Đánh giá biểu biểu gen mã hóa Pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1) chủng Pichia pastoris tái tổ hợp sinh Amylase Interleukin-2 kỹ thuật Real-time PCR Thân Văn Minh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn: GS.TS Trương Nam Hải Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Tổng quan Pichia pastoris; α-factor geneMF(ALPHA)1; protein ngoại lai kỹ thuật Real-time PCR Nghiên cứu vật liệu như: chủng vi sinh vật gene biến nạp; mồi cho phản ứng PCR Real-time PCR; hóa chất, enzyme thiết bị máy móc; phần mềm loại mơi trường dung dịch Trình bày phương pháp nghiên cứu: Phương pháp lên men nuôi cấy chủng P pastoris tái tổ hợp; phương pháp tách chiết tinh mRNA từ P Pastoris; kỹ thuật PCR; kỹ thuật Real-time PCR; xử lý số liệu sử dụng phần mềm LightCycler 4.0 Đưa kết thảo luận: Lên men chủng P pastoris tái tổhợp; tách chiết tinh RNA tổng số từ dịch nuôi cấy tế bào nấm men; tối ưu điều kiện cho phản ứng Realtime PCR; kết Real-time PCR với gene nội chuẩn IPP1; real-time PCR biểu gene MF(ALPHA)1; so sánh kết Real-time PCR Microarray Keywords: Sinh học thực nghiệm; Gen mã hóa; Di truyền hóa sinh học; Nấm men Content MỞ ĐẦU Những kết phân tích so sánh hệ transcriptome chủng P pastoris đối chứng, chủng sinh tổng hợp interleukin-2, chủng sinh tổng hợp amylase cho thấy có gen có khác biệt biểu gen chủng nghiên cứu có gen mã hóa pheromone lai alpha (MF(ALPHA) Kỹ thuật Real-time PCR đánh giá biểu gen có độ nhạy, độ xác lớn thực với số lượng mẫu lớn để đánh giá biểu gen (MF(ALPHA)1 từ có định hướng cho nghiên cứu nhằm nâng cao mức độ biểu gen ngoại lai chủng nấm men P pastoris tái tổ hợp Vì chúng tơi tiến hành thực đề tài “Đánh giá biểu biểu gen mã hóa Pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1) chủng Pichia pastoris tái tổ hợp sinh Amylase Interleukin-2 kỹ thuật Real-time PCR” Cơng việc tiến hành Phịng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hệ thống biểu Pichia pastoris 1.1.1 Đặc điểm hệ biểu P pastoris P pastoris thuộc họ Saccharomycetaceae sinh vật nhân chuẩn, có khả trao đổi methanol Tất chủng biểu hệ biểu P pastoris có nguồn gốc từ chủng dại NRRL-Y 11430 Bảng 1.1: Các chủng biểu P Pastoris Tên chủng X-33 GS115 KM71H GS115/Albumin MC100-3 SMD1168 SMD1165 Kiểu gen Chủng dại his4 his4 arg4 aox1Δ::AGR4 his4 his4 ar4g aox1Δ::SAGR4 aox2Δ::Phis4 Pre4Δ his4 Prb his4 Kiểu hình Mut+ Mut+HisMuts HisMuts Mut-HisMut+His- khuyết protease Mut+His- khuyết protease 1.1.2 Những ƣu điểm hệ biểu P pastoris P pastoris có khả thực nhiều biến đổi sau dịch mã đặc trưng sinh vật nhân chuẩn Có promoter mạnh AOX1 GAPDH Chất cảm ứng biểu protein methanol, rẻ tiền Quá trình lên men thực nhanh chóng 1.1.3 Q trình chuyển hóa methanol P pastoris Q trình chuyển hóa methanol xảy bào quan chuyên biệt peroxisome để tránh tác dụng gây độc hydrogen peroxide 1.1.4 Cơ chế tiết protein nấm men Mặc dù nhiều trình tự tín hiệu tiết khác sử dụng thành cơng, trình tự tín hiệu tiết prepropeptide α-factor S cerevisiae xem thành công 1.1.5 Vector biểu gene ngoại lai P pastoris 1.1.5.1 Đặc điểm chung vector biểu P pastoris Promoter mạnh: thường promoter AOX1 Có nhiều vị trí đa cắt nối (MCS) Trình tự kết thúc dịch mã Gen thị chọn lọc Một trình tự cần thiết cho chép tồn plasmid vi khuẩn 1.1.5.2 Vector pPIC9 1.1.6 Tích hợp gen ngoại lai vào P pastoris Các vector biểu P pastoris thiết kế tương đồng với locus AOX1 hay locus his4 Giống S cerevisiae, DNA dạng thẳng giúp ổn định trình biến nạp vào P pastoris nhờ sát nhập hay tái tổ hợp với trình tự tương đồng gene nấm men DNA tái tổ hợp tồn ổn định với dạng đa gene tế bào chủ Ở chủng Mut+ (Muts), gene sát nhập locus his4 trao đổi chéo locus his4 nhiễm sắc thể nấm men vector biểu (Hình 1.5) Kết cho nhiều vector vị trí his4 có kiểu hình His+ Làm thẳng vector enzyme cắt giới hạn vị trí his4, kiểu hình Mut + hay MutS tùy thuộc vào chủng chủ sử dụng Các dòng nấm men tái tổ hợp đa vector biểu chiếm 1-10% chủng His+ biến nạp 1.2 Tổng quan α-factor gen MF(ALPHA)1 Nhân tố alpha chuỗi peptide gồm 13 amino acid (aa) mã hóa gen cấu trúc riêng biệt, MF1, MF2 Gen MF(ALPHA)1 khơng có chủng P pastoris gốc ban đầu, vector biểu pPIC9, đưa vào chủng nấm men P pastoris trình tạo chủng tái tổ hợp 1.3 Tổng quan protein ngoại lai đề tài 1.3.1 Tổng quan Interleukin-2 Interleukin-2 (IL-2) người biết đến dấu tiên yếu tố kích thích tăng trưởng tế bào T, lymphokine có khả quản lý đáp ứng miễn dịch mạnh xác định chất dùng hỗ trợ điều trị ung thư 1.3.2 Tổng quan α-amylase: Amylase xúc tác cho trình thủy phân liên kết glycoside tinh bột, glycogen polysaccaride tương tự α-Amylase nấm men S fibuligera nghiên cứu gồm trình tự aixit amin có tính bảo thủ cao nằm trung tâm hoạt động enzyme 1.4 Kỹ thuật Real-time PCR 1.4.1 Tổng quan Real-time PCR Trong kỹ thuật PCR truyền thống kết thí nghiệm xác định hồn tất cơng đoạn thí nghiệm, cơng đoạn PCR thường nhiều thời gian Sự đời kỹ thuật Real-time PCR bước đột phá công nghệ sinh học Kỹ thuật cho phép xác định kết thí nghiệm sau chu kỳ nhiệt phản ứng PCR, gọi “Real-time” Kỹ thuật Real-time PCR đặc trưng giới hạn định lượng rộng, độ nhạy cảm cao đủ để phát phân tử khả lặp lại cao (độ lệch chuẩn nhỏ 0,2 chu kỳ) Kỹ thuật Real-time PCR đặc trưng giới hạn định lượng rộng, độ nhạy cảm cao đủ để phát phân tử khả lặp lại cao 1.4.2 Phân tích kết Real-time PCR 1.4.2.1 Biểu đồ khuếch đại Real-time PCR (amplification graph) 1.4.2.2 Chu kỳ ngƣỡng (Ct) Chu kỳ ngưỡng trị số xác định số chu kỳ mà đường biển diễn khuếch đại cắt đường (basal cycle) 1.4.2.3 Biểu đồ nóng chảy Sản phẩm khuếch đại từ dimer primer khác biệt với sản phẩm DNA đích chiều dài, nên phân biệt được đường biểu diễn khuếch đại ống phản ứng sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích từ dimer primer tính chất đặc trưng nhiệt độ chảy (melting To, Tm), Nhiệt độ chảy sợi đôi DNA tùy thuộc vào thành phần GC chiều dài nó: Thành phần GC cao Tm cao, sợi đơi dài Tm cao Sản phẩm khuếch đại từ DNA đích dài nên có Tm cao Tm sản phẩm khuếch đại từ dimer primer 1.4.2.4 Phƣơng pháp so sánh định lƣợng tƣơng đối 2ΔCt Phản ứng khuếch đại Real-time PCR diễn theo cấp số nhân, mẫu có chu kỳ ngưỡng chênh đơn vị tương đương với khác biệt khoảng lần hàm lượng RNA gene đích Tỷ lệ lượng RNA mẫu thử mẫu đối chứng tính theo công thức: Tỷ lệ mẫu thử/đối chứng = 2Ct(C)-Ct(T) CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Chủng vi sinh vật gen biến nạp Chủng nấm men P pastoris SMD1168 [ pep4, his4] tích hợp pPIC9 - P pastoris pPIC9 chủng đối chứng – control - P pastoris pPIC9Amy (chủng Amy) - P pastoris pPIC9IL-2 (chủng IL-2) 2.1.2 Mồi cho phản ứng PCR Real-time PCR Tên mồi Trình tự nucleotide IPP1-Fw IPP1-Rv MF(ALPHA)1-Fw MF(ALPHA)1-Rv1 5’-TACGGTGCCTTCCCTCAG-3’ 5’-TCCCTCATCCAACAAAGCCATAAC-3’ 5’-CTGCAGTTTTATTCGCAGCATCC-3’ 5’-GCAGCAATGCTGGCAATAGTAG-3’ 2.1.3 Hóa chất, enzyme thiết bị máy móc  Hóa chất, enzyme:dùng hóa chất enzyme dùng cho sinh học phân tử  Máy móc thiết bị:Máy Real-time PCR máy LightCycler Roche version 2.0 2.1.4 Phần mềm Phần mềm LightCycler 4.0 2.1.5 Các loại môi trƣờng dung dịch a Môi trường nuôi cấy chọn lọc biểu gen ngoại lai tế bào nấm mem Pichia pastoris b Dung dịch tách chiết mRNA từ nấm mem - Dung dịch BY1 gồm có 1M sorbitol, 0.5M EDTA có bổ sung thêm 0.1% mercaptoethanol zymolase tới nồng độ cuối 300 µg/ml - Dung dịch RLT theo kit sử dụng để phá thành tế bào bổ sung 1% mercaptoethanol trước sử dụng - Dung dịch RW1 sử dụng để làm mẫu tách chiết - Dung dịch RPE bổ sung ethanol theo tỉ lệ RPE: Ethanol sử dụng để làm mẫu tách chiết c Dung dịch xử lý DNA lẫn mẫu RNA tách chiết - Dung dịch EDTA 25mM - Dung dịch DEPC 1%: Pha DEPC nước đến nồng độ 1% để loại bỏ tồn RNase nước, sau đem khử trùng dung dịch để loại bỏ DEPC - Dung dịch RLT RPE (kit QiaGen) d Dung dịch loại bỏ Rnase - Dung dịch DEPC 1% để dung dịch sử dụng cho trình loại bỏ RNase môi trường e Dung dịch sử dụng điện di DNA gel agarose - Dung dịch DEPC 1% để dung dịch sử dụng cho trình loại bỏ RNase môi trường f Dung dịch sử dụng điện di SDS-PAGE 2.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp lên men nuôi cấy chủng P pastoris tái tổ hợp 2.2.2 Phƣơng pháp tách chiết tinh mRNA từ P Pastoris a Phương pháp xử lý dụng cụ thí nghiệm để loại bỏ mRNA - Tồn dụng cụ thí nghiệm như: pipet, đầu tip, ống ly tâm, khơng có RNase Pipet chúng tơi lau dung dịch DEPC 1% Đầu tip ống ly tâm sản phẩm chứng nhận RNase DNase - Các dụng cụ khác bể chứa, khay đổ điện di, chai thủy tinh pha dung dịch ngâm dung dịch DEPC 1% khoảng 2h trước khử trùng ướt - Nước cất lần, lần dung dịch cần thiết khác bổ sung DEPC trước khử trùng để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn RNase dung dịch b Phương pháp tách chiết mRNA tổng số Dịch tế bào nuôi cấy kiểm tra OD600 máy quang phổ để xác định lượng tế bào cần thiết cho việc tách chiết Số lượng tế bào tối đa theo khuyến cáo QiaGen khoảng 5.107 tế bào cho cột tách chiết Mẫu RNA tổng số tế bào nấm men tách chiết dựa kit tách chiết Qiagen (RNeasy Mini Kit), tế bào phá theo phương pháp dung giải enzyme Lấy 5x107 tế bào ly tâm 5000 vòng/ phút(v/p) phút 40C, sau hịa ml đệm Y1 (1M Sorbitol, 0.1 M EDTA, pH 7.4; 0.1% β-ME and 250 unit lyticase) Hỗn hợp lắc nhẹ 30 phút 30°C để tạo tế bào trần mẫu ly tâm phút 8000 v/p để thu tế bào trần Kết tủa thu hòa 350 μl buffer RLT có chứa 1.43 M β-mercapto ethanol khuấy mạnh nhằm dung giải tế bào trần Hỗn hợp bổ sung thể tích cồn ethanol 70%, đảo đưa lên cột RNeasy có chứa màng lo ̣c Cartridges có tác dụng cố định RN A Cột RNeasy sau ly tâm 13000 vịng 15 giây phần dịch qua màng sau bị loại bỏ Màng lọc gắn RNA cột RNeasy rửa lần với 700μl dung dịch đệm RW1 rửa lần lần lần với 500 μl dung dịch đệm RPE qua ly tâm phút 13000v/p Sau đó, màng lọc ly tâm thêm phút 13000v/p để loại bỏ đệm dư thừa Màng lọc đưa sang ống eppendorf mới; bổ sung 50 μl nước xử lý với DEPC ly tâm phút 13000v/p để thu mẫu mRNA tổng số Để quá trình th u mẫu hiê ̣u quả , bước mẫu đươ ̣c tiế n hành lầ n Mẫu RNA xử lý với DNaseI (6 units) để loại bỏ DNA tạp Hỗn hợp phản ứng ủ 37°C thời gian 30 phút Thêm 11 ul dung dịch EDTA 25mM, trộn ủ 65°C 10 phút để dừng phản ứng bất hoạt enzyme DNase I Cuối cùng, mẫu tinh qua cột lần để loại bỏ enzyme DNaseI dung dịch đệm phản ứng 2.2.3 Kỹ thuật PCR Phản ứng khuếch đại Real-time PCR diễn theo cấp số nhân, mẫu có chu kỳ ngưỡng chênh đơn vị tương đương với khác biệt khoảng lần hàm lượng RNA gene đích Tỷ lệ lượng RNA mẫu thử mẫu đối chứng tính theo cơng thức: 2.2.4 Kỹ thuật Real-time PCR Phản ứng Real-time PCR máy LightCycler Roche sử dụng chất nhuộm huỳnh quang SYBR Green I Chất có đặc điểm dung dịch có DNA mạch kép gắn vào sợi kép phát quang bị chiếu nguồn sáng kích thích Ưu điểm SYBR Green I có nhiễu thấp không gắn chặt vào sợi kép nên không làm ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất PCR Máy LightCycler lập trình để thu nhận tín hiệu huỳnh quang phát từ mẫu thời gian phản ứng Lượng sản phẩm PCR lớn, tín hiệu thu mạnh Từ tín hiệu này, máy số hóa lưu lại dạng liệu thô 2.2.5 Xử lý số liệu sử dụng phần mềm LightCycler 4.0 Xác định số Ct (Crossing Point) mẫu Trong phản ứng Real-time PCR, chu trình mà tín hiệu huỳnh quang mẫu vượt lên mức huỳnh quang gọi Ct (Crossing Point) mẫu Trong đồ thị, Ct thể hiệu đường cong lên đột ngột, điểm mà sản phẩm PCR bắt đầu diện số liệu Ct mẫu phụ thuộc vào nồng độ DNA ban đầu mẫu Một mẫu có nồng độ DNA ban đầu thấp cần nhiều chu trình có số Ct cao, mẫu có nồng độ cao cần chu trình có Ct thấp Định lượng tương đối đơn sắc/đơn kênh (Relative Quantification-Mono Color): Phân tích định lượng tương đối dựa sở nồng độ DNA Crossing Point với tất mẫu chứa loại DNA đích Mỗi mẫu địi hỏi số chu trình khác để đạt tới Crossing Point, tùy thuộc vào nồng độ DNA ban đầu mẫu Đến cuối thí nghiệm, nồng độ DNA mẫu khác nhau, phụ thuộc vào số chu trình hồn thành sau mẫu đạt tới Crossing Point Phương pháp định lượng tương đối sử dụng Ct, mức độ hiệu phản ứng, số chu trình, số giá trị khác để xác định nồng độ DNA mẫu tăng kết thúc PCR Các tính tốn sau sử dụng để so sánh mẫu tính tỉ lệ cuối gene đích gene tham chiếu Đường cong nóng chảy (Melting Curves) đỉnh nóng chảy (Melting Peak): Nhiệt độ nóng chảy DNA thay đổi khoảng rộng, phụ thuộc vào trình tự, độ dài, thành phần GC chuỗi Chỉ cần sai khác base hai DNA dẫn tới thay đổi nhiệt độ nóng chảy Chính vậy, số nhiện độ nóng chảy sử dụng để nhận diện sản phẩm DNA Để phân tích nhiệt độ nóng chảy, phát huỳnh quang mẫu cần theo dõi nhiệt độ máy LightCycler tăng lên chậm Khi nhiệt độ tăng, mức độ phát huỳnh quang giảm Trong trường hợp chất nhuộm SYBR Green I, giảm xảy tách mạch đơn DNA mạch kép, dẫn tới giải phóng phân tử SYBR Green I CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Lên men chủng P pastoris tái tổ hợp Các chủng P pastoris SMD1168 mang vector pPIC9 nuôi cấy môi trường MD đặc Kết điện di khẳng định gene ngoại lai đưa vào chủng P pastoris MSD1168 biểu thành protein ngoại lai, sở để tiến hành thí nghiệm 3.2 Tách chiết tinh RNA tổng số từ dịch nuôi cấy tế bào nấm men 3.2.1 Tách chiết RNA tổng số Kết hình cho thấy đường chạy có băng điện di sắc nét, tương ứng với hai băng 28S 18S rRNA ribosome Sự xuất băng chứng tỏ RNA không bị phân cắt mẫu đủ tiêu chuẩn cho thí nghiệm 3.2.2 Tinh mRNA Khi tách RNA ln có lẫn lượng DNA định mẫu nên phải loại bỏ lượng DNA này, để kết phân tích Real-time PCR địi hỏi mẫu RNA tách chiết có độ tinh cao đặc biệt khơng bị lẫn DNA [30], mẫu RNA cịn lẫn DNA ảnh hưởng trực tiếp tới kết nghiệm DNA nhân lên, nên việc loại bỏ DNA yêu cầu bắt buộc Mẫu xử lý enzyme DNaseI 37°C 30 phút để enzyme hoạt động loại bỏ toàn DNA cịn lại mẫu Tiếp bất hoạt enzyme EDTA 25mM cho mẫu qua cột để thu sản phẩm RNA có độ tinh cao khơng lẫn DNA Để kiểm tra đánh giá dùng phương pháp sau: - PCR với mẫu RNA tổng số với cặp mồi đặc trưng cho gene il-2 - Điện di so sánh kết trước sau loại DNA enzyme DNaseI - Thực Real-time PCR với mẫu RNA để kiểm tra chất lượng RNA có đảm bảo hay khơng a Điện di kiểm tra mẫu RNA tổng số trước sau xử lý loại DNA enzyme DNaseI Qua ảnh điện di thấy mẫu sản phẩm RNA tổng số sau xử lý loại DNA làm qua cột RNeasy-mini QiaGene có độ cao b Kết PCR kiểm tra có mặt DNA mẫu RNA tách chiết Khi mẫu RNA xử lý enzyme DNaseI DNA lẫn bị phân giải hết, để khẳng định điều đồng thời thử đánh giá sảm phẩm tách, tiến hành chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu gene il-2 để chứng minh mẫu có DNA hay không chạy Real-time PCR để kiểm tra mRNA mẫu 10 Kết thí nghiệm cho đánh giá chất lượng mẫu RNA phương diện mẫu có lẫn DNA hay khơng mẫu có đủ tiêu chuẩn thực phản ứng Realtime PCR hay không Trên đường chạy số 2, sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số sau xử lý loại DNA chủng P pastoris mang gene il-2 Trên đường chạy 4,5 sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số sau xử lý loại DNA chủng P pastoris mang gene mã hóa cho amylase Các băng điện di khơng xuất chứng tỏ khơng cịn DNA mẫu RNA tổng số Trên đường chạy số chạy PCR với mẫu RNA tổng số chủng control Trên đường chạy điện di số chạy Realtime PCR với mẫu đối chứng âm không mang gene ngoại lai nên khơng có băng 3.2.3 Đo hàm lƣợng mẫu RNA tổng số Lần lên men Lần lên men Mẫu A260/28 ng/µL A260/280 ng/µL Lần lên men A260/28 ng/µL A-0h A-6h A12h A-24 A48h A72h A96h C-0h C-6h C12h C24h C48h C72h C96h I-0h I-6h I-12h 471,1 619,3 324,9 585,0 672,9 521,0 742,3 399,8 470,0 356,6 566,2 587,1 593,2 706,8 581,6 387,8 320,9 2,17 913,80 2,21 391,02 2,20 2,24 620,53 2,21 385,47 2,20 2,20 614,46 2,21 326,78 2,22 2,23 142,87 2,20 507,42 2,23 2,21 449,67 2,18 617,99 2,22 2,19 1130,6 2,19 598,58 2,21 2,20 631,76 2,20 466,49 2,19 2,18 802,78 2,21 457,88 2,15 2,15 730,30 2,19 408,68 2,18 2,19 600,96 2,20 559,64 2,21 2,22 35,59 2,30 470,52 2,15 2,22 672,00 2,18 730,92 2,22 2,19 982,23 2,20 408,52 2,21 2,20 655,07 2,19 355,59 2,20 2,23 717,58 2,21 361,24 2,18 2,19 697,24 2,22 503,49 2,23 2,20 604,04 2,22 776,55 2,22 11 I-24h 569,9 686,0 704,1 916,1 I-48h I-72h I-96h 2,21 2,23 2,21 2,22 193,63 1002,0 1291,5 656,81 2,18 181,14 2,07 2,20 391,02 2,20 2,19 395,47 2,20 2,19 336,78 2,22 Từ bảng 3.1 thấy nồng độ mRNA mẫu cao, với mẫu thấp đạt 320 ng/µL, mẫu có số A260/A280 lớn 1,8 phần lớn mẫu cao 2,0 kết hợp lý sản phẩm chứa phần lớn RNA Với kết cho thấy RNA thu đủ điều kiện để sử dụng cho Real-time PCR 3.3 Tối ƣu điều kiện cho phản ứng Real-time PCR 3.3.1 Tối ƣu điều kiện Real-time PCR với gene chuẩn IPP1  Tối ưu nồng độ mRNA phản ứng Real-time PCR Tiến hành phản ứng PCR với nồng độ 50, 100, 250, 500 ng/µL Kết điện di cho thấy, nồng độ mRNA khuôn 100 ng/µL cho kết Real-time PCR tốt  Kết Real-time PCR thay đổi nhiệt độ gắn mồi Chúng tiến hành phản ứng Real-time PCR với nồng độ mRNA 100ng/µL tiến hành với chương trình chạy ban đầu có điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi từ 54°C lên 58°C, nhận thấy nhiệt độ 58°C cho kết tốt nhất.Như vậy, thành công việc thiết lập chương trình phản ứng Real-time PCR với gene chuẩn IPP1 3.3.2 Tối ƣu phản ứng Real-time PCR với gene đích MF(ALPHA)1 3.4 Kết Real-time PCR với gene nội chuẩn IPP1 Trước tiến hành thí nghiệm với gene đích cần nghiên cứu MF(ALPHA)1, thực Real-time PCR nhằm nghiên cứu biểu gene nội chuẩn IPP1 chủng control, Amy IL-2 thời điểm nghiên cứu giờ, 24 48 Biểu đồ khuếch đại gene IPP1 mẫu Real-time PCR Mẫu Contro 0h Chu kỳ ngưỡng (Ct) Lên men lần I Lên men lần II 16.35 16.51 12 l Amy IL-2 24 h 48 h 0h 24 h 48 h 0h 24 h 48 h 18.47 20.21 15.96 18.64 20.43 14.91 18.79 19.26 18.67 19.79 16.55 18.51 19.65 16.51 18.91 20.09 3.5 Real-time PCR biểu gene MF(ALPHA)1 3.5.1 Kết Real-time PCR đoạn gene MF(ALPHA)1 Kết cho thấy phụ thuộc tuyến tính mức độ biểu gene MF(ALPHA)1 với mức độ biểu gene ngoại lai (il-2 amylase) Cuối tiến hành kiểm tra sản phẩm phẩn ứng Real-time PCR cách điện di gel agarose 1% Kết ảnh điện di cho thấy gene MF(ALPHA)1 nhân lên chủng Amy Il-2 Kết phù hợp với kết phân tích đỉnh nóng chảy bên 3.5.2 Phân tích so sánh mức độ biểu gene MF(ALPHA)1 Thời Giá trị Ct trung bình điểm thu Control Amy IL-2 mẫu 25,60 ± 20,02 0h 20,70 ± 0,26 1,41 0,23 26,77 ± 16,26 6h 14,75 ± 0,48 0,90 1,19 26,56 ± 15,61 12h 15,22 ± 0,47 0,98 0,77 26,40 ± 16,84 24h 15,96 ± 0,78 0,59 0,83 26,52 ± 17,01 48h 16,45 ± 0,31 0,89 0,72 26,51 ± 17,19 72h 16,65 ± 0,35 0,90 0,53 26,72 ± 17,64 96h 17,16 ± 0,35 1,00 0,65 ± ± ± ± ± ± ± 3.5.2.1 So sánh mức độ biểu gene theo thời gian lên men chủng Kính thước khác hai gene, vai trò khác hai gene thân tế bào P pastoris biểu hiện… Control So sánh 0h 6h 12h 24h 48h 72h 6h 0,30 12h 0,34 1,16 24h 0,38 1,29 1,11 48h 0,35 1,19 1,03 0,92 - 13 72h 96h 0,36 0,31 1,20 1,04 1,04 0,90 0,93 0,80 1,01 0,87 0,86 Tỷ lệ khác biệt gene MF(ALPHA)1 theo thời gian chủng P pastoris mang gene mã hóa cho amylase theo giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình Thời gian Amy thu mẫu 0h 6h 61,82 12h 44,74 24h 26,78 48h 19,03 72h 16,60 96h 11,67 6h 0,72 0,43 0,31 0,27 0,19 12h 0,60 0,43 0,37 0,26 24h 0,71 0,62 0,44 48h 0,87 0,61 72h 1,42 Tỷ lệ khác biệt gene MF(ALPHA)1 theo thời gian chủng P pastoris mang gene mã hóa cho interleukin-2 theo giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình Thời gian IL-2 thu mẫu 0h 6h 13,55 12h 24h 9,04 48h 8,07 72h 7,11 96h 3.5.2.2 21,26 5,21 6h 1,5 0,6 0,6 0,5 0,3 12h - 24h - 48h - 72h - - - - - 0,43 - - - 0,38 0,89 - - 0,33 0,79 0,88 - 0,24 0,58 0,64 0,73 So sánh mức độ biểu gen MF(ALPHA)1 theo thông số chủng 3.6 So sánh kết Real-time PCR Microarray Phân tích Real-time PCR cho kết tương đồng xu hướng biểu đoạn gene MF(ALPHA)1 chủng nghiên cứu Cụ thể biểu chủng control thời điểm thấp so với chủng Amy IL-2 14 KẾT LUẬN Đã tách chiết thành công mẫu RNA tổng số phục vụ cho tiến hành thí nghiệm Realtime PCR Các mẫu đạt chất lượng nồng độ độ tinh cao, đảm bảo yêu cầu Đã tối ưu hóa thành cơng phản ứng chương trình chạy Real-time PCR với gene chuẩn IPP1 gene đích MF(ALPHA)1 Thiết lập thành công phản ứng Real-time PCR sử dụng SYBR GREEN I, hệ máy LightCycler 2.0 phân tích phần mềm LightCycler 4.0 Roche để định lượng tương đối biểu phiên mã tín hiệu tiết MF(ALPHA)1 chủng tái tổ hợp sinh Amylase Interleukin-2 KIẾN NGHỊ Nghiên cứu mức độ biểu cấp độ protein chủng P Pastoris ctái tổ hợp sinh Amylase Interleukin-2 thời điểm khác nuôi cấy bawnfd kĩ thuật ELISA References Tài liệu tham khảo tiếng Việt: Nguyên Văn Hùng (2010), PCR Real-time PCR vấn đề áp dụng thường gặp, NXB Y học Võ Thị Thương Lan (2009), Sinh học phân tử tế bào ứng dụng, NXB Giáo dục, Hà Nội Tài liệu tham khảo tiếng Anh: Dorak MT (2006), Real-time PCR, Taylor & Francis, New York Higgins DR, Cregg JM (1998), Pichia protocols, Humana Press, Totowa, N.J Bengtsson M, Karlsson HJ, Westman G, Kubista M (2003), "A new minor groove binding asymmetric cyanine reporter dye for real-time PCR".Nucleic Acids Res, 31 (8), p 21-45 Bustin SA (2000), "Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays".J Mol Endocrinol, 25 (2), p 169-193 Bustin SA (2002), "Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems".J Mol Endocrinol, 29 (1), p 23-39 Caplan S, Kurjan J (1991), "Role of alpha-factor and the MF alpha alpha-factor precursor in mating in yeast".Genetics, 127 (2), p 299-307 Catala C, Rose JK, York WS, Albersheim P, Darvill AG, Bennett AB (2001), "Characterization of a tomato xyloglucan endotransglycosylase gene that is downregulated by auxin in etiolated hypocotyls".Plant Physiol, 127 (3), p 1180-1192 15 10 Cereghino JL, Cregg JM (2000), "Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris".FEMS Microbiol Rev, 24 (1), p 45-66 11 Cha HJ, Dalal NN, Bentley WE (2005), "Secretion of human interleukin-2 fused with green fluorescent protein in recombinant Pichia pastoris".Appl Biochem Biotechnol, 126 (1), p 1-11 12 Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Higgins DR (2000), "Recombinant protein expression in Pichia pastoris".Mol Biotechnol, 16 (1), p 23-52 13 Daly R, Hearn MT (2005), "Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production".J Mol Recognit, 18 (2), p 119-138 14 Du J, Yang H, Zhang D, Wang J, Guo H, Peng B, Guo Y, Ding J (2010), "Structural basis for the blockage of IL-2 signaling by therapeutic antibody basiliximab".J Immunol, 184 (3), p 1361-1368 15 Duong CT, Le TTH, Nguyen TN, Nguyen HT, Le TLA, Truong NH (2011), "Microarray-Based Transcriptome Analysis of Recombinant Pichia Pastoris Strains Overexpressing Alpha-Amylase and Interleukin-2".International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), (1), p 16 Fuller RS, Sterne RE, Thorner J (1988), "Enzymes required for yeast prohormone processing".Annu Rev Physiol, 50 p 345-362 17 Ginzinger DG (2002), "Gene quantification using real-time quantitative PCR: an emerging technology hits the mainstream".Exp Hematol, 30 (6), p 503-512 18 Han MJ, Jeong KJ, Yoo JS, Lee SY (2003), "Engineering Escherichia coli for increased productivity of serine-rich proteins based on proteome profiling".Appl Environ Microbiol, 69 (10), p 5772-5781 19 Jahic M, Veide A, Charoenrat T, Teeri T, Enfors SO (2006), "Process technology for production and recovery of heterologous proteins with Pichia pastoris".Biotechnol Prog, 22 (6), p 1465-1473 20 Jelicks LA, Naider FR, Shenbagamurthi P, Becker JM, Broido MS (1988), "A type II beta-turn in a flexible peptide: proton assignment and conformational analysis of the alpha-factor from Saccharomyces cerevisiae in solution".Biopolymers, 27 (3), p 431449 21 Klein D (2002), "Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations".Trends Mol Med, (6), p 257-260 22 Kurjan J (1985), "Alpha-factor structural gene mutations in Saccharomyces cerevisiae: effects on alpha-factor production and mating".Mol Cell Biol, (4), p 787-796 23 Kurjan J, Lipke PN (1986), "Agglutination and mating activity of the MF alpha 2encoded alpha-factor analog in Saccharomyces cerevisiae".J Bacteriol, 168 (3), p 1472-1475 16 24 Li P, Anumanthan A, Gao XG, Ilangovan K, Suzara VV, Duzgunes N, Renugopalakrishnan V (2007), "Expression of recombinant proteins in Pichia pastoris".Appl Biochem Biotechnol, 142 (2), p 105-124 25 Liss B, Roeper J (2004), "Correlating function and gene expression of individual basal ganglia neurons".Trends Neurosci, 27 (8), p 475-481 26 Manfredi JP, Klein C, Herrero JJ, Byrd DR, Trueheart J, Wiesler WT, Fowlkes DM, Broach JR (1996), "Yeast alpha mating factor structure-activity relationship derived from genetically selected peptide agonists and antagonists of Ste2p".Mol Cell Biol, 16 (9), p 4700-4709 27 Michaelis S, Herskowitz I (1988), "The a-factor pheromone of Saccharomyces cerevisiae is essential for mating".Mol Cell Biol, (3), p 1309-1318 28 Murasugi A, Tohma-Aiba Y (2003), "Production of native recombinant human midkine in the yeast, Pichia pastoris".Protein Expr Purif, 27 (2), p 244-252 29 Nevoigt E, Kohnke J, Fischer CR, Alper H, Stahl U, Stephanopoulos G (2006), "Engineering of promoter replacement cassettes for fine-tuning of gene expression in Saccharomyces cerevisiae".Appl Environ Microbiol, 72 (8), p 5266-5273 30 Peters IR, Helps CR, Hall EJ, Day MJ (2004), "Real-time RT-PCR: considerations for efficient and sensitive assay design".J Immunol Methods, 286 (1-2), p 203-217 31 Pfaffl MW (2001), "A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR".Nucleic Acids Res, 29 (9), p 113-45 32 Radonic A, Thulke S, Mackay IM, Landt O, Siegert W, Nitsche A (2004), "Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR".Biochem Biophys Res Commun, 313 (4), p 856-862 33 Svanvik N, Stahlberg A, Sehlstedt U, Sjoback R, Kubista M (2000), "Detection of PCR products in real time using light-up probes".Anal Biochem, 287 (1), p 179-182 34 Trimble RB, Atkinson PH, Tschopp JF, Townsend RR, Maley F (1991), "Structure of oligosaccharides on Saccharomyces SUC2 invertase secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris".J Biol Chem, 266 (34), p 22807-22817 35 Walker NJ (2002), "Tech.Sight A technique whose time has come".Science, 296 (5567), p 557-559 36 Wittwer CT, Herrmann MG, Moss AA, Rasmussen RP (1997), "Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification".Biotechniques, 22 (1), p 130-131, 134-138 37 Wright A, Morrison SL (1997), "Effect of glycosylation on antibody function: implications for genetic engineering".Trends Biotechnol, 15 (1), p 26-32 38 Zipper H, Brunner H, Bernhagen J, Vitzthum F (2004), "Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications".Nucleic Acids Res, 32 (12), p 133-103 17 39 Kurjan J, Herskowitz I (1982), Structure of a yeast pheromone gene (MF alpha): a putative alpha-factor precursor contains four tandem copies of mature alpha-factor 41 http://www.eolss.net/Sample-Chapters/C17/E6-58-04-09.pdf 42 http://www.invitrogen.com 43 http://www.sciencemag.org 44 http://www.yeastgenome.org 18 ... 391, 02 2 ,20 2, 24 620 ,53 2, 21 385,47 2, 20 2, 20 614,46 2, 21 326 ,78 2, 22 2 ,23 1 42, 87 2, 20 507, 42 2 ,23 2, 21 449,67 2, 18 617,99 2, 22 2,19 1130,6 2, 19 598,58 2, 21 2, 20 631,76 2, 20 466,49 2, 19 2, 18 8 02, 78... 2, 21 457,88 2, 15 2, 15 730,30 2, 19 408,68 2, 18 2, 19 600,96 2, 20 559,64 2, 21 2, 22 35,59 2, 30 470, 52 2,15 2, 22 6 72, 00 2, 18 730, 92 2 ,22 2, 19 9 82, 23 2, 20 408, 52 2 ,21 2, 20 655,07 2, 19 355,59 2, 20 2, 23... 2, 20 2, 23 717,58 2, 21 361 ,24 2, 18 2, 19 697 ,24 2, 22 503,49 2, 23 2, 20 604,04 2, 22 776,55 2, 22 11 I -24 h 569,9 686,0 704,1 916,1 I-48h I-72h I-96h 2, 21 2, 23 2, 21 2, 22 193,63 10 02, 0 129 1,5 656,81 2, 18