Nghiên cứu gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc Nguyễn Văn Dũng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Khoa Sinh học Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn: PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa Năm bảo vệ: 2011 Abstract. Tổng quan về Virus suy giảm miễn dịch ở người (Human immunodeficiency Virus - HIV). Giới thiệu Protease của HIV-1 (gọi tắt là Protease HIV-1). Trình bày về nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu. Phát hiện đột biến kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1. Thiết kế hệ thống biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến N83T trong vector pET32a Keywords. Sinh học thực nghiệm; Gen; Đột biến kháng thuốc; HIV Content Virus suy giảm miễn dịch ở người (Human immunodeficiency virus - HIV) là nguyên nhân chính gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immunodeficiency Syndrome - AIDS) và là một trong những virus gây bệnh nguy hiểm nhất hiện nay. Theo các tài liệu đã công bố, có ít nhất hai type HIV gây nên AIDS đó là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2), nhưng HIV-1 là nguyên nhân chính gây ra AIDS trên toàn thế giới. Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới, tính đến cuối năm 2009 có khoảng 33,3 triệu người đang sống chung với HIV/AIDS, khoảng 1,8 triệu người đã chết vì AIDS và có thêm 2,6 triệu trường hợp mới bị nhiễm virus này. Ở Việt Nam, theo báo cáo Cục phòng chống HIV/AIDS - Bộ Y tế tính đến 31/3/2011, toàn quốc đã phát hiện người nhiễm HIV tại hơn 75,2% xã/phường, gần 97,9% quận/huyện và 63/63 tỉnh/thành phố. Tổng số trường hợp nhiễm HIV là 235.535 người, số bệnh nhân AIDS là 94.613 người, số trường hợp tử vong đến cuối kỳ báo cáo là 49.912 người. Trong chu trình sống của HIV-1, protease là enzyme không thể thiếu. Enzyme này cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) tại những vị trí nhất định để tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Vì thế protease được xem là một trong các đích tác động quan trọng nhất cho liệu pháp tìm ra thuốc điều trị HIV/AIDS. Tuy nhiên, do HIV sao chép nhanh, enzyme phiên mã ngược có tỷ lệ sai sót cao tạo ra sự biến đổi liên tục trong cấu trúc hệ gen của các nhóm HIV dẫn đến tình trạng kháng thuốc. Mặc dù ngày càng nhiều chất ức chế protease chống HIV được sản xuất và thương mại hóa nhưng việc tìm các chất ức chế mới của protease vẫn luôn được quan tâm. Bên cạnh đó, các đột biến kháng PI tương đối đặc hiệu cho từng loại thuốc riêng biệt, do đó thay thế một loại thuốc khác trước khi có sự tích lũy đột biến thì các phác đồ sau vẫn thành công (Hoffmann và tập thể, 2007). Vì vậy, xét nghiệm kháng thuốc thường theo hướng phát hiện đột biến trong gen mã hóa protease HIV-1 có vai trò rất quan trọng trong việc xây dựng phác đồ điều trị HIV/AIDS. Ở Việt Nam, gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc là vấn đề còn ít được nghiên cứu. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu ở người Việt Nam và tìm ra một số đột biến liên quan kháng thuốc. Đặc biệt, chưa có nghiên cứu nào về biểu hiện gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc phân lập từ các bệnh nhân người Việt Nam. Đề tài nghiên cứu của chúng tôi được đặt ra là nhằm phát hiện một số đột biến kháng thuốc trong gen mã hóa của protease của HIV, đồng thời bước đầu biểu hiện gen này trong vi khuẩn E. coli để làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo. Các nghiên cứu của luận văn được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về HIV 1.1.1. HIV/AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải được gọi tắt là AIDS, do virus HIV gây ra sự suy giảm miễn dịch ở người được phát hiện ở Mỹ năm 1981, đến nay đã trở thành “căn bệnh thế kỷ” trên toàn thế giới. Về phân loại, HIV là các Retrovirus có bộ máy di truyền thuộc họ Retroviridae với hai type chính là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2), trong đó HIV-1 gây ra 98% sự lan truyền còn HIV-2 chỉ chiếm ưu thế ở vùng tây châu Phi, ít lan truyền trên thế giới [1, 15]. Vì vậy, HIV-1 được xem như là nguyên nhân chính gây nên AIDS. HIV-1 được chia thành 3 nhóm là M (main), O (outlier), nhóm N (new) trong đó hơn 90% sự lây nhiễm của HIV thuộc nhóm M. Trong nhóm M gồm các phân nhóm A, B, C, D, F, G, H, J, K và nhiều dạng tái tổ hợp khác (circulating recombinant form-CRF). Các phân nhóm khác nhau chủ yếu ở cấu trúc của các protein vỏ và đặc trưng cho sự truyền nhiễm theo khu vực địa lý. Đây là một đặc điểm đáng lưu ý trong các nghiên cứu để tìm ra thuốc điều trị cho các bệnh nhân HIV/AIDS theo từng khu vực [14]. Về cấu trúc, HIV có dạng hình cầu với kích thước khoảng 120 nm, được mô tả ở hình 1. Lớp vỏ ngoài cùng của virus HIV bao gồm một lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào chủ, trên lớ vỏ này có chứa khoảng 72 bản sao protein env của virus, mỗi protein env lại chứa một mũ được tạo thành từ 3 phân tử gp120 còn thân được tạo thành từ 3 phân tử gp41 có chức năng neo giữ lõi virus với vỏ bao ngoài. Lõi virus có dạng như hạt đậu tạo thành từ 2.000 bản sao của protein p24. Trong lõi bao gồm hệ gen của HIV là hai sợi RNA (+) đơn, mỗi sợi có kích thước khoảng 10 kb gồm 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau. Cuối mỗi chuỗi RNA là các trình tự được gọi là trình tự lặp lại tận cùng dài (LTRs) đóng vai trò trong việc kiểm soát sự nhân lên cũng như điều hòa quá trình tổng hợp protein của virus. Giống như các retrovirus khác, HIV có 3 gen chính gag, pol và env mã hóa cho các protein tham gia vào quá trình sao chép và trưởng thành của virus. Sản phẩm ban đầu của gen gag là một protein 56 kDa, sau đó được chế biến thành ít nhất 3 sản phẩm p17, p24 và p15 là các protein cấu trúc của virus. Gen pol mã hóa cho các enzyme reverse transcriptase (RT), intergrase và protease trong đó enzyme RT có chức năng phiên mã ngược RNA của virus thành cDNA; enzyme intergrase chèn cDNA vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ còn protease tham gia vào quá trình cắt các phân tử protein tiền thân dưới dạng polypeptide thành các protein cấu trúc và chức năng cần cho sự hình thành của thể virus. Gen env mã hóa cho các glycoprotein capsid của virus; sản phẩm của gen env (gp160) được cắt bởi protease của tế bào chủ thành gp120 và gp41 sau đó lắp ráp lại thành cấu trúc tam phân trong lớp vỏ virus. Ngoài 3 gen chính, HIV còn có 6 gen khác (tat, rev, nef, vif, vpr và vpu) chứa thông tin mã hóa cho các protein có khả năng kiểm soát sự tái bản, các cách lây nhiễm khác nhau hoặc nguy cơ nhiễm các loại bệnh khác nhau [5, 17, 22]. 1.1.2. Tình hình nhiễm HIV/AIDS Theo thông báo của Tổ chức y tế thế giới (WHO) và Chương trình phối hợp phòng chống AIDS của Liên hiệp quốc (UNAIDS) đến cuối năm 2009 ước tính khoảng 33,3 triệu người đang mang căn bệnh HIV/AIDS, trong đó số đối tượng mới là 2,6 triệu người và có khoảng 1,8 triệu bệnh nhân đã chết vì AIDS. Tại khu vực châu Á, có khoảng 4,87 triệu người đang sống cùng với HIV/AIDS ở các khu vực Đông Nam và Nam Á; tình hình phát triển của bệnh này ngày càng tăng với những diễn biến phức tạp. Theo dự đoán, khu vực này sẽ trở thành trung tâm của đại dịch HIV/AIDS trong vài thập kỉ tới [37]. Ở Việt Nam, theo UNAIDS [36], tính đến ngày 30/9/2010 trên cả nước có 180.631 trường hợp nhiễm HIV/AIDS, trong đó có 42.339 bệnh nhân AIDS và tổng số người chết vì AIDS được báo cáo là 48.368. Cho đến nay, đã có trên 74% xã, phường và 97,8% quận, huyện trên toàn quốc báo cáo có người nhiễm HIV/AIDS. Thành phố Hồ Chí Minh vẫn là địa phương có tỷ lệ bệnh nhân HIV/AIDS cao nhất với 23% tổng số bệnh nhân trong cả nước. Phân tích hình thái lây nhiễm cho thấy, trong số những người mới được phát hiện nhiễm HIV trong 3 quí đầu năm 2010 có 49% bị nhiễm qua đường máu, 38% qua đường tình dục, 3% qua đường mẹ - con và 10% không rõ đường lây. Tỷ lệ nam giới nhiễm HIV chiếm 70,8% và nữ giới chiếm 29,2%. Phần lớn người nhiễm HIV được phát hiện trong 9 tháng qua ở tuổi từ 20-39 (chiếm 82%), trẻ em dưới 15 tuổi chiếm gần 3%. Theo đánh giá chung, tình hình nhiễm HIV/AIDS có xu hướng giảm nhưng đại dịch HIV/AIDS vẫn trong giai đoạn tập trung – xảy ra chủ yếu trong các nhóm có hành vi nguy cơ cao, đặc biệt trong nhóm tiêm chích ma túy và nhóm người mại dâm. Do những hậu quả to lớn của đại dịch HIV/AIDS đối với sự phát triển xã hội trên phạm vi toàn cầu, việc tìm ra vaccine phòng ngừa hiệu quả và thuốc đặc trị cho căn bệnh này là vấn đề cấp thiết đối với các nhà khoa học y học và sinh học phân tử. 1.1.3. Phƣơng pháp điều trị HIV/AIDS Cách điều trị HIV/AIDS phổ biến nhất là dùng thuốc chống virus, đây là thuốc có tác dụng ức chế sự phát triển và nhân lên của HIV ở những giai đoạn khác nhau trong vòng đời của virus. Hiện tại có một số nhóm chất chống HIV đang được sử dụng dựa trên cơ chế tương đồng về cấu trúc dẫn đến cạnh tranh hoạt động. Chúng được chia thành 5 nhóm chính gồm: các chất có bản chất nucleoside (NRTI) ức chế enzyme phiên mã ngược RT, các chất ức chế protease (PI), các chất ức chế enzyme phiên mã ngược không phải loại nucleoside (NNRTI), các chất ức chế enzyme phiên mã ngược dạng nucleotide (NTRTI) và các chất ức chế hòa nhập không cho virus nhân bản. HIV/AIDS còn có thể được điều trị bằng các thuốc điều hòa miễn dịch như alpha-interferon, interleukin 2, loprinasine với tác dụng tăng cường khả năng bảo vệ hệ miễn dịch. Ngoài ra, bệnh nhân HIV/AIDS còn có thể được điều trị với một số thuốc phòng ngừa các bệnh cơ hội [15]. Tuy nhiên, do HIV có tỷ lệ đột biến cao dẫn đến tình trạng kháng thuốc và việc sử dụng thuốc điều trị trong thời gian dài dẫn đến các tác dụng phụ. Chính vì vậy, hướng nghiên cứu tìm ra các loại thuốc chống HIV/AIDS mới cũng như liệu pháp điều trị bằng cách kết hợp các loại thuốc khác nhau đã và đang là vấn đề cấp bách hiện nay. 1.2. Protease của HIV-1 (gọi tắt là protease HIV-1) Protease HIV-1 là một enzyme không thể thiếu trong chu trình sống của virus. Protease cần thiết để phân cắt các tiền chất polyprotein virus gag và gag-pol thành những protein cấu trúc và chức năng trong quá trình trưởng thành của virus [39]. Các nghiên cứu cho thấy, khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây đột biến trên gen mã hóa cho protease, các hạt virus được hình thành nhưng không có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ [19]. Với vai trò đặc biệt quan trọng như trên, protease HIV-1 là một trong các đích nghiên cứu nhằm tìm ra loại thuốc ngăn chặn sự nhân lên của HIV. 1.2.1. Gen mã hóa protease HIV- 1 Hệ gen của HIV-1 nằm trong phần lõi của virus và bao gồm hai sợi RNA (+) đơn, mỗi sợi có chiều dài khoảng 9,8 kb và có 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau. Trên mỗi sợi RNA có 3 gen cấu trúc là gag, pol và env; trong đó gag có nghĩa “group-antigen” (kháng nguyên nhóm), pol là “polymerase” và env là “envelope” (vỏ). Các gen gag và env mã hóa cho nucleocapsid và glycoprotein của màng virus; gen pol mã hóa cho 3 enzyme: reverse transcriptase, integrase và protease. Ngoài ra, HIV-1 còn có 6 gen (vif, vpu, vpr, tat, rev và nef) ở vùng RNA 9 kb (Hoffmann và tập thể, 2007). Do tốc độ sinh sản nhanh của HIV – 1, có khoảng 10 triệu hạt virus mới được tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót rất cao của enzyme reverse transriptase (1/10.000 base) dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm bệnh thậm chí khi chưa dùng thuốc. Nghiên cứu trên các bệnh nhân nhiễm chủng CRF01_AE thất bại trong điều trị HAART ở Nonthaburi, Thailand được đăng ký trên GenBank với số hiệu từ FJ463512- FJ463596, phát hiện các đột biến phụ (minor) kháng thuốc PI là M36I và H69K ở hầu hết các bệnh nhân, I13V, E35D và L89M ở hơn 84% các bệnh nhân được điều trị ATV, ATV/r, IDV/r, NFV, TPV/r. Các nghiên cứu về gen mã hóa protease HIV-1 ở Việt Nam chủ yếu tập trung vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu ở người Việt Nam và tìm ra một số đột biến liên quan đến tính kháng thuốc. Năm 2003, Nguyễn Hoàng Lan và tập thể [21] đã tiến hành đọc trình tự các gen mã hóa RT, protease và env trên các bệnh nhân nhiễm HIV-1 ở miền Nam, chủ yếu là ở thành phố Hồ Chí Minh. 198 trong số 200 bệnh nhân nghiên cứu thuộc phân nhóm CRF01_AE. Nghiên cứu cũng xác định được 6,5% đột biến kháng thuốc chính khi sử dụng HAART đối với 200 bệnh nhân này. Ishizaki và tập thể [15] cũng tiến hành đọc trình tự gen mã hóa protease và RT trên đối tượng các bệnh nhân nhiễm HIV-1 ở Hải Phòng. Phân tích hình thái di truyền của hơn 1.000 bệnh nhân cũng cho thấy phân nhóm HIV-1 gây bệnh của yếu là CRF01_AE (chiếm 98,3%). Phân tích đột biến kháng thuốc trên 294 bệnh nhân đã chỉ ra có 0,3% đột biến liên quan đến kháng thuốc ức chế protease tại vị trí M46I. Trong các đột biến kháng thuốc thì phổ các đột biến kháng PI rất rộng có thể do sự đa hình xảy ra ở 49 gốc axit amin trong tổng số 99 axit amin của protease. Mặc dù có sự kháng chéo từ mức độ vừa đến mức độ cao giữa các PI, các đột biến chính là tương đối đặc hiệu cho từng thuốc riêng biệt. Phần lớn các dữ liệu về đột biến chính phát sinh từ các bệnh nhân điều trị PI không tăng cường (PI thế hệ thứ nhất). Đột biến chính rất hiếm gặp ở các phác đồ điều trị bằng PI tăng cường (Hoffmann và tập thể, 2007). Khi điều trị saquinavir không tăng cường chủ yếu xảy ra đột biến G48V và làm giảm độ nhạy với saquinavir 10 lần; nếu kèm thêm đột biến L90M, mức độ nhạy cảm với saquinavir giảm rõ hơn trên 100 lần (Jacobsen và tập thể, 1995). Trong khi đó, phải cần ít nhất 4 trong số các đột biến L10I/R/V, G48V, I54V/L, A71V/T, V77A, V82A, I84V và L90M mới có thể làm giảm hiệu lực của saquinavir tăng cường (Valer và tập thể, 2002). 1.2.2. Cấu trúc của protease HIV-1 Navia và tập thể tại phòng thí nghiệm Mecrk [27] là nhóm đầu tiên tạo được cấu trúc tinh thể của protease HIV-1 vào năm 1989, kể từ đó cấu trúc của protease đã được nghiên cứu rộng rãi cả về chức năng, tính đặc hiệu cơ chất cũng như sự liên kết với các chất ức chế. Protease HIV-1 là một dimer, chứa hai tiểu phần giống hệt nhau được sắp xếp gần như theo kiểu đối xứng, mỗi tiểu phần có khối lượng khoảng 11 kDa gồm 99 axit amin 1.2.3. Chức năng của protease HIV-1 Protease là enzyme không thể thiếu có vai trò quan trọng trong quá trình tái bản của HIV-1. Nó cắt phân tử polyprotein (gag, gag-pol) thành các protein cấu trúc, có chức năng cần thiết cho virus trưởng thành. Cụ thể, protease HIV-1 nhận biết 9 trình tự peptide khác nhau trên polypeptide gag để tạo ra các protein cấu trúc: matrix, capsid, nucleocapsid cùng với các protein có khối lượng phân tử bé p2, p1 và p6 có vai trò trong quá trình lắp ráp và xác định hình thái của lớp vỏ trưởng thành; thủy phân polypeptide gag-pol tạo thành 3 enzyme: protease, RT và intergrase cần thiết cho quá trình sao chép của virus HIV và thủy phân polypeptide env thành các protein vỏ gp120 và gp41 của HIV-1 [4, 39] (Hình 3). Hoạt tính của protease HIV-1 bị ức chế bởi pepstatin A [21] giống như các protease aspartyl khác. Khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây đột biến trên gen mã hóa cho protease, các hạt virus được hình thành nhưng không đóng gói phù hợp để tạo thành thể virus trưởng thành, nên chúng không có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ. Ngoài ra, protease HIV-1 còn đóng vai trò trong quá trình phát sinh bệnh. Khi chuyển vào tế bào người hoặc virus, protease HIV-1 gây độc và cắt nhiều protein của vật chủ như actin, Bcl2 và procaspase 8. Các nghiên cứu cũng khẳng định, sử dụng các chất ức chế protease có thể ngăn chặn hiện tượng chết theo chương trình do protease HIV-1 gây nên [34]. 1.2.4. Tạo protease HIV-1 tái tổ hợp Nhìn chung, các nghiên cứu về biểu hiện protease HIV-1 cho thấy quá trình sản xuất enzyme này gặp nhiều khó khăn do: protease gây độc với tế bào chủ; protein đích được biểu hiện chủ yếu ở dạng không hòa tan (90% ở dạng thể vùi); hàm lượng thu được rất thấp chỉ có thể phát hiện bằng phương pháp thẩm tách miễn dịch [19, 23]. Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng cho thấy, bằng việc đồng biểu hiện với plasmid pLysS, pLysE có thể hạn chế được tính độc và protease HIV-1 khi được biểu hiện cùng với các protein dung hợp sẽ làm tăng hiệu suất biểu hiện, tăng tính tan và thuận tiện cho tinh sạch nhưng vẫn đảm bảo hoạt tính [10, 23-24, 35]. Ở Việt Nam, protease HIV-1 là một trong số những enzyme được nghiên cứu nhiều nhất trong những thập kỷ qua và các nghiên cứu chủ yếu là điều tra, tách chiết và nghiên cứu một số tính chất trên đối tượng vi sinh vật. Tuy nhiên, protease HIV-1 từ các bệnh nhân Việt Nam là vấn đề chưa được nghiên cứu nhiều. Năm 2010, Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể [2] đã thành công trong biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1 trên hệ thống vector pET32a, ở tế bào E. coli. Protease HIV-1 biểu hiện có hoạt tính cắt cơ chất tổng hợp giống trong tế bào chủ. Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu 2.1.1. Mẫu huyết thanh Mẫu huyết thanh đã bất hoạt virut lấy từ các bệnh nhân đang điều trị kháng virut tại Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương. 2.1.2.Các hệ vector và chủng vi sinh vật Đoạn gen mã hóa protease của HIV được đưa vào vector nhân dòng pCR2.1 là kết quả của nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể [2]. Vector nhân dòng pGEM-T của hãng Promega. Các vector: pET28a, pET32a và pET43a của hãng Novagen (Mỹ). Các chủng vi khuẩn E. coli DH5α; E. coli BL21 (DE3) pLysS; E. coli BL21 (DE3) RIL được mua từ hãng Novagen. 2.1.3. Hóa chất Thang chuẩn protein nhuộm sẵn, hỗn hợp dNTP (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) của hãng Fermentas. Các oligonucleotide được thiết kế và đặt mua từ hãng Invitrogen. Kit tinh sạch DNA trên gel điện di của hãng Bioneer và Fermentas. Các hoá chất giải trình tự do hãng Beckman Coulter cung cấp. Kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 được mua từ hãng Gene-Tex. Gel sắc ký ái lực His-bind của hãng Novagen. Các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tách chiết RNA hệ gen HIV-1 và tổng hợp cDNA 2.2.2. Tổng hợp cDNA từ RNA virus 2.2.2. Tách chiết và định lƣợng DNA 2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose 2.2.4. Nhân bản các đoạn gen bằng kỹ thuật PCR 2.2.5. Nhân dòng đoạn gen mã hóa protease HIV-1 2.2.6. Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng phƣơng pháp Sanger 2.2.7. Biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 ở E. coli 2.2.8. Tinh sạch protease HIV-1 bằng cột sắc ký ái lực His-bind (Novagen) 2.2.10. Nhận dạng protease HIV-1 bằng thẩm tách miễn dịch (Western blotting) 2.2.11. Phân tính hoạt độ của protease HIV-1 theo phƣơng pháp của Richard va ̀ tâ ̣ p thê ̉ Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phát hiện đột biến kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1 3.1.1. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 Trong một nghiên cứu trước đây, Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể [3] đã tiến hành nhân bản đoạn gen mã hóa cho protease của HIV đã sử dụng kỹ thuật PCR lồng với hai cặp mồi HIV Fw1/Rv1 (cặp mồi ngoài) và HIV FW2/RV2 (cặp mồi trong). Trong nghiên cứu này, các tác giả (chúng tôi là đồng tác giả) đã nhân bản thành công đoạn gen kích thước khoảng 0,34 kb mã hóa cho protease HIV từ 8 trong số 50 bệnh nhân được bệnh viện xác nhận là nhiễm HIV-1. Trong số 8 mẫu dương tính này chỉ có 2 bệnh nhân thuộc nhóm đã và đang điều trị thuốc kháng virus (trong đó có thuốc ức chế protease-PI). Đoạn gen cũng đã được nhóm tác giả nhân dòng và lưu giữ trong vector pCR2.1 dưới dạng pCR2.1-Prot. Vì vậy chúng tôi đã chọn vector pCR2.1-Prot mang đoạn gen của 01 bệnh nhân điều trị thuốc kháng virus ký hiệu là 02VN.HN27510 cho các nghiên cứu tiếp theo. Trước hết, chúng tôi đã tiến hành giải trình tự đoạn gen thu được sau đó được so sánh với trình tự của đoạn gen tương ứng của HIV thuộc phân nhóm CRF01_AE, mã số EU518273 của Trung Quốc [41]. Kết quả giải trình tự (hình 4) cho thấy đoạn gen mã hóa protease HIV-1 từ vector tái tổ hợp pCR2.1-Prot có độ tương đồng 96% so với đoạn gen mã hóa protease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE mã số EU518273 của Trung Quốc. Các vị trị có sự sai khác về trình tự nucleotide so với trình tự EU518273 trên Ngân hàng gen là: A6G, A37G, A43G, T105A, A120G, G225A, A248C, T282C, T285C, C297T. Trình tự gen này đã được chúng tôi đăng ký trong Ngân hàng gen quốc tế với số hiệu HQ890881. 3.1.2. Phát hiện đột biến kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1 (Đột biến N83T) Chúng tôi đã sử dụng phần mềm Genetyx để dịch trình tự nucleotide của gen mã hóa proteaase thành trình tự axit amin và so sánh trình tự axit amin suy diễn thu được với trình tự axit amin được suy ra từ trình tự gen EU518273 (hình 5) và thấy rằng trình tự axit amin của mẫu virus trong nghiên cứu của chúng tôi có độ tương đồng 96 % so với trình tự axit amin của đối chứng. Các vị trí thay đổi về axit amin là I13V, I15V, D36E, N83T. Đặc biệt, đối chiếu trình tự axit amin của protease với ngân hàng dữ liệu HIV quốc tế cho thấy sự thay thế axit amin Asn ở vị trí 83 bằng Thr (N83T) là một đột biến bất thường và có tính kháng nhẹ thuốc PI (hình 6). Những bệnh nhân nặng được điều trị PI hay xảy ra đột biến N83D với sự thay thế N bằng D ở vị trí axit amin 83 [42]. Trong trường hợp bệnh nhân 02VN.HN27510, đột biến N83T là loại đột biến lần đầu tiên được tìm thấy trong gen mã hóa của protease HIV-1. Hình 5: So sánh trình tự axit amin của protease HIV-1 thu nhận ở Việt Nam (HQ890881) so với trình tự của EU518273 trong Ngân hàng Gen quốc tế. 3.2. Thiết kế hệ thống biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến N83T trong vector pET32a Việc thiết kế hệ thống biểu hiện gen mã hóa cho protease HIV-1 mang đột biến N83T được dựa trên cơ sở kết quả biểu hiện gen protease HIV-1 của Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể (dẫn liệu chưa công bố). Cụ thể là đoạn gen mã hóa cho protease HIV mang đột biến kháng thuốc N83T được đưa vào vector pET32a dưới dạng protein dung hợp như được mô tả ở hình 7. Trong đó thioredoxin và đuôi his-tag là của vector pET32a, còn trình tự nhận biết và phân cắt của protease HIV-1, đoạn HA mã hóa cho epitope của kháng nguyên vỏ hemagglutinin (HA) của virus cúm tại đầu C cu ̉ a protease HIV -1 là do chúng tôi dự kiến thiết kế để đưa vào cùng với gen mã hóa cho protease HIV-1. HA có ái lực rất mạnh với gel protein G-sepharose hay gel anti-HA-agarose, nhờ đó sẽ giúp tăng khả năng tinh sa ̣ ch protease tái tổ hợp. Epitope của HA bao gồm 9 axit amin là YPYDVPDYA, kích thước nhỏ nên thường không ảnh hưởng đến đặc tính của protein đích. Theo cách thiết kế này, nếu gen mã hóa cho protease HIV-1 được biểu hiện và không có hoạt tính tự cắt của protease HIV-1 tại liên kết Phe-Pro thì protein tái tổ hợp được tạo thành sẽ dung hợp thioredoxin tại đầu N, có đuôi HA và His-tag, với tổng số 282 gốc axit amin với khối lượng phân tử khoảng 31 kDa. Ngược lại, nếu protein tái tổ hợp tự cắt tại vị trí đặc hiệu của protease HIV-1 thì sẽ tạo ra protease HIV-1 tái tổ hợp gắn đuôi HA và His-tag với KLPT khoảng 12 kDa. Hình 7: Sơ đồ cấu trúc protein dung hợp với protease HIV-1để biểu hiện trong vector pET32a 3.2.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến kháng thuốc N83T 3.2.2. Gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy và biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH5 3.2.3. Đƣa gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến kháng thuốc vào vector pET32a Để khẳng định chắc chắn vector pET32a tái tổ hợp thu được mang đoạn gen mã hoá protease HIV-1, chúng tôi đã tiến hành đọc trình tự gen mã hóa protease HIV-1 trong vector pET32a. Hình 14: Trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 trong vector pET32-ProtHA : Axit amin mở đầu và trình tự Trx.Tag : Vị trí cắt giới hạn của enzyme BamHI và Spe I : Trình tự tự cắt : Trình tự protease HIV-1 mang đột biến N83T : Trình tự 9 axit amin HA : Trình tự của enzyme XhoI : Trình tự 6 His.Tag 3.2.4. Cảm ứng biểu hiện protease HIV-1 mang đột biến N83T trong vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) RIL Kết quả điện di cũng còn cho thấy protein tái tổ hợp có mặt trong phân đoạn kết tủa nhiều hơn trong dịch chiết. Tuy vậy, băng protein tái tổ hợp 19 kDa là không tương đương với KLPT của protease HIV-1 tái tổ hợp dạng dung hợp gắn với thioredoxin (KLPT tổng cộng là 31 kDa) hay dạng tự cắt khỏi thioredoxin (12 kDa). 3.2.5. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực His-bind Kết quả điện di protein cho thấy phân đoạn không hấp thụ trên cột có chứa một số băng protein khác nhau, phân đoạn rửa chiết bằng imidazol gần như chỉ có một băng protein khoảng 19 kDa, chứng tỏ protein này đã được tinh sạch. Kết quả phân tích thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 cho thấy kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 không nhận biết băng protein 19 kDa trong dịch hòa tan kết tủa của tế bào cũng như băng protein tái tổ hợp đã được tinh sạch. Chúng tôi cũng đã thử khả năng phân cắt cơ chất đặc hiệu của chế phẩm protein tái tổ hợp thu được, tuy nhiên kết qủa cho thấy protein thu được là không có hoạt tính. Kết quả khẳng định rằng protein mà chúng tôi thu được không phải là protease HIV-1 hoặc chỉ chứa một phần nhỏ của protein nên không thể hiện tính kháng nguyên cũng như hoạt tính xúc tác của protease HIV-1. Tóm lại, chúng tôi đã phát hiện được một đột biến kháng nhẹ thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1 phân lập từ một bệnh nhân Việt Nam đang điều trị bằng thuốc kháng virus và đã bước đầu đưa được gen này vào hệ thống vector biểu hiện pET32a dưới dạng dung hợp với gen mã hóa cho thioredoxin cùng với trình tự nhận biết và phân cắt của protease HIV-1. Tuy vậy chúng tôi chưa thành công trong việc biểu hiện được gen mã hóa protease HIV-1 để tạo ra một protein có hoạt tính KẾT LUẬN Từ các kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Đã nhân bản, nhân dòng và xác định được trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV- 1 thu nhận tại Việt Nam và phát hiện được một đột biến thay thế nucleotide A bằng C ở vị trí 248 (A248C), dẫn đến sự thay thế asparagine (N) ở trí 83 bằng threonine (T) trong protein. Đột biến này được xác nhận là có tính kháng nhẹ thuốc ức chế protease. 2. Đã đưa được gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến N83T vào vector biểu hiện pET32a dạng dung hợp với thioredoxin cùng với trình tự nhận biết và phân cắt của protease HIV-1 và biến nạp được vào tế bào E. coli BL21 (DE3) RIL. Protein biểu hiện từ tế bào mang vector tái tổ hợp có khối lượng phân tử khoảng 19 kDa, được tinh sạch qua cột sắc ký ái lực hisbind nhưng không được nhận biết bởi kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 cũng như không có hoạt tính phân cắt cơ chất đặc hiệu của enzyme. KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục nghiên cứu một cách có hệ thống trên diện rộng gen mã hóa protease HIV để phát hiện các đột biến kháng PI mới phục vụ công tác điều trị và nghiên cứu. 2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa cho protease HIV-1 mang đột biến N83T và các đột biến kháng PI khác để tìm hiểu các đặc trưng xúc tác cũng như ảnh hưởng của các thuốc ức chế protease lên hoạt độ của chúng, góp phần làm sáng tỏ tính chất kháng thuốc trong điều trị bệnh AIDS. References Tài liệu tiếng Việt: 1. Đỗ Ngọc Liên (2008), Miễn dịch học cơ sở, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. 2. Nguyễn Thị Hồng Loan, Hồ Xuân Hùng, Ngô Thị Huyền Trang, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2010), “Nhân dòng và bước đầu biểu hiện gen mã hóa protease của HIV type 1 phân lập ở Việt Nam”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(2), tr. 227-233. 3. Nguyễn Thị Hồng Loan, Nguyễn Văn Dũng, Nguyễn Thị Trang Huyền, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2011), “Một số đột biến trong gen mã hóa protease HIV type 1 phân lập ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ (ĐHQGHN) (đang in). Tài liệu tiếng Anh 4. Alastair, J. J., Wood, M. D. (1998), “HIV protease inhibitors”, Engl. J. Med, 338, pp. 1281-1292. 5. Chen, H., Xu, Z., Yin, X., Cen, P. (2007), “Cloning and expression of the HIV protein in Escherichia coli cell-free system”, Appl. Micrbiol. Biotechnol, 77, pp. 347–354. 6. Cheng, Y. S. E, McGowan, M. H, Kettner C. A, Schloss, J. V., Erickson, S., Yin F. H. (1990), “High-level synthesis of recombinant HIV-1 protease and the recovery of active enzyme from inclusion bodies”, Gene, 87, pp. 243-248. 7. Daar, E. S., Little, S., Pitt, J., Santagelo, J., Ho, P., Harawa, N., Kemdt, P., Giogi, J. V., Bai, J., Gaut, P., Richman, D. A., Mandel, S., Nicholas, S. (2001), “Diagnosis of primary HIV-1 infection”, Ann. Int. Med, 134, pp. 25-29. 8. Darke, P. L., Leu, C. T., Davis, L. J., Heimbach, J. C., Diehl, R.E., Hill, W. S., Dixon, R. A , Sigal, I. S. (1989), “Human immunodeficiency virus protease: bacterial expression and characterization of the purified aspartic protease”, J. Biol. Chem, 264, pp. 2307-2312. 9. Debouck, C., Gorniak, J. G., Strickler, J. E., Meek, T. D., Metcalf B. W., Rosenberg, M. (1987), “Human immunodeficiency virus protease expressed in Escherichia coli exhibit autoprocessing and specific maturation of the gag precursor”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, pp. 8903-8906. 10. Dergousova, N. L., Amerik, A. Y., Volynskaya, A. M., Rumsh, A. D. (1996), “HIV-1 protease cloning, expression, and purification”, Appl. Biochem. Biotechnol, 61, pp. 97-108. 11. Francessca, C., Gago, F., Bertoli, A., Forbici, F. (2004), “Identification of the minimal conserved structure of HIV-1 protease in the presence and absence of drug pressure”, AIDS, 12, pp. 9-11. 12. Geoghegan, K. F., Spender, R. W., Danley, D. E., Contillo, L. G., Andrews, G. C., (1990), “Fluorescence-based continuous assay for the aspartyl protease of human immunodeficiencyl virus HIV-1”, FEBS Lett, 262(1), pp. 119-122. 13. Graves, M. C., Lim J. J., Heimer, E. P. (1988) “An 11-kDa form of human immunodeficiency virus protease expressed in Escherichia coli is sufficient for enzymatic activity”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 2449-2453. 14. Hare, B. C. (2006), “Clinical overview of HIV”, HIV Insite Knowledge Base Chapter. Nguồn www.hivinsite.ucsf.edu. 15. Hoffman, C., Rockstroh, J., Kamps, B. S., HIV Medicine (2006) from www. HIVMedicine.com. 16. Ishizaki, A., Cuong, N. H., Thuc, P. V., Trung, N. V., Saijoh, K., Kageyama, S., Ishigaki, K., Tanuma, J., Oka, S., Ichimura, H. (2009), “Profile of HIV type 1 infection and genotypic resistance mutations to antiretroviral drugs in treatment- naive HIV type 1-infected individuals in Hai Phong, Viet Nam”, AIDS Res. Hum. Retrovir., 25, pp. 175-182. 17. Janeway, C. (2001), Immunobiology, Garland Science, USA. 18. Komai, T., Ishikawa, Y., Yagi, R., Suzuki-Sunagawa, H., Nishigaki ,T., Handa, H. (1997), “Development of HIV-1 protease expression methods using the T7 phage promoter system”, Appl. Microbiol. Biotechnol., 47, pp. 241-245. [...]... purification of mature HIV- I protease in Escherichia coli under control of the araBAD promoter”, Appl Microbiol Biotechnol., 37, pp 205-210 UNAIDS in Vietnam, from www.unaids.org.vn United nations program on HIV/ AIDS, UNAIDS/WHO AIDS, Epidemic update: December 2010 Wan, M., Takagi, M., Loh, N B., Xu, X Z., Imanaka T (1996), “Autoprocessing: an essential step for the activation of HIV- 1 protease , Biochem... “Continuos spectrophotometric assay for retroviral protease of HIV- 1 and AMV”, Biochem Biophys Research Commun., 163(2), pp 1079-1085 27 Navia, M A., Fitzgerald, P M., McKeever, B M., Leu, C.T., Heimback, J C., Herber W K., Sig, I S., Darke P.L., Springer J P (1989), “Three-dimensional structure of aspartyl protease from human immunodefiency virus HIV- 1”, Nature Rev., 337 (6208), pp 615-620 28 Nijhuis,... Sinsheimer, J S., Kaplan, A H (1996), “In vivo sequence diversity of the protease of human immunodeficiency virus type 1: presence of protease inhibitor-resistant variants in untreated subjects”, J Virol., 70, pp 2038–2043 23 Leuthardt, A., Roesel, J L (1993), “Cloning, expression and purification of a recombinant polyhistidine-linked HIV- 1 protease , FEBS Lett, 326 (1, 2,3), pp 275-280 24 Louis, J M., Mcdonald,... activation of HIV- 1 protease , Biochem J., 316, pp 569-573 Yunfeng, T (2006), “Crystallographic analysis and kinetic studies of HIV- 1 protease and drug-resistant mutants”, pp 25-34 Chemistry Dissertations Paper 2 (from http://digitalarchive.gsu.edu/chemistry_diss/2) http://www.aids-india.org/hivbasics2.htm http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU518273 http://sierra2.stanford.edu/sierra/servlet/JSierra?action=sequenceInput... V V (1998), “Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases”, Microbiol Mol Biol Rev., 62, pp 600-601 31 Richards, A D., Phylip, L.H., Farmerie, W G., Scarborough, P E., Alvares, A., Dunn, B M., Hirel, H., Konvalinka, J., Strop, P., Pavlickova, L., Kostla, J., Kay V (1990), “Sensitive, soluble chromogenic substrates for HIV- 1 Proteinase”, J Biol Chem USA, 265 (14), pp 7733-7736 32 Rangwala,... 265 (14), pp 7733-7736 32 Rangwala, S H., Finn, R F., Smith, C.E., Berberich, S A., Salsgiver, W J., Stallings, W C., Glover, G I., Olins, P O (1992), “High-level production of active HIV- 1 protease in Escherichia coli”, Gene, 122, pp 263-269 33 Sambrook, J., Russell, D W (2000), Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp 15-22 34 35 36 37 38 39 40 41 42 Shedlock, D J., Daniel H., Andy,... Oroszilan S., Mora, P T (1991), “Autoprocessing of the HIV- 1 protease using purified wild-type and mutated fusion proteins expressed at hing level in Escherichia coli”, Eur J Biochem., 199, pp 361-369 25 Louis, J M., Nashed, N T., Parris, K D., Kimmel, A R., Jerina D M (1994), “Kinetics and mechanism of autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease from an analog of the Gag-pol protein”,... novel substrate-based HIV- 1 protease inhibitor drug resistance mechanism”, Plos Med., pp 152-163 29 Nutt, R F., Brady, S F., Darke, P L., Ciccarone, T M., Nutt, E M., Rodkey, J A., Bennett, C.D., Waxman, L H., Sigal, I S., Anderson, P S., Veber D F (1988), “Chemical synthesis and enzymatic activity of a 99-residue peptide with a sequence proposed for the human immunodeficiency virus protease , Proc Natl... Laemmli, U K (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature.227, pp: 680-685 21 Lan, N T., Recordon-Pinson, P., Hung, P V., Uyen, N T., Lien, T T (2003), HIV type 1 isolates from 200 untreated individuals in Ho Chi Minh City (Vietnam): ANRS 1257 study, Large predominance of CRF01_AE and presence of major resistance mutations to antiretroviral drugs”, AIDS . tìm ra một số đột biến liên quan kháng thuốc. Đặc biệt, chưa có nghiên cứu nào về biểu hiện gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc phân lập. rộng gen mã hóa protease HIV để phát hiện các đột biến kháng PI mới phục vụ công tác điều trị và nghiên cứu. 2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa cho protease