Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của xạ khuẩn Streptomyces orientalis Chu Thanh Bình Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40 Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Phương Nhuệ Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Trình bày Chất kháng sinh vancomyxin; Streptomyces orientalis và các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp vancomyxin; nghiên cứu duy trì và nâng cao hiệu suất chủng giống sản xuất vancomyxin; tình hình nghiên cứu và sản xuất vancomyxin. Vật liệu nghiên cứu; phương pháp nghiên cứu: Bảo quản giống; Xác định đặc điểm sinh học; Xác định sinh khối; Xác định hoạt tính kháng sinh, … Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng Streptomyces orientalis 4912; khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. orientalis 4912; nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912; một số đặc điểm sinh học của biến chủng Streptomyces orientalis 4912- 81- 61; tối ưu hóa quy trình lên men biến chủng S. orientalis 4912-81-61. Keywords: Vi sinh vật học; Xạ khuẩn; Tổng hợp vancomyxin; Chất kháng sinh Content CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CHẤT KHÁNG SINH VANCOMYXIN 1.1.1. Lịch sử phát triển kháng sinh vancomyxin Vancomyxin là CKS tiêu biểu nhất trong nhóm KS glycopeptit, được Eli Lilly và cộng sự mô tả lần đầu tiên vào năm 1956, do xạ khuẩn S. orientalis phân lập từ đất ở Indonexia và Ấn Độ sinh ra [45]. Ban đầu CKS này được gọi là hợp chất 05865, nhưng sau đó đã được đặt tên là vancomyxin (do bắt nguồn từ “Vanquyshed” có nghĩa là “đánh bại”). Năm 1958, CKS này được đưa vào điều trị thử nghiệm trên người. Năm 1964, Bộ Y tế Mỹ chấp thuận đưa vancomyxin vào sử dụng rộng rãi trong các bệnh viện. Khi CKS bán tổng hợp nhóm penixilin là metixilin được đưa vào dùng trong chữa bệnh thì nhu cầu về vancomyxin đã giảm xuống trong một thời gian. Tuy nhiên, sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn S. auureus kháng metixilin vào 2 thập kỷ cuối thế kỷ XX đã làm kháng sinh glycopeptit được lựa chọn trong 2 phác đồ điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng nhiều loại KS thông dụng gây ra. Lúc đó vancomyxin được ví như một loại thần dược hay phương thuốc cuối cùng vì có khả năng điều trị được các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các chủng vi sinh vật kháng metixilin gây nên. Vancomyxin đã mở ra liệu pháp điều trị đầu tiên khi có sự nghi ngờ về khả năng kháng penixilin của các chủng Staphylococcus. Sau khi những nghi ngờ này được dẫn chứng bằng những số liệu cụ thể thì liệu pháp này được điều chỉnh cho phù hợp [18], [20], [22], [28], [36], [56]. 1.1.2. Đặc tính của vancomyxin Vancomyxin có công thức tổng quát C 66 H 75 Cl 2 N 9 O 24 . Trong phân tử có chứa một disacarit ở vị trí axit amin thứ 4, cấu trúc hóa học được thể hiện ở hình 1.1 [9], [16]. Vancomyxin có tổng số 18 trung tâm lập thể, với 9 trung tâm lập thể nằm trên lõi glycol và các trung tâm còn lại nằm tại các nhóm cacbonhydrat [58]. Cấu trúc hóa học lập thể quyết định cơ chế hoạt động của vancomyxin. Vancomyxin có một chuỗi hexapeptit đã glycozyl hóa, chứa 7 aminoaxit gồm các loại như chloro-β-hydroxytyrozin, p-hydroxylphenylglyxin, N-metylleuxin và axit aspartic tạo thành bộ khung phân tử vững chắc [13], [43], [53], [64]. 1.1.3. Cơ chế kháng khuẩn của vancomyxin Vancomyxin và các kháng sinh nhóm glycopeptit có hoạt tính kháng vi sinh vật thông qua việc ức chế sự tổng hợp thành tế bào. Vị trí mà các tác nhân tấn công vào thành tế bào là lớp peptidoglycan. Đây là lớp cơ bản để vi khuẩn chống lại các điều kiện bất lợi của môi trường. Nếu không có lớp này hoặc vì một lý do nào đó mà lớp peptidoglycan bị phá hủy thì tế bào vi khuẩn trở nên cứng nhắc, không linh động, kết qủa tế bào bị chết [33]. Vancomyxin ức chế giai đoạn cuối của quá trình sinh tổng hợp peptidoglycan qua 3 giai đoạn [58]: - Giai đoạn 1: Vancomyxin không xâm nhập vào tế bào chất để ức chế các bước sinh tổng hợp thành tế bào tiếp theo mà chỉ hoạt động ở bên ngoài màng tế bào chất. Sự ức chế các chất màng trên đã ngăn cản chu trình lặp lại các chất mang C55 lipit làm gia tăng sự tích lũy tiền chất của tế bào chất. Đây là một cơ chế không thường xuyên xảy ra đối với một tác nhân kháng vi sinh vật bao gồm việc sử dụng cơ chất thay vì điều khiển hoạt tính của enzyme sinh tổng hợp. - Giai đoạn 2: Nhờ cấu tạo hình xoắn của phân tử mà gần đây người ta đã phát hiện ra khả năng kháng vi sinh vật của vancomyxin tác động ngược lại với sự mẫn cảm penixilin. Ở màng ngoài tế bào vi khuẩn, enzyme transglycosylaza bổ sung các mảnh disacaryl pentapeptit để hình thành lớp peptidoglycan của tế bào. Sau đó, enzyme transpeptidaza nối các peptit ở bên trong với các sợi của lớp peptidoglycan ở bên ngoài bề mặt của màng tế bào. Đích tác dụng của vancomyxin là gắn với các peptit cơ chất, ngăn cản chúng liên kết với vị trí hoạt 3 động của enzyme. Khi đó, phân tử vancomyxin có dạng hình chiếc cốc liên kết với ái lực cao nhờ bề mặt lõm của nó tạo năm liên kết hydro với đoạn cuối N-acyl-D-Alanyl-D-Alanin của cầu liên kết chéo peptit chưa nối với pentapeptit. - Giai đoạn 3: Liên kết của vancomyxin với chuỗi lipit-PP-Glc NAC- pentapeptit là liên kết vật lý tương đối bền vững đã ngăn cản tác động tiếp theo của transglycosylaza/transpeptidaza. Vancomyxin không tấn công được disacaryl pentapeptit mà làm giảm các liên kết đồng hóa trị, giảm tính bền cơ học của lớp peptidoglycan và làm cho tế bào vi khuẩn dễ dàng bị phân giải nhờ những thay đổi xảy ra do áp suất thẩm thấu. Vancomyxin có hoạt tính mạnh với các cầu khuẩn và vi khuẩn Gram (+) như: Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Enterococcus và xoắn khuẩn (Bảng 1.2) [58], [62]. CKS này có khả năng tiêu diệt tốt vi khuẩn đang ở trong giai đoạn sinh sản, pH tối ưu là 8,0 và hoạt tính giảm mạnh khi pH dưới 6,0. Điều này được giải thích bởi hai nguyên nhân: một là do sự khác biệt của cấu trúc thành tế bào giữa vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-). Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram (+) gồm có lớp peptidoglycan dầy, axit teichoic và axit teichoronic, có thể có hoặc không có màng protein hoặc polysaccarit bao quanh. Trong khi đó thành tế bào vi khuẩn Gram (-) gồm có lớp peptidoglycan mỏng, lipopolysacarit, lipoprotein, photpholipit và protein. Trong các tế bào vi khuẩn Gram (-), lớp peptidoglycan và lớp màng bên trong được bao bọc bởi một lớp màng ngoài ngăn chặn sự khuếch tán vancomyxin đến lớp peptidoglycan. Ngược lại, lớp peptidoglycan của vi khuẩn Gram (+) được xác định trên bề mặt ngoài của thành tế bào và do đó nó mẫn cảm với kháng sinh vancomyxin. Hai là có thể do phân tử glycopeptit là những phân tử lớn, chúng không thể hòa tan lớp lipit của màng tế bào vi khuẩn Gram (-), do đó khó có thể xâm nhập được vào lớp bên trong của thành tế bào [40], [58], [71] 1.1.4. Ứng dụng trong điều trị bệnh của vancomyxin Vancomyxin từng được xem như phương thuốc cuối cùng, chỉ sử dụng sau khi việc điều trị bệnh bằng các kháng sinh khác không có hiệu quả. Không lâu sau khi được phát hiện, vancomyxin được xếp vào danh mục những loại dược phẩm hàng đầu và được đưa vào dùng rộng rãi trong bệnh viện để điều trị các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các vi sinh vật kháng KS nhóm β-lactam gây nên [15], [58] Vancomyxin đặc biệt có hiệu quả cao khi dùng trong điều trị các bệnh do MRSA gây nên, vi khuẩn này là mối nguy hiểm với bệnh nhân cao tuổi, bệnh nhân sau phẫu thuật và những người có hệ miễn dịch suy giảm [30]. Vancomyxin còn được chỉ định để điều trị cho các bệnh nhân dị ứng với penixilin, các bệnh nhân không thể sử dụng các loại thuốc như penixilin hoặc cephalosporin và sử dụng khi những chủng vi sinh vật mẫn cảm với 4 vancomyxin. Dưới tác dụng của vancomyxin tính bền vững vốn có của các cầu khuẩn Gram (+) đối với penixilin không phát hiện thấy [58]. Mặc dù có nhiều CKS chữa trị các bệnh do vi khuẩn Gram (+) gây ra đã được công bố trong những năm gần đây, nhưng vancomyxin vẫn là kháng sinh không thể thay thế trong việc chữa trị những bệnh do Staphyloccus, Enterococcus và các chủng vi sinh vật kháng nhiều loại kháng sinh thông dụng gây nên [5], [30]. 1.2. Streptomyces orientalis VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG TỚI SINH TỔNG HỢP VANCOMYXIN 1.2.1. Streptomyces orientalis Streptomyces orientalis có khả năng sinh CKS vancomyxin. Lúc đầu, khi mới phát hiện, xạ khuẩn này có tên là Amycolatopsis orientalis, được xếp vào chi Nocardia, sau đó loài này được phân loại lại và xếp vào chi Streptomyces, đặt tên là S. orientalis, tuy nhiên, nhiều tài liệu vẫn gọi tên truyền thống là Amycolatopsis orientalis. Cho đến nay, vẫn chỉ phát hiện thấy kháng sinh vancomyxin từ loài xạ khuẩn này [23], [26], [31], [35], [51]. S. orientalis được phân biệt với các loài khác thuộc chi Streptomyces bởi các đặc điểm nuôi cấy, hình thái, sinh lý, sinh hóa… [23]. 1.2.2. Sinh tổng hợp vancomyxin ở xạ khuẩn Cũng giống như con đường sinh tổng hợp KS nhóm glycopeptit, vancomyxin được tổng hợp bằng cách ngưng tụ các đơn vị nhỏ mà mỗi đơn vị này lại được tạo thành từ các con đường sinh tổng hợp riêng (Hình 1.3). 5 Hình 1.3. Quá trình tổng hợp vancomyxin trong tế bào xạ khuẩn [71] 1.2.3. Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất vancomyxin 1.2.3.1. Điều kiện nuôi cấy Theo các tài liệu đã công bố [30], [33], [41], [42], [44], [59], xạ khuẩn S. orientalis sử dụng trong sản xuất vancomyxin thường phát triển tốt ở nhiệt độ 20-35 o C, nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh vancomyxin là 28 o C, ở nhiệt độ 20 o C và 35 o C chủng này sinh trưởng yếu, sinh khối tích lũy và lượng kháng sinh tạo ra thấp. Độ pH thích hợp cho tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn thường là trung tính. Tuy nhiên dải pH cho phép chủng sinh trưởng thường lớn hơn so với pH tối ưu cho hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh. Đối với xạ khuẩn S. orientalis thì pH thích hợp cho sinh trưởng là 6-8, còn pH thích hợp cho sinh vancomyxin chỉ từ 6,5-7,5. Môi trường kiềm hay axit đều ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh kháng sinh [25]. 1.3. NGHIÊN CỨU DUY TRÌ VÀ NÂNG CAO HIỆU SUẤT CHỦNG GIỐNG SẢN XUẤT VANCOMYXIN Một yếu tố quan trọng hàng đầu cho mọi quá trình lên men sinh tổng hợp hoạt chất sinh học là chủng giống vi sinh vật. Do các chủng VSV dễ bị biến dị và hoạt tính bị thoái hóa trong quá trình nuôi cấy nhiều lần bởi tác động của môi trường sống của chúng, nên phải tiến hành chọn lọc thường xuyên chủng giống cho lên men. Phần lớn các chủng sản sinh KS phân 6 lập từ tự nhiên thường có hiệu suất thấp vì thế không thể dùng ngay cho sản xuất [6], [7], [12], [26]. Để thu được các chủng có khả năng siêu tổng hợp KS, có giá trị trong công nghiệp cần phải áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo (đột biến cảm ứng). Các phương pháp hiện đại về sinh tổng hợp, kỹ thuật di truyền và công nghệ gen, siêu tổng hợp, điều khiển hoạt động của gen, gây đột biến định hướng, tạo và dung hợp tế bào trần (protoplas)… không những nâng cao hiệu suất chủng giống trong thời gian ngắn mà còn mở ra phương hướng đầy triển vọng trong sản xuất các CKS [58]. 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT VANCOMYXIN Người ta phát hiện thấy CKS vancomyxin thường được tổng hợp bởi xạ khuẩn S. orientalis (trước đây có tên Nocardia orientalis và Amycolatopsis orientalis). Việc phát hiện ra vancomyxin được coi như cứu cánh cho nhân loại, do có đặc tính chữa bệnh rất cao, phần nào khắc phục được hiện tượng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh [58]. Vancomyxin được đưa vào thử nghiệm chữa bệnh từ năm 1958, và Bộ Y tế Mỹ cho phép sử dụng năm 1964 [71], [72]. Dạng vancomyxin thương phẩm được đóng 500 mg vancomyxin.HCl/lọ, tương đương 0,34 mmol. VANCOCIN. HCl (Vancomyxin dạng tiêm, USP) của hãng Galaxy được đóng trong lọ plastic (PL 2040) chỉ sử dụng tiêm tĩnh mạch, làm giảm sự phát triển của vi khuẩn kháng kháng sinh, bảo vệ hiệu lực của vancomyxin và các thuốc kháng khuẩn khác. Vancomyxin chỉ nên dùng để chữa hoặc chống nhiễm trùng do vi khuẩn nghi ngờ đã nhờn thuốc gây nên. Khi dùng vancomyxin trong thời gian dài hoặc quá liều có thể bị giảm thính giác, gây điếc, tổn thương thận. Ngoài ra vancomyxin chỉ có tác dụng khi tiêm qua đường tĩnh mạch và không được hấp thụ qua đường tiêu hóa [21], [22]. Vancoxyn, VancoxynD, VancoxynD IV, “Vancomycin by Abbott | VANCOCIN HCL | VANCOCIN HCL IN” (tên thương phẩm của vancomyxin) đang được bán trên thị trường thế giới với giá 18,25 USD/ 500 mg vancomyxin dùng để tiêm [72]. Hiện nay, vancomyxin vẫn đang được nghiên cứu hoàn thiện sản xuất, tăng độ tinh khiết và giảm độ độc của nó [5], [30], [33]. 7 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Chủng giống vi sinh vật - Chủng S. orientalis 4912 là chủng xạ khuẩn dại, được phòng Công nghệ lên men mua từ Công ty TG Biotech thuộc Trường Đại học Kyungpook Hàn Quốc (Kyungpook National University - gọi tắt là KNU). 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Bảo quản giống Chủng xạ khuẩn S. orientalis 4912 được giữ trong MT 48 thạch nghiêng, ở nhiệt độ 4 o C và cấy chuyền lại hàng tháng. Giống sử dụng trong các nghiên cứu được hoạt hoá bằng cách nuôi trên MT 48 thạch nghiêng, ở nhiệt độ 28 o C, kéo dài 5-7 ngày. Để bảo quản chủng lâu dài, giữ giống trong glyxerin ở -20 o C hoặc -70 đến -80 o C [2]. 8 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG Streptomyces orientalis 4912 3.1.1. Đặc điểm nuôi cấy Chủng S. orientalis 4912 được nuôi trên các môi trường (MT) thạch có thành phần dinh dưỡng khác nhau. Đây là các MT nuôi cấy đặc trưng để phân loại các chủng xạ khuẩn. Đặc điểm nuôi cấy của chủng S. orientalis 4912 trên các MT được trình bày ở bảng 3.1. Kết quả cho thấy, sau 14 ngày nuôi, KTKS của chủng S. orientalis 4912 trên các MT khác nhau đều là màu trắng. Sau đó xạ khuẩn hình thành bào tử nên bắt đầu có sự thay đổi màu sắc, trên MT Gauze 1 và ISP-6, KTKS chuyển sang màu đỏ, trên MT Gauze 2 và ISP-4, KTKS chuyển sang màu vàng nhạt, trong khi vẫn giữ nguyên màu trắng trên MT 48 và MT khoai tây. Chủng 4912 phát triển tốt trên MT Gauze 1 và Gauze 2. Trên các MT, chủng S. orientalis 4912 không sinh sắc tố tan. 3.2. KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CỦA CHỦNG Streptomyces orientalis 4912 Thử nghiệm lên men chủng 4912 với 6 loại MT cơ sở có các nguồn dinh dưỡng khác nhau là A-4, A-4H, A-9, A-12, Gauze 1 và 48. Kết quả kiểm tra HTKS của chủng S. orientalis 4912 cho thấy, chủng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Phổ kháng khuẩn của xạ khuẩn cũng là một trong những chỉ tiêu phân loại cần được nghiên cứu. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng 4912 được kiểm tra với 5 loại vi khuẩn kiểm định là Bacillus subtilis ATCC 9 6633, Bacillus cereus ATCC 21778, Sarcina lutea M5 và Staphylococcus aureus 209P thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương và Escherichia coli PA2 thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm. 3.3. NÂNG CAO HOẠT TÍNH KHÁNG SINH CỦA CHỦNG S. orientalis 4912 Yếu tố quan trọng hàng đầu cho mọi quá trình lên men sinh tổng hợp hoạt chất sinh học là chủng giống vi sinh vật. Để đảm bảo chủng giống luôn có hoạt tính cao, ngoài việc bảo quản tốt chủng giống bằng các phương pháp giữ giống, người ta còn thường xuyên tuyển chọn nâng cao hiệu suất bằng các kĩ thuật di truyền. 3.3.1. Thu nhận bào tử và tế bào trần từ chủng S. orientalis 4912 Để thu được bào tử cho xử lý đột biến, chủng S. orientalis 4912 được nuôi trong ống thạch nghiêng chứa MT 48 từ 8-10 ngày. Nhỏ nước cất vô trùng theo mặt thạch, cạo nhẹ trên bề mặt để gạt bào tử vào nước và đổ qua dụng cụ lọc để lấy bào tử. Để thu được TBT, chủng 4912 được nuôi trong MT YEME dịch thể, sau đó sinh khối được xử lý với lysozym . Tuy nhiên, việc tạo TBT phụ thuộc chủ yếu vào thời gian nuôi cấy chủng giống, nồng độ và thời gian xử lý với lysozym, nồng độ glyxin trong MT nuôi cấy. Cần xác định giá trị các yếu tố này để thu được kết quả tốt nhất. 3.3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng hình thành tế bào trần của chủng S. orientalis 4912 Thời gian nuôi cấy giống có ảnh hưởng rất lớn tới quá trình hình thành tế bào trần. Kiểm tra sự tạo thành tế bào trần của chủng S. orientalis 4912 tại các thời điểm sinh trưởng khác nhau 24, 36, 48, 60 và 72 giờ. Sau 60 phút xử lý sinh khối với lysozym (1 mg/ml), làm tiêu bản soi kính hiển vi thấy các khuẩn ty bị cắt nhỏ và hình thành tế bào trần. Sử dụng buồng đếm hồng cầu, đếm số lượng TBT tạo thành, kết quả thể hiện trên hình 3.6 cho thấy, quá trình tạo tế bào trần từ khuẩn ty ở 48 giờ nuôi cấy diễn ra khá nhanh và có hiệu quả nhất. 3.3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý lysozym tới khả năng hình thành tế bào trần của chủng S. orientalis 4912 Giống nuôi 48 giờ, sau đó xử lý bằng lysozym với nồng độ 1 mg/ml từ 30 đến 120 phút. Trong quá trình thí nghiệm, làm tiêu bản soi kính hiển vi thấy sau 30 phút các đoạn khuẩn ty bị cắt, tế bào trần cũng được tạo thành, sau 60 phút lượng tế bào trần tạo thành rất nhiều, sau 90 phút số lượng tế bào trần ít đi, có thể một số tế bào trần đã bắt đầu bị phá hủy. Kết quả trên cho thấy khả năng tạo tế bào trần và khả năng bền vững của tế bào trần phụ thuộc nhiều vào thời gian xử lý lysozym. Tại thời điểm trước 60 phút lượng tế bào trần tạo ra là chưa đáng kể, sau 90 phút thì các tế bào trần tạo ra bắt đầu bị phá huỷ, do đó thời gian xử lý thích hợp nhất là từ 60-70 phút, lượng tế bào trần tạo ra nhiều nhất và ổn định nhất. Nếu kéo dài thời gian xử 10 lý hơn nữa, lysozym sẽ phá hủy các TBT vừa tạo thành. Làm tiêu bản soi kính hiển vi, dùng buồng đếm hồng cầu đếm số lượng TBT tạo thành, kết quả được thể hiện ở hình 3.7. 3.3.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ lysozym tới khả năng hình thành tế bào trần của chủng S. orientalis 4912 Giống nuôi 48 giờ, sau đó xử lý lysozym với nồng độ từ 0,5 đến 4 mg/ml trong 60 phút. Kết thúc thí nghiệm, làm tiêu bản soi kính hiển vi và đếm số lượng TBT. Kết quả trên bảng 3.3 cho thấy, khả năng tạo tế bào trần và khả năng bền vững của tế bào trần tốt nhất khi xử lý với lysozym ở nồng độ 1 mg/ml. Tại nồng độ 0,5 mg/ml, do ít enzym nên lượng tế bào trần tạo ra chưa đáng kể. Sau 60 phút xử lý ở nồng độ 2 mg/ml trở lên, do nồng độ lysozym cao nên các tế bào trần tạo ra bị enzym phá huỷ gần như hoàn toàn. 3.3.3.4. Ảnh hưởng của nồng độ glyxin tới khả năng hình thành tế bào trần của chủng S. orientalis 4912 Khi nuôi xạ khuẩn trong MT có chứa glyxin thì sự sinh trưởng sẽ bị ức chế. Theo Baltz, sự sinh trưởng của chủng xạ khuẩn S. fradiae trong MT có 0,4% glyxin bị chậm lại, cụ thể là thời gian nhân đôi của tế bào kéo dài từ 1,6 giờ lên tới 2,7 giờ. Mặc dù vậy nhưng glyxin có tác dụng làm cho thành tế bào của xạ khuẩn mẫn cảm hơn với lysozym. Đó là do glyxin đã thay thế D-alanin trong phân tử peptidoglycan của thành tế bào làm cho lysozym dễ tác động vào mối liên kết glycozit. Vì vậy, khi muốn tạo tế bào trần ở xạ khuẩn, glyxin thường được lựa chọn để bổ sung vào MT nuôi cấy. Để quá trình tạo tế bào trần diễn ra nhanh và hiệu quả thì việc tìm ra nồng độ glyxin thích hợp là rất cần thiết. Theo nhiều tài liệu nghiên cứu thì thành tế bào của các loài xạ khuẩn mẫn cảm với lysozym khác nhau [24]. Vì thế, nồng độ glyxin thích hợp cho tạo tế bào trần mà không ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của các loài xạ khuẩn cũng khác nhau. 3.3.2. Nâng cao HTKS của chủng S. orientalis 4912 bằng phƣơng pháp gây đột biến dùng tia UV và N-metyl-N ’ -nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG) 3.3.2.1. Xác định tỷ lệ sống sót của chủng S. orientalis 4912 sau khi chiếu tia UV và xử lý bằng MNNG Để xây dựng đường cong sống sót khi xử lý với tia UV, dịch bào tử và TBT được xử lý với khoảng cách 20 cm. Sau thời gian xử lý từ 0 - 80 giây, cấy lên đĩa thạch MT 48 (với bào tử) và R2YE (với TBT), nuôi trong tủ ấm ở 28-30 o C trong 5 ngày. Đồ thị sống sót của tế bào trần và bào tử chủng S. orientalis 4912 sau khi gây đột biến cho thấy (Hình 3.8), thời gian chiếu UV càng lâu thì tỷ lệ sống sót càng giảm. Thời gian chiếu là 30 giây, tỷ lệ bào tử sống sót là 26,8% và TBT là 12,6%. Thời gian chiếu là 40 giây tỷ lệ sống sót của bào tử còn 10,10% và tế bào trần là 8,6%; thời gian chiếu 50 và 60 giây tỷ lệ TBT sống sót là 3,2% và [...]... lên men trên MT 5 HTKS của chủng lớn nhất, là 1889 mcg/ml MT 5 có thành phần như sau được lựa chọn để nghiên cứu tiếp (g/l): Glucoza 15; khô đậu tương 15; pepton 5; NaCl 2,5; CaCO3 2; pH 6,5-7,0 3.5.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S orientalis 4912-81-61 Với mục đích nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và sinh tổng hợp vancomyxin, nhằm tối... LUẬN 1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn S orientalis 4912 cho thấy, chủng này có khả năng sử dụng nhiều nguồn đường; sinh trưởng tốt nhất trong khoảng nhiệt độ 28-30oC và pH 6-9; có khả năng chịu NaCl đến 6% và không sinh xenlulaza Chủng 4912 có hoạt phổ kháng khuẩn rộng và mạnh, ức chế được cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm 2 Bằng phương pháp gây đột biến tế bào trần từ chủng S orientalis. .. trong nước, chủng S orientalis 4912-81-61 được nuôi trong bình tam giác có thể tích 500 ml, trên máy lắc 220 vòng/phút, kéo dài 120 giờ 3.5.3 Biến động quá trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S orientalis 4912-81-61 trong thiết bị lên men Bioflo Để xác định được thời điểm thu hồi CKS thích hợp nhất cần nghiên cứu động thái quá trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng 61... bào tử là 4,22 và 0,1% Thời gian chiếu là 70 giây số cá thể sống không tồn tại Rõ ràng khả năng tác động của tia UV lên tế bào trần của chủng 4912 mạnh hơn lên bào tử Điều này phù hợp với quy luật tự nhiên 3.4 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BIẾN CHỦNG Streptomyces orientalis 4912-81-61 Chủng 61 có khả năng ức chế các vi sinh vật kiểm định như Bacillus subtilis ATCC 6633, B cereus ATCC 21778, Sarcina lutea... nhất trên MT 48, sinh khối khô đạt 6,0 mg/ml Thành phần MT 48 đơn giản chỉ gồm cao nấm men (Việt Nam) và tinh bột tan, hai nguồn này rẻ tiền và rất sẵn có tại thị trường trong nước, do vậy MT 48 được chọn làm MT nhân giống 3.5.2 Lựa chọn môi trƣờng lên men Trên 11 MT lên men cơ bản cho xạ khuẩn sinh kháng sinh MT 1 - MT 11, chủng S orientalis 4912-81-61 đều có khả năng sinh trưởng và sinh CKS, tuy nhiên... Thực tập vi sinh vật học (Nguyễn Lân Dũng dịch), Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội 3 Vi Thị Đoan Chính (2000), Nghiên cứu nâng cao họat tính kháng sinh của chủng Streptomyces rimosus R77 và Streptomyces hygroscopicus 5820 bằng kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án tiến sỹ sinh học, Hà Nội Tiếng Anh 4 Alfonso R G (2000), The Science and Practice of Pharmacy, Lippicatt Willium & Wilkins 5 Allen... Có Phân giải gelatin Có Có Khả năng pepton hoá sữa Có Có Thuỷ phân tinh bột Có Có Không Không 28 - 30 28 - 30 pH tối ưu cho sinh trưởng 6-8 6-8 Khả năng chịu muối (%) . kháng sinh, … Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng Streptomyces orientalis 4912; khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. orientalis 4912; nâng cao. Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của xạ khuẩn Streptomyces orientalis Chu Thanh Bình Trường