1 Chương Các vector sử dụng công nghệ chuyển gen động vật thực vật I Vector Trong sinh học, vector phân tử DNA có khả mang đoạn DNA ngoại lai xâm nhập vào loại tế bào chủ thích hợp có khả tự tái khơng phụ thuộc vào chép hệ gen tế bào chủ Nói cách khác, vector phương tiện truyền thông tin di truyền thể thể khác Tế bào chủ thường sử dụng vi khuẩn E.coli Phần lớn vector phân tử DNA dạng vòng nhỏ (plasmid) bacteriophage Vector cắt vị trí xác định enzym hạn chế nối với đoạn DNA tương hợp khác cắt enzym Trong tạo dòng phân tử, vector cần thiết thực tế cho thấy đoạn DNA chứa gen khơng thể làm tế bào chủ Vì khơng phải phận genome bình thường tế bào, khơng tái tế bào phân chia, không biểu có khả bị phân huỷ nhanh Trong kỹ thuật di truyền, vector công cụ có khả nghiên cứu genome người genome loài khác sử dụng chúng nghiên cứu trở nên ngày phổ biến cách rộng rãi II Các đặc tính vector - Vector phải đủ lớn để mang DNA ngoại lai không lớn - Vector phải chứa trình tự kiểm sốt (control sequences) khởi điểm tái (origin of replication), promoter - Vector phải mang nhiều vị trí nhận biết enzym hạn chế - Vector phải mang gen marker chọn lọc (thường gen kháng chất kháng sinh) Vì tế bào chứa chúng phát cách dễ dàng III Các bước tạo dòng phân tử - Nối vector đoạn DNA ngoại lai cần tạo dòng ống nghiệm để tạo DNA tái tổ hợp nhờ xúc tác enzym ligase - Biến nạp DNA tái tổ hợp vào dòng tế bào chủ Chọn lọc thể biến nạp môi trường agar đĩa petri có chất kháng sinh - Tách dịng DNA tái tổ hợp cách sử dụng mẫu dò (probe) IV Các vector sử dụng để chuyển gen động vật thực vật Các vector sử dụng để chuyển gen động vật 1.1 Vector sử dụng để thêm gen Phần lớn vector sử dụng để tạo động vật chuyển gen cách thêm gen xây dựng để hợp vào genome Các phương pháp sử dụng nghiên cứu để tăng tần số hợp gen ngoại lai trì chúng nhiễm sắc thể nhỏ độc lập 1.1.1 Vector thẳng tối thiểu (Minimum linear vectors) Ở đại đa số trường hợp, nhà nghiên cứu sử dụng đoạn genome chứa hai gen hay chuẩn bị cấu trúc gen hoạt động chức từ yếu tố khác Các đoạn vector chứa vùng phiên mã điều hòa từ plasmid Thực vậy, vector vòng hợp với tần số thấp nhiều so với đoạn DNA thẳng trình tự plasmid thường phá hủy gen chuyển liên kết Ðiều vector khác plasmid, cosmid, phage, BAC YAC Tuy nhiên số nghiên cứu cho thấy vector BAC vòng hợp vào genome với hiệu giống mạch thẳng chúng Nói cách khác, vector mang đoạn Hình 1.1: : Tạo dịng vector plasmid DNA genome dài nhạy với hiệu câm trình tự prokaryote Ðiều thích hợp nhờ diện yếu tố cách ly đoạn genome dài nhờ hiệu khoảng cách đơn giản Các đoạn DNA khơng chứa trình tự đặc biệt hợp vào genome với tần số tương đối thấp Một số DNA xen vào tạo số động vật chuyển gen nhiều so với DNA khác Ðiều xuất từ có mặt trình tự đoạn xen mà nhận biết thường xuyên trình tự genome (Hình 1) Một số đoạn xen vào chứa trình tự ưu tiên cho phiên mã chúng trì chúng phôi, tăng cường hợp xảy 1.1.2 Vector chứa trình tự lặp lại Cơ chế hợp mơ tả hình bao hàm nhận biết trình tự đoạn xen genome Tần số hợp tăng lên nhờ có mặt hai đầu đoạn xen trình tự lặp lại cao genome chủ chúng bị thối hóa nhiều Ở bị, trình tự có mặt nhiều tâm động làm tăng thêm đoạn xen tăng tần số hợp Ở trường hợp đặc biệt này, gen chuyển không hoạt động Ðiều tâm động vùng không phiên mã genome phá hủy gen chuyển Một phương pháp tương tự tiến hành chuột, sử dụng trình tự Alu Các trình tự yếu tố lặp lại Các trình tự Alu chứa 200-300 nucleotid có nhiều genome động vật có vú đặc biệt vùng lân cận vùng phiên mã Một số trình tự Alu phiên mã RNA polymerase III, làm cho chức RNA không rõ ràng khơng tồn Các thí nghiệm cho thấy tần số hợp tăng lên đoạn xen chứa trình tự Alu 1.1.3 Vector transposon Transposonlà đoạn DNA có khả tự tái cách độc lập xen vào vị trí nhiễm sắc thể nhiễm sắc thể khác (Hình 1.2) Với tiến kỹ thuật di truyền transposonđã sửa đổi, thiết kế thành cơng cụ di truyền với mục đích đặc biệt Hình 1.2: Cấu trúc transposon Kích thước transposon nói chung khơng dài 2kb Nhiều transposon có mặt genome vị trí ngẫu nhiên cách rõ ràng Transposon phiên mã thành RNA, RNA phiên mã ngược thành DNA sợi kép DNA sợi kép hợp vào genome với hiệu cao Sự hợp điều khiển gen transposase mã hóa transposon trình tự lặp lại đảo ngược ITR (inverted repeated sequence) Các trình tự lặp lại đảo ngược có mặt hai đầu transposon (Hình 1.3) Cơ chế cho phép transposon trải rộng cách nhanh chóng tỏa khắp genome, bao gồm bất hoạt gen số trường hợp Sự lan tỏa transposon bị giới hạn chế tế bào làm bất hoạt phiên mã transposon Transposon vector có tiềm hợp gen ngoại lai vào genome Ðể làm điều này, phần lớn vùng phiên mã transposon bị đi, tạo khoảng trống gen ngoại lai ngăn cản transposon trải rộng cách tự chủ không kiểm soát genome DNA tái tổ hợp chứa gen ngoại lai khơng có khả đặc biệt để tự hợp vào genome Sự có mặt gen transposase cần thiết mục đích Tiêm đồng thời transposon mang gen ngoại lai plasmid vịng có khả biểu gen transposase cho phép transposon hợp với hiệu có ý nghĩa, khoảng 1-5 % số phơi tiêm (Hình 1.3) Protocol áp dụng trước tiên cho Drosophila, sử dụng transposon P sau sử dụng rộng rãi để tạo sinh vật chuyển gen (Kayser, 1997) Transposon thủy thủ (mariner) tỏ có hiệu tế bào cá medaka, gà động vật có vú Các sửa đổi khác transposon làm cho mang vector hiệu an toàn liệu pháp gen (Hackett, 2001) Các vector khác sử dụng để tạo côn trùng chuyển gen Aedes aegypti tằm (Tamura, 1999) Gần transposon sử dụng để tạo chuột chuyển gen (Dupuy, 2002) Hình 1.3: Sử dụng vector transposon để chuyển DNA ngoại lai Gen transposase thay gen mong muốn Transposon tái tổ hợp tiêm vào tế bào Vector điều khiển tổng hợp enzyme gắn (intergrase) tiêm vào Transposon hợp cách sử dụng trình tự lặp lại đảo ngược ITR chúng Trong tất trường hợp, transposon plasmid mã hóa cho transposase phải tiêm vào tế bào chất phôi điều kiện khác tùy thuộc loài Về phương diện này, gà khác với hầu hết lồi khác Việc tiêm gen thực giai đoạn phôi tế bào mà đưa trở lại vào mẹ nuôi dưỡng trường hợp thú Phôi tiêm gen phải đưa vào nỗn hồng trứng khơng mang phôi Sau vài tuần ấp trứng điều kiện kiểm soát tốt, gà chuyển gen sinh với tỉ lệ thành cơng chấp nhận (Shermann, 1998) Vì vậy, vector transposon cho phép tạo động vật chuyển gen lồi mà vi tiêm DNA thơng thường khơng thành cơng Vector xem an tồn Vector transposon thủy thủ thiếu gen transsposae tái hợp vào genome chủ với tần số thấp Ðiều có mặt transposase nội sinh tế bào chủ Vấn đề giới hạn sử dụng transposon số trường hợp Trong đó, transposon BAC lợn sử dụng để tạo tằm chuyển gen ổn định hoàn toàn sau số hệ Transposon mang đoạn DNA ngoại lai với chiều dài giới hạn Các cấu trúc phức tạp sử dụng để biểu gen ngoại lai rõ ràng hạn chế Ngoài chế tế bào phá hủy transposon ức chế biểu gen chuyển số trường hợp 1.1.4 Vector retrovirus a Cấu trúc retrovirus Retrovirus loại virus RNA, có vỏ bọc bên Sau xâm nhiễm, genome virus chép ngược thành DNA sợi kép, hợp vào genome tế bào chủ biểu thành protein Retrovirus đặc trưng chu kỳ tái chúng, mô tả lần vào đầu thập niên 1900 (Ellermann Bang.O, 1908) Hạt retrovirus có kích thước, hình dạng thay đổi đơi chút đường kính khoảng 100nm Vỏ virus glycoprotein, tạo thành gai màng (Hình 1.4A) Protein trưởng thành chia làm hai loại polypeptid (Hình 1.4B): - Glycoprotein vỏ bên ngồi (SU), kháng ngun chủ yếu virus, có chức bám vào thụ quan - Glycoprotein màng (TM), bám vào protein SU vỏ, chịu trách nhiệm dung hợp màng A B Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc cắt ngang retrovirus A Cấu trúc cắt ngang B Cấu trúc protein vỏ Bên màng protein (MA), khơng định hình Protein bao lấy capsid (CA) CA protein phong phú hạt virus (chiếm khoảng 33 % trọng lượng tổng số), có hình khối 20 mặt Bên capsid lõi, thường có hình nón, bao gồm: RNA genome, protein nucleocapsid (NC), enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase = RT) enzyme hợp (intergrase = IN) Genome retrovirus bao gồm hai phân tử RNA sợi đơn, mạch thẳng, có cap đầu 5’ poly A đầu 3’ (tương đương với mRNA) Genome retrovirus có kích thước khoảng 811kb Retrovirus chia làm hai loại retrovirus đơn giản retrovirus phức tạp RNA retrovirus đơn giản chứa nhóm gen chủ yếu: - Gen gas mã hóa protein lõi, capsid nucleoprotein - Gen pol mã hóa enzyme phiên mã ngược enzyme hợp - Gen env mã hóa protein cấu trúc vỏ virus Trật tự nhóm gen tất retrovirus khơng thay đổi: 5’ – gag – pol – env – 3’ Ngồi cịn có nhóm gen pro mã hóa enzyme protease viruss Các retrovirus đơn giản bao gồm hầu hết virus gây ung thư viruss bạch cầu chuột Moloney Mo-MLV (Moloney, 1960), virus ung thư tuyến vú chuột (mouse mammary tumor virus = MMTV) (Bittner, 1936 ) Các retrovirus phức tạp, ngồi ba nhóm gen chủ yếu gag, pol env cịn có gen khác tat, rev HIV-1 Nhóm virus bao gồm lentivirus kể virus HIV-1, spumavirus, HFV (human foamy virus) SFV (simian foamy virus) Ở đầu genome đoạn lặp dài tận (LTR) chứa tất tín hiệu cần thiết cho biểu gen virus Một đoạn LTR gồm có vùng: U3, R U5 Vùng U3 bao gồm yếu tố kiểm soát phiên mã, promoter gen tăng cường (enhancer) Ðây vùng khơng mã hóa có kích thước 75-250 nucleotid, phần genome phiên mã ngược, tạo đầu 3’ genome provirus Vùng R thường trình tự có kích thước ngắn khoảng 18-250 nucleotid tạo thành đoạn lặp trực tiếp hai đầu genome Vùng U5 vùng khơng mã hóa có kích thước 2001.200 nucleotid tạo nên đầu 5’ provirus sau phiên mã ngược vùng U5 mang vị trí poly A với vùng R xác định gắn thêm đuôi poly A vào Cả hai vùng U3 U5 mang vị trí gắn att cần thiết cho hợp genome virus vào genome chủ Mặt khác, genome virus có đoạn dẫn đầu (leader), vị trí bám primer (primer binding site = PBS) vùng polypurine (polypurine tract = PPT) Ðoạn dẫn đầu không dịch mã, dài, có kích thước khoảng 90-500 nucleotid, xi theo vị trí khởi đầu phiên mã, nằm vùng U3 R, phía đầu 5’ tất virus mRNA PBT dài 18 nucleotid bổ sung với đầu 3’ primer tRNA đặc hiệu virus sử dụng để bắt đầu phiên mã ngược PTT ngắn khoảng 10 A G có chức khởi đầu tổng hợp sợi (+) trình phiên mã ngược Hình 1.5 : Sơ đồ cấu trúc genome retrovirus 10 Ngoài cịn có trình tự cần thiết cho đóng gói genome virus gọi trình tự Ψ (psi) vị trí cắt RNA gen env Một số retrovirus chứa protooncogene Khi protooncogene bị đột biến gây ung thư b Vector retrovirus Vector retrovirus cấu trúc DNA nhân tạo có nguồn gốc từ retrovirus, sử dụng để xen DNA ngoại lai vào nhiễm sắc thể vật chủ Yếu tố chìa khóa việc sử dụng retrovirus làm thể truyền phân phối gen an tồn sinh học (biosafety) Mục đích thiết kế vector bảo đảm tạo virus không khả tái (replication incompetent virus) tế bào chủ (Hình 1.6 ) Hình 1.6: Virus nguyên vẹn có khả tái vector retrovirus khơng có khả tái Về ngun tắc, tạo vector retrovirus có khả tái (replication competent retroviral vector) cách thêm trình tự cần thiết vào virus (Hình 1.6) Nhưng thiết kế phổ biến thay gen virus gen chuyển mong muốn để tạo vector tái khơng hồn tồn (replication defective 33 mã hóa enzyme liên quan đến hệ thống cytokinin đột biến dẫn đến tăng sinh rễ từ khối u hình chóp gây số loài (các thể đột biến rễ) Các locus tms tms liên quan đến tổng hợp khơng điều hịa auxin đột biến hai locus gây nên tăng sinh chồi từ khối u hình chóp nhiều loại thực vật (các thể đột biến chồi) Vì vậy, T-DNA mang gen (tms 1, tms tmr) mà sản phẩm chúng khơng chịu điều hịa bình thường đường chuyển hóa thực vật liên quan đến tổng hợp phytohormone điều gây kiểu hình ung thư Do gen tms 1, tms tmr xem gen ung thư Tuy nhiên cần lưu ý gen mã hóa T-DNA khơng địi hỏi phải chuyển T-DNA vào tế bào thực vật khơng trì ổn định genome thực vật 2.1.3 Ri-plasmid Agrobacterium rhizogenes Sự khởi đầu bệnh lông tơ A.rhizogenes tương tự biến nạp nhờ A.tumefaciens Dưới kiểm soát vùng gây độc, hai vùng phân tán Ri-plasmid chuyển vào genome thực vật (Huffman, 1984; De Paolis, 1985) Các vùng có tên TL (T-left T-DNA) TR (T-right T-DNA) TR T-DNA chứa gen sản xuất opine (mannopine agropine) dòng định rõ đặc điểm nhờ gen opine đặc trưng chúng (De Paolis, 1985) Mặt khác TR T-DNA cịn chứa hai gen mã hóa cho tổng hợp auxin Các gen tương đồng cao với gen auxin A.tumefaciens cho thấy bổ sung thêm dịng mang gen auxin đột biến chúng (Offringa, 1986) TL T-DNA không tương đồng với T-DNA A.tumefaciens (Huffman, 1984) Toàn TL T-DNA giải trình tự chứa tối thiểu 11 khung đọc mở, tương tự với khung đọc mở tìm thấy genome eukaryote Chúng có promoter yếu tố polyadenine hóa cần thiết để thực chức chuyển vào genome thực vật (Simpson, 1986) Các gen khơng tương đồng với gen 34 Hình 1.21: Cấu trúc biểu Ti-plasmid kiểu octopine nopaline A Bản đồ Ti-plasmid kiểu octopine (pTiAch5) kiểu nopaline (pTiC58) cho thấy vị trí tương đối kích thước vùng chức Các vị trí tơ đậm chí vùng tương đồng lớn plasmid //: Các đoạn lặp trực tiếp 25 bp; CON: vùng mã hóa chức tiếp hợp ORI: vùng mã hóa chức tái khởi điểm tái B Bản đồ vùng T kiểu nopaline octopine cho thấy vùng chức chính, vùng tương đồng sản phẩm phiên mã Các sản phẩm phiên mã biết là: 3(nos): nopaline synthase; (ocs): octonopaline synthase; acs: agrocinopine synthase; 1(tms 1): tryptophan mono-oxygenase; 2(tms 2): indole-3-acetamide hydrolase; 4(tmr): DMA transferase; agr: sản phẩm phiên mã cần cho tổng hợp agropine 35 biết khơng có tương đồng có ý nghĩa TDNA (kiểu octopine) A.tumefacien TR T-DNA không cần thiết trì kiểu hình lơng tơ Tuy nhiên nhiều lồi, dịng Agrobacterium có TL TR T-DNA độc nhiều so với dòng mang T-DNA (Vilaine Case-Delbart, 1987) 2.2 Cơ chế chuyển T-DNA Các vùng T-DNA A.tumefaciens A.rhizogenes nằm bên cạnh đoạn lặp trực tiếp 25 bp (Hình 1.11) điểm kết thúc T-DNA hợp genome thực vật nằm sát với trình tự Trình tự liên ứng biên T-DNA GGCAGGATATTC/GA/G GT/GTCTAAA/TT/C Hầu hết nghiên cứu chế chuyển T-DNA từ Agrobacterium vào tế bào thực vật tiến hành A.tumefaciens Việc loại bỏ bờ phải Ti-plasmid kiểu nopaline làm hình thành khối u, đoạn oligonucleotid tương đồng với bờ phải tạo dòng với định hướng xác với Ti-plasmid thiếu bờ phải hình thành khối u lại phục hồi (Wang, 1984), cho thấy trình tự lặp 25 bp phân cực tác động (cis-acting) Sự tiếp xúc Agrobacterium với hợp chất giải phóng từ mơ thực vật bị tổn thương làm cho vùng vir Ti-plasmid phiên mã (Hình 1.22) Trong trình chất có hoạt tính hóa học cao đặc trưng nhận biết acetosyringone Gen vir A gen vir C biểu vi khuẩn sinh trưởng sinh dưỡng gen vir C phiên mã mức độ thấp Khi Agrobacterium gặp dịch rỉ tế bào thực vật bị tổn thương, acetosyringone tinh khiết, sản phẩm gen vir A (có thể liên kết với màng) nhận diện tương tác với acetosyringone truyền tín hiệu ngoại bào vào tế bào làm hoạt hóa sản phẩm gen vir C Sau protein vir C biến đổi hoạt hóa làm cho gen vir B, C, D E không hoạt động làm tăng cường phiên mã gen vir C Sự cảm ứng gen vir xảy nhờ xuất điểm đứt sợi đơn trình tự biên 25 bp nằm mép T-DNA (Stachel Zambryski, 1986; Albright, 1987) xuất phân tử sợi đơn mạch thẳng tương ứng với T-DNA (Hình 1.22) Các sản phẩm operon vir D có hoạt tính endonuclease (Yanofsky, 1986) Bằng 36 chế tương tự tiếp hợp vi khuẩn, T-DNA chuyển sang tế bào thực vật xen cách ổn định vào DNA nhân (Stachel Zambryski, 1986) Sự kiện liên quan đến protein mã hóa operon vir E (Winans, 1987) Mơ hình mơ tả kiện xảy mức phân tử tương tác tế bào thực vật Agrobacterium để hình thành khối u hình chóp trình bày hình 1.22 2.3 Plasmid Agrobacterium vector biến nạp Khả chuyến cách tự nhiên trình tự DNA xác định vào genome thực vật Agrobacterium sử dụng vào việc phát triển vector biến nạp thực vật Các vector lợi dụng số đặc tính bẩm sinh Agrobacterium trình biến nạp trung gian (mediated transformation process) Vào đầu thập niên 1980, số nhóm nghiên cứu Ti-plasmid loại bỏ tất gen onc T-DNA Khám phá quan trọng thứ gen onc không cần thiết việc chuyển T-DNA vào tế bào thực vật khơng hợp vào DNA nhân Vì gen thay Nó khơng cho phép xen DNA ngoại lai vào mà cho phép loại bỏ chức gen onc Tuy nhiên cần lưu ý rằng, nos ocs gen marker hữu ích biến nạp hoạt tính enzyme sản phẩm gen chúng phát xét nghiệm đơn giản Cho đến nay, giới hạn kích thước đoạn DNA xen vào chưa công bố Sự kiện quan trọng thứ ba khám phá sản phẩm gen vir hoạt động chức trans Cuối cùng, T-DNA khơng gây ung thư có mặt toàn thực vật tái sinh truyền lại cho hệ sau theo kiểu di truyền Mendel 2.4 Các thành phần vector Ti-plasmid không gây ung thư Ðặc điểm chuyển gen qua trung gian Agrobacterium DNA tạo dịng chuyển vào genome tế bào thực vật hai mầm DNA ngoại lai phải nằm mép trình tự biên T-DNA trì ổn định dịng Agrobacterium mang nhóm bổ sung đầy đủ gen vir dạng cis trans (định vị plasmid hỗ trợ gây độc phân tán) Các gen nhiễm sắc thể Agrobacterium kết hợp với vùng gây độc 37 mơ tả có liên quan với việc vi khuẩn nhận thành phần bề mặt tế bào thực vật, gắn vào sau Hình 1.12: Sự tương tác Agrobacterium với tế bào thực vật chế chuyển T-DNA 38 Ðể nhận tế bào biến nạp, gen trội kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn xen vào trình tự lặp 25 bp kiểm soát T-DNA promoter tín hiệu polyadenyl hóa Các gen kháng thuốc kháng sinh dạng khảm biểu cách có hiệu tế bào thực vật môi trường di truyền Việc liên kết cách chặt chẽ gen marker với DNA ngoại lai có lợi ích: thứ để chọn lọc trực tiếp mô thực vật biến nạp DNA ngoại lai vào cách chắn; thứ hai đảm bảo DNA ngoại lai dòng biến nạp đặc trưng chọn lọc không xen vào vùng genome không phiên mã 2.5 Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa Tiplasmid Cả A.tumefaciens A.rhizogenes sử dụng để chuyển DNA ngoại lai vào tế bào thực vật Nhiều vector biến nạp dựa Ti-plasmid phát triển (Bảng 1.1 bảng 1.2) Các vector khơng chứa trình tự ung thư tế bào thực vật sinh trưởng bình thường sau chuyển DNA vào nhân Các vector khơng gây ung thư sử dụng chia làm hai loại cis trans, dựa vào việc có hay khơng vùng T-DNA nằm mép trình tự lặp trực tiếp 25 bp đơn vị tái (replicon) gen vir plasmid phân tán (Hình 1.13) Trước đây, loại vector thường đề cập đến vector liên hợp (co-intergrative vector), nhiên gần vector nhị thể (binary vector) phổ biến 2.5.1 Cis vector Ðây vector có nguồn gốc từ Ti-plasmid kiểu dại mà gen onc T-DNA loại bỏ số trường hợp thay đoạn DNA đặc hiệu có vùng tương đồng với vector tạo dịng nhỏ mà tái E.coli Chiến lược vector phụ thuộc vào liên hợp A.tumefaciens vùng tương đồng Ti-plasmid sửa đổi (hỗ trợ mang gen vir) vector tạo dòng nhỏ E.coli (vector trung gian) mang gen marker 39 40 41 chọn lọc hoạt động chức tế bào thực vật trình tự cho việc xen DNA ngoại lai vào Vector trung gian mang trình tự DNA ngoại lai thường đưa vào A.tumefaciens tiếp hợp sử dụng chọn lọc thích hợp thu thể nhận tiếp hợp với DNA ngoại lai ổn định T-DNA kết tái tổ hợp tương đồng (Hình 1.23A ) Hình 1.23: Sơ đồ hệ thống vector liên hợp (A) vector nhị thể (B) VIR: vùng gây độc; HOM: vùng tương đồng tái xảy liên hợp; LB: biên trái; RB: biên phải; MCS (multicloning site): trình tự tạo dịng; PTM: marker biến nạp thực vật; RES: marker kháng thuốc kháng sinh để chọn lọc có mặt trình tự vector vi khuẩn chủ; oriT: khởi điểm chuyển; ColE1: khởi điểm tái từ plasmid ColE1; RK2: vùng có phổ khởi điểm tái rộng, có nguồn gốc từ pKR2 42 Ở số vector pGV3850 (Hình 1.24), hai biên T-DNA Ti-plasmid sửa đổi Trong vector pGV2260 (Debleare, 1982), trình tự lặp 25 bp vector trung gian, vector pTiBS3-SE (Fraley, 1985), biên phải vector trung gian biên trái gen vir plasmid Bất kỳ đâu vị trí khởi đầu trình tự lặp 25 bp, kết thực sau liên hợp xen trình tự DNA ngoại lai biên T-DNA lặp lại Ti-plasmid sửa đổi Vì dòng A.tumefaciens mang cấu trúc này, T-DNA chuyển vào genome thực vật suốt biến nạp kết hoạt động vùng vir dạng cis Hình 1.24 : Cấu trúc sử dụng vector liên hợp pGV3850 Bản đồ cho thấy cấu trúc vector biến nạp thực vật pGV3850 vector trung gian pGV1103 kết việc hợp pGV1103 vào pGV3850 LB: biên trái; RB: biên phải; Pnos: promoter nopaline synthetase; npt-II: trình tự mã hóa neomycin phosphotransferase-II từ Tn5; ocA: trình tự polyadenyl hóa octopine synthase; E: EcoRI; H: HindIII; B: BamHI; nos: nopaline synthase; ApR: gen kháng ampicillin; KmR: gen kháng kanamycin 43 Một ví dụ chi tiết vector cis pGV3850 (Zambryski, 1983) Vector loại bỏ gen onc Ti-plasmid kiểu nopaline (C58) thay pBR322 (Hình 1.25) Bất kỳ trình tự DNA ngoại lai tạo dòng pBR322 đưa vào pGV3850 q trình chuyển vào Agrobacterium theo cách tiếp hợp tái tổ hợp bao gồm hai bước Trước hết pBR322 mang gen cần chuyển marker kháng thuốc kháng sinh cho phép chọn lọc Agrobacterium (kanamycin streptomicin/spectinomycin) đưa vào dòng Ecoli chứa hai plasmid hỗ trợ pGJ28 pRGdrd11 Các plasmid cung cấp ColE1 có chức hỗ trợ, cho phép chuyển plasmid vào Agrobacterium qua tiếp hợp Tuy nhiên pBR322 tái Agrobacterium khơng bảo tồn, tái tổ hợp xảy pBR322 pGV3850 làm cho gen quan tâm chuyển vào Tiplasmid Thể nhận tiếp hợp chọn lọc nhờ tính kháng plasmid mã hóa tính kháng rifampicin nhiễm sắc thể Agrobacterium mã hóa 2.5.2 Vector nhị thể Vector trans vector nhị thể dựa plasmid tái E.coli Agrobacterium plasmid có chứa trình tự biên T-DNA (Hình 1.23B) Các vector thiết kế cho trình tự biên cạnh MCS cho phép xen DNA ngoại lai vào marker cho phép chọn lọc trực tiếp tế bào thực vật biến nạp Plasmid thao tác E.coli chuyển vào qua tiếp hợp với dòng Agrobacterium mang plasmid có chứa vùng vir thiếu T-DNA trình tự lặp 25 bp Các plasmid thường thể đột biến đoạn đơn giản Ti-plasmid octopine kiểu dại kiểu nopaline (Bảng 1.2) Việc chuyển DNA ngoại lai vector tạo dòng vào tế bào thực vật thực hoạt động chức vùng vir pBin19 vector nhị thể phổ biến dựa đơn vị tái (replicon) vật chủ mở rộng pRK252 (Hình 1.25A) Vì tái E.coli Agrobacterium, cho phép xen DNA ngoại lai vào vector sàng lọc E.coli trước chuyển vào Agrobacterium Vector chứa marker kháng kanamicin (Kmr) 44 Hình 1.25 : Cấu trúc sử dụng vector nhị thể pBin19 A Bản đồ vector nhị thể pBin19 LB: biên trái; RB: biên phải; lac: vùng bổ sung α operon lac; Pnos: promoter gen nopaline synthetase; npt-II: trình tự mã hóa neomycin phosphotransferase-II từ Tn5; nosA: trình tự polyadenyl hóa gen nopaline synthase B Sự xâm nhập pBin19 vào A.tumefaciens LBA4404 sử dụng plasmid hỗ trợ pRK2013 sau loại bỏ plasmid hỗ trợ Agrobacterium giúp chọn lọc trực tiếp vi khuẩn trình tự biên T-DNA cạnh marker chọn lọc trội với mục đích sử dụng 45 tế bào thực vật (một gen kháng kanamicin nằm cạnh promoter nos trình tự poly(A) thêm vào) MCS vùng bổ sung α β-galactosidase Sự sàng lọc thể tái tổ hợp tiến hành Lac- E.coli nhờ bổ trợ α với có mặt IPTG XGAL (Groneborn Messing, 1978) Vector đưa vào Agrobacterium tiếp hợp sử dụng chức hỗ trợ pKR2013 Agrobacterium chủ LBA4404 chứa Ti-plasmid (pLBA4404) loại bỏ T-DNA vùng vir không đổi Thể nhận tiếp hợp chọn lọc nhờ tính kháng kanamicin rifampicin Ví dụ hệ thống vector nhị thể trình bày bảng 1.2 Các vector nhị thể khác kích thước, tái ổn định Agrobacterium, vị trí tạo dịng, bổ trợ α để sàng lọc plasmid tái tổ hợp đĩa X-GAL, gen marker để chọn lọc thực vật biến nạp gen marker để chọn lọc thể nhận tiếp hợp, phần lớn biết thích hợp với số plasmid hỗ trợ mang gen vir A.tumefacien với nhiều Riplasmid 2.6 Vector biến nạp thực vật sử dụng A.rhizogenes Các vector sử dụng lần biến nạp vào loại thực vật mà tái sinh toàn thể từ tế bào đơn lẻ khó khăn Ở số lồi, tái sinh thể xảy từ nuôi cấy rễ gây A.rhizogenes thông qua phát triển phôi soma phát sinh quan Cơ chế kiểu hình lơng rễ bị ức chế làm phát sinh hình thái chồi chưa rõ Thực vật tái sinh từ lông rễ thường bị biến đổi hình thái: bị gấp nếp, hệ thống rễ ăn nghiêng, sinh trưởng cằn cỗi khả sinh sản 2.6.1.Vector liên hợp Ðây vector trung gian thiết kế cho phép thao tác E.coli chứa vùng T-DNA Ri-plasmid Sự dẫn nhập vector vào A.rhizogenes mang Ri-plasmid bình thường làm ổn định trình tự vector trung gian kết tái tổ hợp tương đồng nội phân tử Ri-plasmid (Jensen, 1986) 46 2.6.2.Vector nhị thể Vector nhị thể loại bỏ hết khả gây hại có nguồn gốc từ A.tumefaciens (Bevan, 1984; Van den Elzen, 1985) đưa vào A.rhizogenes tái ổn định miễn chọn lọc trì Sau nhiễm A.rhizogenes mang vector nhị thể với thực vật làm chuyển T-DNA từ vector nhị thể với T-DNA A.rhizogenes vào genome thực vật (Shalin, 1986; Simpson, 1986) Các gen chuyển vào genome thực vật định vị trình tự biên vector nhị thể Các trình tự biên vector nhị thể có tác dụng sau cảm ứng vùng vir Ri-plasmid kiểu dại chỗ (Simpson, 1986; Trulson, 1986) Ðiều xảy độ tương đồng lớn, mức DNA, vùng gây độc (virulence region) A.tumefacien A.rhizogenes (Huffman, 1984) Gần lông tơ (hairy root) cà chua dưa chuột tạo A.rizhogenes kiểu dại mang vector nhị thể với marker chọn lọc Kmr Thể tái sinh từ môi trường nuôi cấy lông rễ kháng kanamicin sàng lọc thực vật kiểu hình bình thường số phục hồi mà thiếu T-DNA A.rizhogenes có mặt T-DNA vector nhị thể (Shalin, 1986; Trulson, 1986) chuyển độc lập T-DNA tách rời Ðặc tính A.rhizogenes làm cho trở nên hấp dẫn vector biến nạp q trình mở rộng nhiều loại trồng khác Tài liệu tham khảo Makrides SC 2003 Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells Elsevier Science B V USA Louis-Marie H 2003 Animal Transgenesis and Cloning John Wiley and Sons, Ltd USA Leland HH, Leroy H, Michael LG, Ann ER, Lee MS, Ruth CV 2000 Genetics, The McGraw-Hill Companies, Inc USA Winter PC, Hickey GI, Fletcher HL 1998 Instant Notes Genentics Printed by Biddles Ltd, Guildford UK 47 Glick BR, Jackj P 1994 Molecular Biotechnology ASM Press Washington D.C USA Chopra VL, Anwan N 1990 Genetic Engineering and Biotechnology Oxford and IBH Publishing CO.PVT, Ltd UK John D, Roderick S, Philip A, Richard W 1988 Plant Genetics Transformation and Gene Expression (A Laboratory Manual) Blackwell Scientific Publications UK ... trung ương, cơ, tế bào mô máu tế bào ung thư (Jaffe, 19 92; Engelhardt, 19 93; Chen, 19 94; Chang, 19 95; Cussack, 19 96; Simon, 19 99) Merrrich (19 96) so sánh tính lây nhiễm adenovirus tái tổ hợp typ... rhizogenes  31 Hình 1. 18: Bệnh khối u hình chóp mâm xơi (Rubus) A.tumefaciens gây Hình 1. 19: Các khối u hình chóp cành táo Hình 1. 20: Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 2 .1. 2 Ti-plasmid... chúng Vector BAC công cụ tốt cho việc chuẩn bị cấu trúc mang đoạn DNA có kích thước lớn để dùng cho việc tạo động vật chuyển gen (Giraldo Montoliu, 20 01) (Hình 1. 14) Hình 1. 14: Sơ đồ cấu trúc