Ngày tải lên :
19/08/2012, 00:04
...
CứU
3.1. Đối tượng , vật liệu , địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Gồm một số tổ hợp lai F
1
, quần thể F
2
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
* Thí nghiệm trong phòng:
Thiết bị :+ Máy PCR , máy chạy điện di , máy chụp ảnh điện
di , máy li tâm , máy votex , tủ lạnh , lò vi sóng .
+ Các loại ống effendof , các loại pipet và đầu tiếp đi kèm .
Thành phần cho phản ứng PCR
+ Cặp mồi phát hiện gen bất dục đực tms2 theo M.T.Lopez
và cộng sự (2003)có trình tự là :
RM11_F:5’TCTCCTCTTCCCCCGATC3’
RM11_R:5’ATAGCGGGCGAGCTTAG3’
Hóa chất chạy PCR : dNTD , MgCl
2
, Taq ADN polymerase ,
PCR mastermix , nước cất
Hóa chất dùng để chiết tách ADN hệ gen :
Để chọn tạo lúa lai hai dòng thành công thì dòng TGMS
phải nhiều và phong phú,từ đó mới tạo ra được tổ hợp cho
ưu thế lai cao. Hiện nay các dòng TGMS đang được sử
dụng như:103S,T1S96,64S,287S,36S
2
,Kim 76S,Pair 64S
và 25S.
Các nhà khoa học đã tìm được 6 gen TGMS(tms1, tms2,
tms3, tms4, tms5, tms6).Mỗi gen này có ngưỡng chuyển
hóa hữu dục và bất dục khác nhau,trong đó,gen tms2 có
ngưỡng chuyển hóa hữu dục ổn định.Nhà chọn tạo giống
đã sử dụng các gen TGMS này lai chuyển vào các
dòng,giống lúa triển vọng để tạo dòng TGMS tốt,có khả
năng phối hợp cao, tạo ra nhiều tổ hợp lai mới cho ưu thế
lai cao như TH33,Việt Lai 20,TH34,…
Thành phần Nồng dộ dung
dịch mẹ
Nồng độ dung
dịch làm việc
Hỗn hợp 50ml
dung dịch TE làm
việc
TrisHCl(pH=8) 1M 10mM 0,5ml
EDTA(pH=8) 0,5M 1mM 0,1ml
H
2
O 49,4ml
Thành phần dung dịch đệm TE
•
Hóa ... di phát hiện sản phẩm PCR trên gel agarose 1 %
Thành phần Nồng độ dung
dịch mẹ
Nồng độ dung
dịch làm việc
Hỗn hợp 10ml
dung dịch chiết
tách
TrisHCl(pH=8) 1M 50mM 0,5ml
EDTA(pH=8) 0,5M 0,25mM ... PCR
Bước 6:Cho 600 µl hỗn hợp Chlorofom :
Isoamylalcohol(24:1),lắc đều va ly tâm 7 phút với tốc độ
13000 vòng/phút rồi hút phần dung dịch ở trên vào ống
eppendorf mới đã đánh dấu tương ứng.
Bước 7: Cho 800 µl Ethanol(96%)(hoặc 600 µl
Isopropanol),trộn đều và ly tâm 7 phút với tốc độ 13000
vòng/phút.Sau đó đổ phần dung dịch phía trên giữ lại
phần kết tủa dưới đáy ống nghiệm.
Bước 8: Rửa kết tủa bằng Ethanol 70%,làm khô tự nhiên
ở nhiệt độ phòng bằng cách úp ngược ống nghiệm lên giấy
thấm.
Bước 9:Hòa tan kết tủa bằng 50 µl dung dịch TE rồi bảo
quản ở nhiệt độ 20
o
C
+Kiểm tra độ tinh sạch ADN bằng cáchđiện di trên gel
agarose 1%.
+Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi RM11 cho gen tms2.
Bằng việc sử dụng ADN marker(chỉ thị phân
tử) thời gian chọn tạo ra các dòng mới được rút
ngắn .Các chỉ thị liên kết chặt với các tính trạng
kiểu hình.Do đó,chúng ta có thể xác định được
các tính trạng dựa trên sự có mặt của các gen
mong muốn.Kỹ thuật này không chỉ có độ chính
xác cao mà còn xác định được trên một lượng lớn
vật liệu nghiên cứu.
Để đáp ứng được mục tiêu chọn giống chúng tôi
tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị
phân tử DNA chọn lọc gen tms2 để tạo ra các
dòng TGMS mới”.
...