hóa chất thông dụng trong sinh học phân tử thuộc Viện Công nghệ Sinh học mua từ các hãng nổi tiếng như Invitrogen, Merk, Amersham Parmacia Biotech, Fermentas, New England Biolabs 2.1.3. Thiết bị Thiết bị dùng trong nuôi cấy mô thực vật; dùng trong sinh học phân tử của phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm gen. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Chuyển gen thông qua Agrobacterium 2.2.1.1. Tạo dịch huyền phù Agrobacterium Agrobacterium được nuôi ở nhiệt độ 28 0 C trên các môi trường: Trên môi trường thạch YEP bổ sung 50 mg/L spectinomycine trong 36-48 giờ. Lấy một khuẩn lạc vi khuẩn nuôi trong 5ml môi trường YEP lỏng bổ sung 50mg/L spectinomycine, sau 8 giờ, chuyển toàn bộ 5ml dịch nuôi cấy trên sang 45ml môi trường YMP lỏng có bổ sung 50mg/L spectinomycine nuôi lắc 220 vòng/phút, sau 16-18 giờ lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy trên ly tâm với tốc độ 6000-6500 vòng/ phút, ở 4 0 C trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn với môi trường 1/2 MS (pH=5,8) và pha loãng cho tới OD 600  0.5-0.9. 2.2.1.2. Nhiễm vi khuẩn với mảnh lá Lá bánh tẻ và đoạn thân của các cây khoai lang nuôi cấy in vitro được cắt thành những mảnh nhỏ có kích thước 1cm 2 , sau đó được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn khoảng 10-30 phút ở nhiệt độ phòng, tiếp đến được đặt lên môi trường WPM và nuôi trong tối 48 giờ, ở nhiệt độ 26 0 C  2 0 C. Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường cảm ứng các mảnh lá được chuyển sang môi trường chọn lọc. 2.2.2. Đánh giá cây trồng chuyển gen qua biểu hiện tạm thời của gen gus. Các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen được ngâm trong dung dịch đệm cơ chất X-Gluc. Sau 24-48 giờ mẫu nhuộm được tẩy hết diệp lục bằng Ethanol 70% và quan sát trên kính lúp soi nổi. Biểu hiện hoạt động của gen gus sau khi chuyển vào tế bào thực vật là phản ứng tạo màu đặc trưng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen. 2.2.3. Tách, tinh sạch DNA tổng số Các mẫu sau biến nạp được nuôi trên môi trường chọn lọc, sau 30 ngày lựa chọn các dòng rễ trắng, đầu rễ không bị thâm đen, sinh trưởng tốt để nuôi sinh khối trên môi trường WPM lỏng. Sau 30-45 ngày mang đi tách và tinh sạch DNA tổng số theo phương pháp của Gawel và Jarret (1991). 2.2.4. Kiểm tra gen biến nạp bằng kỹ thuật PCR Các dòng sinh khối rễ sau khi tách DNA được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR với các cặp mồi cry3, virC để kiểm tra và khẳng định sự hiện diện của gen cry3 trong các dòng rễ biến nap. Trình tự các cặp mồi cry3 và virC được sử dụng để đánh giá hiệu quả biến nạp gen cry3 vào khoai lang thông qua vi khuẩn A. rhizogenes cry3_F 5’-GTTTAAGGATTATGTTTCCGCCCT-3’ cry3_R 5’-ATTCAAGGTTTTGGACATCCAGAG-3’ virC_F 5'-ATCATTTGTAGCGACT-3' virC_R 5'-AGCTCAAACCTGCTTC-3' Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước deion khử trùng 12,5 2 Buffer 10x 2,5 3 dNTPs 2,0 4 DNA 5,0 5 Taq polymerase 1,0 6 Primer F 1,0 7 Primer R 1,0 Tổng 25 [...]... dòng khoai lang KB1 mang gen cry3 kháng bọ hà - Bước đầu đã xác định được protein tạo thành từ dòng khoai lang chuyển gen cry3 có hoạt tính độc đối với sâu non bọ hà tuổi 2 Kiến nghị Để tiếp tục phát triển các kết quả nghiên cứu, chúng tôi đề xuất kiến nghị như sau: - Tiếp tục tách, tinh sạch và định lượng protein cry3 được mã hóa bởi gen cry3 trong các dòng rễ tơ chuyển gen - Tiến hành thử protein cry3. .. đối chứng (trái) và mẫu 2 Sâu non chết ở mẫu 3 (dòng rễ tơ dương (phải) (dòng rễ tơ âm tính với gen cry3) tính với gen cry3) Hình 3.8 Kết quả thử hoạt tính protein độc lên sâu non bọ hà KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết Luận - Xác định được điều kiện thích hợp cho quá trình chuyển gen tạo rễ tơ vào khoai lang KB1 thông qua vi khuẩn A rhizogens sử dụng vector chuyển gen pPTN289 mang gen chỉ thị gus Thời gian... hộp sẽ có khoảng 500 sâu non cho thí nghiệm Sử dụng sâu non tuổi 2 cho thí nghiệm 2.5.2 Thức ăn nhân tạo cho sâu non bọ hà Thức ăn nhân tạo cho sâu non bọ hà bao gồm 15 thành phần (phụ lục 2) Các thành phần này được trộn lẫn với nhau, thêm agar (40g/l) và khử trùng 2.5.3 Đánh giá hoạt lực của protein lên sâu non bọ hà Thức ăn nhân tạo cho sâu non bọ hà được khử trùng, làm nguội, đổ vào các giếng với... tính được hàm lượng protein trong các mẫu phân tích 2.5 Xác định hoạt lực diệt côn trùng của protein lên sâu non bọ hà 2.5.1 Nuôi sâu non bọ hà Nuôi khoảng 200 bọ hà trưởng thành trong hộp nhựa có 3-4 củ khoai lang Giữ các hộp này trong tối ở 300C Để thu được sâu non đồng đều cho thí nghiệm, cứ sau 3 ngày lại chuyển bọ trưởng thành sang một hộp khoai mới Sau 2 tuần, mỗi hộp sẽ có khoảng 500 sâu non cho... nghiệm chuyển gen cry B A Hình 3.2 Kết quả biến nạp A rhizogens mang vector pPTN289/Gus A Rễ âm tính B Rễ dương tính (chuyển xanh do gen gus) 3.2 Kết quả chuyển gen cry3 vào khoai lang thông qua vi khuẩn A rhizogens 3.2.1 Sơ bộ đánh kết quả chuyển gen thông qua A rhizogens mang vector pIBT /cry3 Sau khi chuyển gen bằng vi khuẩn A rhizogens, mẫu lá được đặt trên môi trường chọn lọc WPM Tỷ lệ cảm ứng tạo rễ. .. rễ tơ chuyển gen - Tiến hành thử protein cry3 đã được tinh sạch lên sâu non bọ hà để đánh giá hiệu quả diệt sâu non bọ hà một cách chính xác - Tiếp tục tạo các dòng rễ tơ chuyển gen từ các giống khoai lang khác, sử dụng các cấu trúc gen khác nhau và đánh giá hoạt động các gen được chuyển, để hoàn thiện phương pháp chuyển gen vào khoai lang References Tài liệu tiếng Việt 1 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê... marker 1kb; 1-12: Các dòng rễ tơ khoai lang Kết qua cho thấy chúng tôi đã tách thành công DNA tổng số trên 12 dòng rễ tơ khoai lang KB1 DNA tổng số được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo 3.2.3 Kết quả chuyển gen cry3 vào khoai lang thông qua A rhizogens + - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 1000bp 941bp 750bp Hình 3.6 Điện di sản phẩm PCR các dòng rễ khoai lang với cặp mồi cry3 M: Thang chuẩn DNA 1kb... dụng vector pIBT /cry3 1-12: Các dòng rễ khoai lang M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 - + ~700bp 750bp 500bp Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR các dòng rễ khoai lang với cặp mồi virC M: Thang chuẩn DNA 1kb (-): Đối chứng âm với đệm TE 1X (+): Đối chứng dương với vi khuẩn A rhizogens 1-12: Các dòng rễ khoai lang Từ hình 3.6 và 3.7 cho thấy chúng tôi đã biến nạp thành công gen cry3 vào 01 dòng khoai lang KB1 (mẫu... protein lên sâu non bọ hà Số sâu chết Dòng rễ Protein Tổng số Tỷ lệ trung bình tơ (µg/giếng) sâu thử sâu chết (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 1 0 3x3 0 0 1 11,11+0,03 20 3x3 0 0 0 0,00+0,00 2 40 3x3 0 1 0 11,11+0,03 20 3x3 1 1 0 22,22+0,03 3 40 3x3 2 2 2 66,67+0,00 Trong đó: 1: Mẫu đối chứng (sử dụng đệm PBS) 2: Mẫu có kết quả PCR âm tính với gen cry 3 3: Mẫu có kết quả PCR dương tính với gen cry 3 Sâu non ở mẫu... nghệ gen trong nông nghiệp, Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội 9 Đinh Thế Lộc (1977), Kỹ thuật canh tác cây khoai lang, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, tr 5-13 10 Ngô Xuân Mạnh (1996), Nghiên cứu các chỉ tiêu phẩm chất và một số biện pháp chế biến nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng khoai lang trồng vụ đông ở miền Bắc Việt Nam, Luận án phó Tiến sỹ khoa học nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội . tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen cry3 kháng sâu non bọ hà (Cylas formicarius) 2. Mục tiêu của đề tài - Nghiên. Nghiên cứu tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen cry3 kháng sâu non bọ hà (Cylas formicarius) Lê Xuân Thao Trường