Biểu hiện β-Galactosidase trong vi khuẩn Bacillus subtilis Nguyễn Thị Thúy Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Sinh học Luận văn Thạc sĩ ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70 Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Quỳnh Uyển Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Tổng quan cơ sở lý luận về vi khuẩn B: Sơ lược về vi khuẩn B. subtilis, cấu trúc operon lac, gen lacZ và β- galactosidase, Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn, cài nhập vector biểu hiện vào B. subtilis. Giới thiệu nguyên liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu. Trình bày một số kết quả đạt được và đưa ra một số khuyến nghị nhằm nâng cao hiệu quả nghiên cứu của đề tài. Keywords. Di truyền học; Sinh học; Vi khuẩn Bacillus subtilis Content MỞ ĐẦU Hiện nay, phần lớn các hệ vector (cả hệ vector nhân dòng và vector biểu hiện) cho Escherichia coli đều đã được thương mại hóa [75]. Tuy nhiên, E. coli được xem là sinh vật có khả năng gây bệnh và tiết độc tố. Chính vì vậy, việc sử dụng E. coli như tế bào vật chủ để biểu hiện gen còn nhiều hạn chế. Bên cạnh đó, Bacillus subtilis, đại diện tiêu biểu của nhóm vi sinh vật Gram dương, với vai trò là tế bào vật chủ, đã thể hiện nhiều ưu điểm hơn so với E. coli. Đó là khả năng không gây bệnh (B. subtilis được Hiệp hội Thuốc và Thực phẩm của Mỹ FDA coi là “genereally regarded as safe”- GRAS) và khả năng chịu đựng các điều kiện nuôi cấy, bảo quản khắc nghiệt hơn [18, 25]. Trong nghiên cứu cơ bản, B. subtilis đã được sử dụng như mô hình để nghiên cứu khả năng biệt hoá và cơ chế điều hoà hoạt động của gen trong tế bào [24]. Trong hướng phát triển các vacxin thế hệ mới, B. subtilis đã được phát hiện và nghiên cứu như một công cụ chuyển kháng nguyên an toàn và tiềm năng [19, 17, 59]. Mặc dù có nhiều ưu điểm với vai trò là tế bào vật chủ so với E. coli nhưng các vector thương phẩm dùng cho việc tách dòng và biểu hiện gen sử dụng cho vi khuẩn B. subtilis vẫn chưa xuất hiện rộng rãi trên thị trường. Nguyên nhân là gen ngoại lai cần được cài nhập thẳng vào nhiễm sắc thể của vi sinh vật này, và gen ngoại lai cần phải có đầy đủ các yếu tố cần thiết cho việc biểu hiện gen. Ở Việt Nam, cho đến thời điểm này mới chỉ có rất ít các công trình nghiên cứu về biểu hiện gen trong B. subtilis như biểu hiện gen trên vỏ bào tử [14], hoặc biểu hiện gen trong tế bào sinh dưỡng, có sử dụng chất cảm ứng IPTG [7] và vẫn chưa có nghiên cứu nào công bố về việc biểu hiện gen trong tế bào sinh dưỡng của B. subtilis mà không cần sử dụng chất cảm ứng. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Biểu hiện β-galactosidase trong vi khuẩn B. subtilis” với mục đích biểu hiện gen trong tế bào sinh dưỡng, mà không cần sử dụng chất cảm ứng nhằm góp phần mở rộng khả năng ứng dụng vi sinh vật an toàn này trong lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Sơ lƣợc về vi khuẩn B. subtilis 1.1. Lịch sử, đặc điểm phân loại theo hệ thống Bergey, đặc điểm hình thái và sự phân bố của vi khuẩn B. subtilis Vào năm 1835, vi khuẩn B. subtilis (tên ban đầu là Vibrio subtilis) được phát hiện bởi Christian Gottfried Ehrenberg. Sau đó, (năm 1872) Ferdinand Cohn đã phân loại và đổi tên thành B. subtilis [69]. B. subtilis là một trong những vi khuẩn đầu tiên được nghiên cứu như mô hình của quá trình biệt hóa và phát triển tế bào. 1.2. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn B. subtilis Trong các điều kiện môi trường không thuận lợi, vi khuẩn B. subtilis hình thành nội bào tử. Nội bào tử ở trung tâm có kích thước 0,5-0,8 X 0,4 µm. Sự hình thành bào tử xảy ra trong nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất. Đầu tiên, nucleotid kéo dài trở thành một sợi trục. Sau đó, tế bào hình thành một vách ngăn và bắt đầu phân chia thành hai phần. Phần nhỏ hơn của tế bào được gọi là các tiền bào tử (forespore) và phần lớn hơn được gọi là tế bào mẹ [54]. Tế bào mẹ nuôi dưỡng tiền bào tử. Khi hình thành vách ngăn, 30% số nhiễm sắc thể đã nằm bên trong tế bào mẹ, 70% nhiễm sắc thể còn lại chuyển vào tiền bào tử thông qua một loại protein vận chuyển được gọi là SpoIIIE [60]. 1.3. Cấu trúc genome Toàn bộ bộ gen của B. subtilis đã được giải trình tự vào năm 1997 [39]. Tế bào vi khuẩn B. subtilis chỉ có một phân tử DNA nằm trong một nhiễm sắc thể tròn. Kích thước tổng thể của DNA là 4.214.814 cặp bp (4,2 Mbp). Khoảng 87% bộ gen (bao gồm 4.100 gen) mã hóa cho protein. Trong 4.100 gen thì có 192 gen được cho là không thể thiếu và 79 gen được cho là cần thiết cho các quá trình sống của B. subtilis. Hầu hết các gen cần thiết tham gia vào quá trình trao đổi chất. 1.4. Tính an toàn và ứng dụng của B. subtilis Tính an toàn của B. subtilis đối với ngƣời và động vật Ở châu Âu và ở Mỹ, B. subtilis được chỉ định là đủ điều kiện về an toàn và không hề có tác dụng phụ (QPS, Qualified Presumption of Safety) hay GRAS (Genrally Regarded As Safe) [21]. Một số chủng B. subtilis và họ hàng gần của nó là B. licheniformis, B. pumulis, B. megaterium có khả năng sản xuất lecithinase, một enzyme có khả năng phá vỡ màng động vật có vú. Tuy nhiên, vẫn chưa có bằng chứng nào cho thấy lecithinase gây bệnh trên người [21]. Trong một số các trường hợp người ta vẫn phát hiện ra B. subtilis ở những bệnh nhân bị ung thư phổi, hoại thư bạch cầu, áp xe khi lắp bộ phận giả…, nhưng tỉ lệ các trường hợp này là rất hiếm (chỉ có 2 trong 1034 ca phát hiện có B. subtilis) [21]. Bacillus anthracis là một loài của Bacillus gây bệnh than nguy hiểm cho người [61, 21]. 2. Cấu trúc operon lac, gen lacZ và β- galactosidase 2.1. Cấu trúc operon lac Operon lac ở E. coli là operon đầu tiên được phát hiện và nghiên cứu khá chi tiết từ năm 1961 bởi Jacob và Monod [2]. Operon lac gồm ba gen cấu trúc là lacZ, lacY và lacA nằm kề nhau được điều khiển chung bởi một promoter [70]. Hoạt động của operon này được kiểm soát theo hai cơ chế là tích cực và tiêu cực. Gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase. Enzyme này xúc tác phản ứng thủy phân lactose thành glucose và galactose để cung cấp năng lượng cho tế bào. Ngoài ra, β- galactosidase còn chuyển hóa một phần lactose (liên kết β-1,4-D-glycoside của glucose và galactose) thành một đồng phân là allolactose (liên kết β-1,6-D-glycoside của glucose và galactose). Chính allolactose mới là phân tử kích ứng cho sự biểu hiện operon lac [2, 4]. 2.2. Gen lacZ và β-galactosidase Gen lacZ là một trong ba gen cấu trúc nằm trong operon lac của E. coli. Gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase. Trình tự của β-galactosidase ở E.coli được giải mã vào năm 1970 và β-galactosidase có 1024 amino acid, nặng 464 kDa. Cấu trúc bậc 4 đối xứng của nó được xác định vào năm 1994 với mỗi một đơn vị β-galactosidase gồm 5 miền [47]. 3. Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn 3.1. Đặc điểm của plasmid Ở vi khuẩn và một số nấm men, ngoài các gen nằm trong genome còn có các yếu tố di truyền ngoài thể nhiễm sắc, gọi là plasmid. Plasmid là các phân tử DNA mạch đôi dạng vòng, đôi khi có mạch thẳng hay được cấu tạo bởi RNA nằm ngoài DNA nhiễm sắc thể [80] (hình 1.8). Nó thường có trong tế bào vi khuẩn, đôi khi cũng có ở sinh vật nhân thật (eukaryote) (ví dụ, ở Saccharomyces cerevisiae). Kích thước của plasmid khoảng từ 1 đến hơn 400 kbp, có thể chứa vài gen đến vài trăm gen. Plasmid có thể có một bản sao hay tới vài trăm bản sao trong cùng một tế bào. Số lượng bản sao ảnh hưởng tới đặc tính chống chịu của vi khuẩn, đặc biệt là khả năng kháng thuốc, do đó nếu vi khuẩn mang plasmid có nhiều bản sao thì khả năng kháng kháng sinh sẽ càng cao [32, 8]. 3.2. Những vector tách dòng và vector biểu hiện trong E. coli Escherichia coli hay còn được gọi là vi khuẩn đại tràng là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và động vật có vú). E. coli là vi khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý và không hình thành bào tử. Các tế bào thường hình que dài khoảng 2,0 µm và đường kính là 0,5 mm. E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae. Ưu điểm của vi khuẩn E. coli là có tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng biểu hiện protein mạnh nên giảm được chi phí công nghệ và hóa chất. Do đó, E. coli được chọn làm sinh vật mô hình để nghiên cứu trong phòng thí nghiệm trên khắp thế giới [79]. 3.3. Vector biểu hiện trong B. subtilis Hiện nay đã có nhiều loại vector thương mại dành cho E. coli nhưng vector dành cho biểu hiện gen trong B. subtilis thì mới có một công ty sản xuất (công ty Mobitec). Có hai lí do làm giảm khả năng sử dụng của B. subilis: 1. Sản xuất các protease ngoại bào mà nhận biết và phân hủy các protein khác nguồn gốc (heterologous protein) 2. Tính không ổn định của các plasmid. CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu và thiết bị 2.1.1. Tế bào và plasmid 2.1.2. Hóa chất 2.1.3. Môi trường nuôi cấy 2.1.4. Thiết bị thí nghiệm 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 2.2.2. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 2.2.3 Các phương pháp sinh học phân tử 2.2.4. Các phương pháp hóa sinh CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thiết kế vector pUL1(PrrnO-RBS (spoVG)) dựa trên vector pET28b Kết quả là chúng tôi đã thu được một băng duy nhất với kích thước khoảng 244 bp, phù hợp với kích thước dự đoán theo lý thuyết. Kết quả được thể hiện trong hình 3.1 3.2 Nhân dòng gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase trong vector pUL1 Sản phẩm PCR khuếch đại gen lacZ cùng với vector pUL1 được cắt bằng các enzyme giới hạn BamHI và HindIII. Thành phần phản ứng cắt được trình bày trong bảng 3.3. Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt lacZ và pUL1 Thành phần phản ứng Thể tích (μl) Nồng độ cuối cùng Điều kiện Đệm Tango 10x 10 2x Ủ 37 0 C trong 3h. BamHI 1 10 U/µl HindIII 1 10 U/µl DNA (sản phẩm PCR lacZ hoặc vector plasmid pUL1) 17 50-100 ng/µl H 2 O 21 Chúng tôi chạy điện di sản phẩm phản ứng cắt trong 50 phút và 95V. Sản phẩm điện di được tinh sạch bằng kit QIA quick gel extration. Tiếp đó, chúng tôi tiến hành phản ứng nối lacZ vào pUL1 với tỉ lệ thích hợp sao cho tổng thể tích là 12 µl. 3.3 Nhân dòng đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong vector pDG364 tạo pUL2 Đoạn DNA bao gồm promoter PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ được khuếch đại từ vector tái tổ hợp pUL1-lacZ bằng cặp mồi đặc hiệu như được trình bày trong phần nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu. Phản ứng PCR với Taq DNA polymerase có hoạt tính đọc sửa được thực hiện ở nhiều nhiệt độ gắn mồi khác nhau. 3.4 Cài nhập đoạn PrrnO-RBS(spoVG)-lacZ trong vector pDG364 vào genome của B. subtilis PY79 và kiểm tra sự cài nhập này Vector pDG364 có chứa đoạn DNA này sẽ được duỗi thẳng bằng cách sử dụng enzyme giới hạn. Chúng tôi tiến hành tìm kiếm một enzyme giới hạn phổ biến, có vị trí cắt trên vector pDG364 nhưng không có vị trí cắt trong khoảng từ gen amyEf đến amyEb (đoạn này được cài nhập vào genome B. subtilis PY79). PstI có hai vị trí cắt trong vector pDG364 và thỏa mãn điều kiện tìm kiếm, do đó enzyme này được lựa chọn để duỗi thẳng vector tái tổ hợp pUL2. 3.5. Xác định hoạt độ của enzyme β-galactosidase Hoạt tính của gen lacZ trong B. subtilis được kiểm tra theo các phương pháp sau: - Xác định hoạt tính β-galactosidase bằng phương pháp trải trên đĩa có bổ sung X-gal. - Xác định hoạt độ β-galactosidase bằng phương pháp sử dụng cơ chất ONPG. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Thiết kế thành công vector pUL1 mang đoạn promoter PrrnO và vị trí bám ribosome của gen spoVG biểu hiện trong B. subtilis PY79 dựa trên pET28b 2. Nhân dòng thành công gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase trong vector pUL1 3. Nhân dòng thành công đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong vector pDG364 4. Cài nhập và biểu hiện thành công gen mã hóa cho β-galactosidase trong tế bào sinh dưỡng của chủng B. subtilis PY79 mà không cần sử dụng chất cảm ứng. KIẾN NGHỊ 1. Tiến hành tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của β-galactosidase 2. Biểu hiện thêm một số chất có hoạt tính mong muốn trong tế bào sinh dưỡng của B. subtilis PY79 mà không sử dụng chất cảm ứng. References Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn Ngọc Ân, Nguyễn Thị Thu Trang, Nguyễn Thanh Tố Nhi, Hồ Thị Nguyệt Thu, Nguyễn Ngọc Hải, Trần Thu Hoa (2009) , “Tác dụng in vitro kháng virus gây bệnh kháng Gumboro và tả gà của Bacillus subtilis tái tổ hợp biểu hiện interferon anpha của gà”, Tuyển tập Hội nghị CNSH toàn quốc Khu vực phía Nam 2009, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, tr. 376-381. 2. Võ Thị Thương Lan (2006), Một số vấn đề cơ bản của sinh học phân tử, NXB ĐH Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội. 3. Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dung (2008), Công nghệ DNA tái tổ hợp, NXB ĐH Quốc Gia TP HCM, TP HCM. 4. Đinh Đoàn Long và Đỗ Lê Thăng (2008), Cở sở di truyền học phân tử và tế bào, NXB ĐH Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội. 5. Phạm Thị Tuyết Ngân, Vũ Ngọc Út, Trương Quốc Phú và Nguyễn Hữu Hiệp (2011), “Ảnh hưởng của vi khuẩn hữu ích lên các yếu tố môi trường và tôm sú (Penaeus monodon) nuôi trong bể”, Tạp chí Khoa học ĐH Cần Thơ, 20b, tr. 59-68. 6. Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Trần Văn Giang (2008), “Nhân dòng và phân tích trình tự gene mã hoá β-galactosidase từ chủng Bacillus subtilis G1”, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 908, Hà Nội. 7. Trần Linh Thước, Nguyễn Tiến Đạt, Nguyễn Thị Minh Phượng, Võ Minh Trí (2008), “Cấu trúc chủng Bacillus subtilis biểu hiện mini-proinsulin dạng tiết ra môi trường”, Hội nghị khoa học toàn quốc lần IV: Hóa sinh và sinh học phân tử phục vụ, nông , sinh, y học và công nghiệp thực phẩm, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 8. Nguyễn Thị Hồng Vân và Bùi Thị Việt Hà (2011), Di truyền học vi sinh vật nhân sơ và virus, NXB giáo dục Việt Nam, Hà Nội. 9. Nguyễn Thị Hải Yến (2003), Khảo sát đặc tính và khả năng thu nhận enzym - galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis BK16, luận văn thạc sỹ sinh học, ĐH Khoa học Tự Nhiên- ĐHQGHN, Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh 10. Ashlee M. E., Richard L., Roberto K. (2006), “ Bacillus subtilis Genome Diversity”, Journal of bacteriology, 189(3), pp. 1163–1170. 11. Bacillus Subtilis Expression Vectors Product Information and Instructions, Bacillus genetic stock center catalog vol.4 (2005), Mobitec Molecular biotechnology, Germany. 12. Baillie L. (2001), “The development of new vaccines against Bacillus anthracis”, J. ApplMicrobiol., 91, pp: 609–613. 13. Bandow J. E., Brötz H., Hecker M. (2002), "Bacillus subtilis Tolerance of Moderate Concentrations of Rifampin Involves the σ B - Dependent General and Multiple Stress Response”, Journal of Bacteriology, 184(2), pp: 459 - 467. 14. Bui Thu Thuy, Hoang Van Tong, Phan Huong Trang, Phan Tuan Nghia, Huynh Anh Hong, Simon Cutting, Nguyen Thi Van Anh (2011), “Cloning and expression of streptavidin on the outer coat of Bacillus subtilis PY79 spores”, VNU Journal of Science, Natural Science and Technology 27, 2S, pp:285. 15. Burbulys D., Trach K. A., Hoch.J. A. (1991), “Initiation of sporulation in B. subtilis is controlled by a multicomponent phosphorelay”, Cell,64, pp:545-552. 16. Coenen T. M. M., Bertens A. M. C., Hoog S. C. M., Verspeek R. C. M. (2000), “Safety evaluation of a lactase enzyme preparation derived from Kluyveromyces lactis”, Food and Chemical Technology, 2000, pp: 671-677. 17. Drabner B., Guzman C.A. (2001), “ Elicitation of predictable immune responses by using live bacterial vectors”, Biomol Eng., 17(3), pp:75-82. 18. Driks. A. (1999), “Bacillus subtilis spore coat”, Microbiology and Molecular Biology Reviews , 1, p:63. 19. Duc L. H., Cutting S.M. (2003), “Bacterial spores as heat stable vaccine vehicles”, Expert Opin Biol Ther , 3, pp: 1263-1270. 20. Duncan C. H., Wilson G. A., Young F. E. (1978), “Mechanism of integrating foreign DNA during transformation of Bacillus subtilis”, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 75, pp:3664-3668. 21. Edberg S. C. (1997), “Bacillus subtilis Final Risk Assessment”,US EPA human health assessment: Bacillus subtilis, U.S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C., USA. 22. Ehrlich S. D. (1977), “ Replication and expression of plasmids from Staphylococcus aureus in Bacillus subtilis”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74, pp:1680- 1682. 23. Ehrlich S. D. (1978), “DNA cloning in Bacillus subtilis”,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75, pp:1433-1436. 24. Errington J. (2003), “Regulation of endospore formation in Bacillus subtilis”, Nature Reviews Microbiology, 1, pp: 117. 25. Glick R. Bernard, Pasternak J. Jack (2003), Molecular Biotechnology: Principle and Application, Washington, ASM Press, USA. 26. Graumann P. (2007), “Bacillus: Cellular and Molecular Biology”, Caister Academic ISBN 978-1-904455-12-7. 27. Gryczan T. J., Dubnau D. (1978), “Construction and properties of chimeric plasmids in Bacillus subtilis”,Proc. Natl. Acad. Sci., 75, pp:1428-1432. 28. Gupta D. K., Vyas M. (1989), “ Efficacy of Bacillus subtilis against mosquito larvae (Anophelis culicfacies)”, Zeitschrift fuer Angewandte Zoologie, 76(1), pp: 85-91. 29. Haldenwang W. G., Banner C. D. B., Ollington J. F., Losick R., Hoch J. A., O'Connor M. B., Sonenshein A. L. (1980), “Mapping a Cloned Gene Under Sporulation Control by Insertion of a Drug-Resistance Marker into the Bacillus subtilis Chromosome”, J. Bacteriol., 142, pp:90-98. 30. Harwood C. R (1989), Bacillus , page 6-39. 31. Heravi K. M., Marian W., Josef A.(2011), “Regulation of mtl operon promoter of Bacillus subtilis: Requirements of its use in expression vectors”, Microbial Cell Factories, 10 (1), pp: 10- 83. 32. Horwitz J. (1964), “Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-b-D-glycopyranosides”, J.Med. Chem., 7, pp:574-575. 33. Iber D., Clarkson J., Yudkin M. D., Campbell I. D. (2006), “The mechanism of cell differentiation in Bacillus subtilis”, Nature, 441(7091), pp: 371-374. 34. Isticato R., Cangiano G., Tran H. T., Ciabattini A., Medaglini D., Oggioni M. R., De Felice M., Pozzi G., Ricca E. (2001), “Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores”, J. Bacteriol., 183(21), pp: 6294-301. 35. Kees J. L., Kok J., Gerard V. (1989), “Campbell-Like Integration of Heterologous Plasmid DNA into the Chromosome of Lactococcus lactis subsp. lactis”, Applied and environmental Microbiology, 55, pp: 394-400. 36. Keggins K. M., Lovett P. S., Duvall.E. J. (1978), “Molecular cloning of genetically active fragments of Bacillus DNA in Bacillus subtilis and properties of the vector plasmid pUB110”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, pp:1423-1427. 37. Kobayashi K., et al. (2003) "Essential Bacillus subtilis genes". Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 100(8), pp: 4678-4683. [...]... http://en.citizendium.org/wiki /Bacillus_ subtilis 69 http://en.wikipedia.org/wiki /Bacillus_ subtilis 70 http://en.wikipedia.org/wiki/Beta -galactosidase 71 http://en.wikipedia.org/wiki/X-gal 72 http://microbewiki.kenyon.edu/index.php /Bacillus_ subtilis 73 http://sporegen.com/contact.html 74 http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Subtilisin 75 http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/cloning/choice_vector/ecoli/vectorfeatures/... D B (2009), “Phylogeny and molecular taxonomy of the Bacillus subtilis species complex and description of Bacillus subtilis subsp inaquosorum subsp nov.”, Appl Environ Microbiol, 59(10), pp: 2429-2436 57 Samarrai.W., David X L., Ann-Marie W., Barbara S., Jacob E., Anita S., Russell L W., Rivka R (2010), “Differential Responses of Bacillus subtilis rRNA Promoters to Nutritional Stress”,Journal of Bacteriology,... Gram-positive bacterium Bacillus subtilis" Nature., 390, pp: 249-256 40 Lee S., Belitsky B R., Brinker J P., Kerstein K O., Brown D.W., Clements J.D., Keusch G T., Tzipori S., Sonenshein A L., Herrmann J E (2010), “Development of a Bacillus subtilis- based rotavirus vaccine”, Clinical and Vaccine Immunology, 17 (11), pp: 1647-1655 Lepesant-Kejzlaro J., Lepesant J.-A., Walle J., BillaultA (1975), “ Revision of 41... for Bacillus subtilis exhibiting full structural stability”, Plasmid, 54, pp: 241-248 50 Nguyen T H., Splechtna B., Steinbock M., Kneifel W., Lettner P H., Kulbe K D., Haltrich D (2006), “ Puification and characterization of two novel β- galactosidases from Lactobacillus reuteri”, Agricultural and Food chemistry, 54, pp: 4989-4998 51 Nicholson W & Setlow P (1990), Molecular Biological Methods for Bacillus, ... (1958), “ Transformation of biochemically deficient strains of Bacillus subtilis by deoxyribonucleate”, Proc Natl Acad Sci USA,44, pp:1072-1078 63 Stanghellini M E., Rasmussen S.L (1989), “Two new diseases of Salicornia sp caused by Bacillus subtilis and Macrophomina phaseolina”, Annual Meeting of the American Phytopathological Society, Pacific Division, 79(8), p: 912 64 Weber, M.H.W., Marahiel, M.A (1979),... in Bacillus subtilis" , Journal of Bacteriology, 182(4), pp: 1096-1108 55 Phan T T P., Nguyen H D., Schumann W (2005), “Novel plasmid-based expression vectors for intra- and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis , Protein Expr Purif., 46(2), pp: 189-95 56 Rooney A P., Neil P J P., Ehrhardt C., James L S., Jason D B (2009), “Phylogeny and molecular taxonomy of the Bacillus. .. fusion partner”, Vaccine, 22(9-10), pp: 1177-1187 46 Morikawa M (2006), "Beneficial Biofilm Formation by Industrial Bacteria Bacillus subtilis and Related Species", Journal of Bioscience and Bioengineering, 10(1), pp: 1-8 47 Nagy Z., Kiss T., Szentirmai A., Bio S (2001), β- Galactosidase of Penicillium chrysogenum: Production, puification and characterization of the enzyme”, Protein expression and... Cloning A Laboratory Manual” Second edition Cold Spring Harbor Laboratory Press pp:1-74 59 Sangun L., Boris R B., James P B., Kathryn O K., David W B., John D C , Gerald T K., Saul T., Abraham L S., John E H (2010), “Development of a Bacillus subtilis- Based Rotavirus Vaccine”, Clin Vaccine Immunol.,17 ( 11), pp: 1647-1655 60 Schaechter M., Ingraham J L., Neidhardt F C (2006) Microbe., American Society... J.-A., Walle J., BillaultA (1975), “ Revision of 41 the linkage map of Bacillus subtilis 168: Indications for circularity of the chromosome”, J Bacteriol., 121, pp: 823-834 42 43 Losick R., and Pero J (1981), “Cascades of sigma factors”, Cell,25, pp:582-584 Mahler I., Halvorson H O (1977), “Transformation of Escherichia coli and Bacillus subtilis with a hybrid plasmid molecule”, J Bacteriol.,131, pp:374-377... Division, 79(8), p: 912 64 Weber, M.H.W., Marahiel, M.A (1979), “Bacterial cold shock responses”, Science Progress, 86 (2003), pp:9–75 Bacillus subtilis Marburg, Mol Gen Genet., 170, pp:117–122 65 Yang M M., Zhang W W., Chen Y L và Gong Y S (2010) “Development of a Bacillus subtilis expression system using the improved Pglv promoter”, Microbial Cell Factories, 9:55 doi:10.1186/1475-2859-9-55 Các trang web . lý luận về vi khuẩn B: Sơ lược về vi khuẩn B. subtilis, cấu trúc operon lac, gen lacZ và β- galactosidase, Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn, cài nhập. bố về vi c biểu hiện gen trong tế bào sinh dưỡng của B. subtilis mà không cần sử dụng chất cảm ứng. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài: Biểu hiện β- galactosidase