Di truyền học thể thực khuẩn (Bacteriophage hay phage) (p2) Sự xếp gene nhiễm sắc thể phage Tần số tái tổ hợp sử dụng để xác định khoảng cách đồ Eukaryote Các thí nghiệm lập đồ cho thấy đột biến T4 lập đồ thành cụm riêng biệt Cả ba cụm có liên kết với cụm khác George Streisinger cộng (1964) chứng minh đồ di truyền phage T4 có dạng vịng trịn Trong phép lai, lập ba đến bốn marker di truyền với nhóm tiến hành qua toàn genome T4 Nhiều gene khác xác định lập đồ đầy đủ phân tử vòng tròn Những vùng vòng tròn bên cụm marker T4 xác định lập đồ di truyền Vịng ngồi có mặt nhiều marker lớn tạo thành tồn vịng trịn đồ di truyền Bản đồ di truyền phage T4 cho thấy gene phage T4 tạo cụm mở rộng theo chức chúng Chẳng hạn có cụm lớn gene dùng cho chép DNA vị trí phần tư bên phía phải có cụm gene tổng hợp cấu phần tạo nên đầu phage phía vòng tròn Phân tử DNA phage T4 phân tử sợi đơn dạng thẳng, đầu tận DNA phage T4 nhân lên lặp đoạn đầu cuối (terminal redundant) Do vậy, phân tử DNA có kích thước tăng thêm 2% Khi DNA chép tế bào, tái tổ hợp phần đầu tận gen T4 với trình tự tương đồng gen T4 khác, kết tạo sản phẩm DNA có kích thước lớn khả chứa phần đầu Những phân tử chứa lặp đoạn tạo thành tái tổ hợp gen phage T4 xảy thường xun, trung bình có khoảng 20%sự kiện tái tổ hợp xảy nhiễm sắc thể Khi phân tử DNA gói vào phần đầu, cắt enzyme chứa khoảng 102% chiều dài gen phage T4, có chứa đoạn lặp lại phần đầu Bản đồ di truyền T4 với marker Lập đồ cấu trúc tinh vi vùng rII phage T4 Các nghiên cứu chi tiết đột biến rII phage T4 làm sáng tỏ cấu trúc gene Phage T4 dạng hoang dại r+ có khả nhiễm đồng thời hai nòi E.coliB K Các đột biến rII nhiễm nịi B khơng nhiễm nịi K Seymour Benzer (1955) nhận 2400 đột biến rII có nguồn gốc độc lập với Ông cho lai đột biến với vào xuất dạng tái tổ hợp hoang dại r+ mà lập đồ điểm đột biến Mỗi đột biến tái tổ hợp với đột biến khác Đột biến đoạn ngăn cản tái tổ hợp với hai nhiều đột biến điểm vị trí khác gene Mỗi đoạn làm phần gene phage bao gồm vùng rII Sử dụng đột biến đoạn phương pháp đơn giản để lập đồ hàng ngàn đột biến Bản đồ đoạn (Deletion mapping) dựa có khơng có dạng tái tổ hợp Trong phép lai đột biến điểm chưa biết đột biến đoạn, xuất dạng hoang dại cho thấy đột biến điểm nằm vùng đoạn Ngược lại, đột biến điểm xuất vùng đoạn, không xuất dạng tái tổ hợp kiểu hoang dại hệ sau Đột biến đoạn sử dụng để chia locus rII bacteriophage T4 thành vùng 47 tiểu vùng nhỏ Nhiều phép lai thực để lập đồ đột biến chi tiết gene rII Khoảng cách từ A1 đến A6 B trình bày hình 8.4 Một đột biến đặc biệt kiểm tra định vị vùng A4 Đột biến không tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại phép lai với đột biến đoạn lớn r1272, r1241, rJ3 rPT1 tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại phép lai với rPB242, rA105 r638 Các đột biến tạo khuôn, kết lai với đột biến đoạn lớn xếp vào vùng A4 Bản đồ di truyền vùng A4 tạo đột biến đoạn trình bày phần hình Xác định tiểu vùng A4 (từ a qua g) Xác định vùng rII liên quan với marker di truyền dạng thẳng đồ di truyền phage T4 Ví dụ, đột biến vùng A4 kết tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại với đột biến đoạn r1368, lại thực với đột biến r221 vào tiểu vùng c Ở mức độ chi tiết hơn, đột biến tiểu vùng xếp nhờ lai chúng với Ở phage T4, điểm đột biến gần nhau, tách nhờ tái tổ hợp 1% tái tổ hợp tương ứng với khoảng cách khoảng 100 bp Vì vậy, hai đột biến khơng thể tái tổ hợp với xếp vào vị trí gene Bản đồ di truyền cho số lớn đột biến rII có nguồn gốc độc lập mơ tả hình Nghiên cứu đột biến vùng rII lập đồ di truyền có vai trị quan trọng, qua rút kết luận sau: + Sự trao đổi di truyền xảy gene nucleotide gần + Các đột biến không tạo tần số với tất điểm gene, chúng phân bố không Chẳng hạn, 2400 đột biến rII xác định 304 điểm Một điểm có đến 474 đột biến Nhũng điểm có tần số đột biến cao gọi điểm nóng (hotspot mutation) Ở điểm khác, đột biến phục hồi lần vài lần Bản đồ di truyền locus rII phage T4 Kết phân tích vùng rII quan trọng, giúp cho phân biết khái niệm gene Phổ biến nhất, gene liên quan với đơn vị chức Điều tương ứng với đoạn DNA mã hóa cho phân tử protein Benzer đưa thuật ngữ cistron để chức này, thuật ngữ cistron sử dụng Đơn vị chức xác định qua thử nghiệm bổ sung (complementation test), xác định đột biến có allele với khơng Trước thí nghiệm ơng rII coi locus Thí nghiệm cho thấy đột biến xếp thành hai nhóm rIIA rIIB Lai đột biến rIIA x rIIB có r+, lai rIIA ´ rIIA rIIB ´ rIIB thu kiểu hình đột biến r Ngồi nghĩa đơn vị chức năng, gene đơn vị tái tổ hợp (recon) đơn vị đột biến (muton) Cả hai đơn vị này, tương ứng với nucleotide riêng lẽ gene Tính tiềm tan (Lysogeny) phage lamda Chu trình tiềm tan bắt đầu phân tử DNA phage lamda gắn vào nhiễm sắc thể vi khuẩn tiến hành chép phần nhiễm sắc thể vi khuẩn Các hạt phage không tạo thành Phân tử DNA phage gắn vào gen vi khuẩn gọi prophage, tế bào vi khuẩn sống sót gọi tế bào tiềm tan (lysogen) Một chủng tiềm tan cho phage lamda ký hiệu theo tên phage Ví dụ chủng E coliK12(l) chủng K12 trở thành tế bào tiềm tan phage lamda Chu trình tan tiềm tan phage Phân tử DNA phage lamda có đầu đầu cuối chứa 12 nucleotide không kết cặp, mà dạng sợi đơn tạo đầu dính (cohesive end) bổ sung Khi vào tế bào, đầu cuối bổ sung gắn lại tạo phân tử vòng tròn Sự tạo vòng tròn xảy sớm chu trình tan chu trình tiềm tan Có khoảng 75% tế bào vi khuẩn bị nhiễm phage, phân tử DNA vòng tròn chép chu trình tan xảy Cịn khoảng 25% tế bào bị nhiễm, phân tử DNA vòng tròn phage l phân tử DNA vòng tròn E colitương tác xảy tái tổ hợp điểm chuyên biệt (sitespecific recombination) DNA phage gắn vào nhiễm sắc thể vi khuẩn Vị trí tái tổ hợp điểm chuyên biệt DNA vi khuẩn phage gọi điểm gắn vào vi khuẩn phage (bacterial and phage attachment sites) Mỗi điểm gắn có chứa đoạn: đoạn trung tâm có trình tự nucleotide vị trí gắn vùng mà tái tổ hợp thực xảy Điểm gắn vào phage ký hiệu POP’ (P: phage) điểm gắn vào vi khuẩn biểu diễn BOB’ (B: bacteria) So sánh đồ di truyền phage prophage POP’ nằm gần vùng trung tâm phân tử DNA dạng thẳng Một protein phage, integrase, xúc tác cho tái tổ hợp điểm chuyên biệt Enzyme integrase nhận điểm gắn vào phage vi khuẩn, gây trao đổi vật lý, kết phân tử DNA phage gắn vào phân tử DNA vi khuẩn Kết tái tổ hợp làm đồ di truyền prophage khác với đồ di truyền phage Bản đồ di truyền prophage chuyển đổi vòng tròn đồ di truyền phage tự Prophage chèn vào nhiễm sắc thể E coligiữa gene galvà gene bio Sự chèn vào phage l làm tăng khoảng cách gene galvà gene bio Khoảng cách gene galvà gene bioở tế bào tiềm tan với phage l khoảng hai phút so với phút tế bào khơng tiềm tan Mơ hình gắn phage lamda vào NST E.coli Khi tế bào tiềm tan, gene phage trở thành phần nhiễm sắc thể vi khuẩn làm kiểu hình vi khuẩn bị thay đổi Nhưng hầu hết gene phage prophage giữ trạng thái bất hoạt nhờ protein repressor - sản phẩm gene phage Protein repressor bắt đầu tổng hợp nhờ nhiễm vào phage tiếp tục tổng hợp nhờ prophage Gene mã hóa cho repressor thường gene prophage biểu chu trình tiềm tan Nếu tế bào tiềm tan bị nhiễm phage giống với prophage, có mặt repressor prophage ngăn cản biểu gene phage nhiễm vào Tính kháng với phage giống với prophage gọi tính miễn nhiễm (immunity) Đây tiêu chuẩn để xác định tế bào vi khuẩn chứa phage đặc biệt Chẳng hạn phage l không tạo đốm vi khuẩn chứa prophage lamda Trong tế bào tiềm tan, chép khơng giải phóng phage Tuy nhiên, prophage trở nên có hoạt tính, trải qua chu trình tan, tạo số lượng lớn phage hệ sau Hiện tượng gọi cảm ứng prophage (prophage induction), bắt đầu hư hại DNA vi khuẩn Đơi prophage tách khỏi DNA vi khuẩn cách ngẫu nhiên thường gây tác nhân mơi trường hóa chất chiếu xạ Khả bị cảm ứng thuận lợi cho phage DNA phage khỏi tế bào bị hư hại Cơ chế sinh hóa cảm ứng phức tạp thoát phage xảy dễ dàng Sự cắt phage tái tổ hợp điểm chuyên biệt khác, ngược với trình gắn vào Sự cắt yêu cầu enzyme phage, integrase thêm protein phage excisionase Nghiên cứu di truyền gắn vật lý cho thấy escisionase gắn với integrase sau nhận điểm gắn vào prophage BOP’ POB’, gắn với điểm Integrase cắt trình tự O tạo lại BOB’ POP’ Quá trình tách diễn ngược lại với gắn vào  ... gắn vào phage vi khuẩn, gây trao đổi vật lý, kết phân tử DNA phage gắn vào phân tử DNA vi khuẩn Kết tái tổ hợp làm đồ di truyền prophage khác với đồ di truyền phage Bản đồ di truyền prophage chuyển... vào vùng A4 Bản đồ di truyền vùng A4 tạo đột biến đoạn trình bày phần hình Xác định tiểu vùng A4 (từ a qua g) Xác định vùng rII liên quan với marker di truyền dạng thẳng đồ di truyền phage T4 Ví... gene Bản đồ di truyền cho số lớn đột biến rII có nguồn gốc độc lập mơ tả hình Nghiên cứu đột biến vùng rII lập đồ di truyền có vai trị quan trọng, qua rút kết luận sau: + Sự trao đổi di truyền xảy