Các phương pháp chẩn đoán bệnh cúm Các phương pháp chẩn đoán bệnh cúm gia cầm gia cầm Chẩn đoán huyết thanh học Chẩn đoán huyết thanh học • Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA) Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA) • Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà(HI) Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà(HI) Chẩn đoán virus học Chẩn đoán virus học • Phưong pháp phân lập virus trên phôi trứng Phưong pháp phân lập virus trên phôi trứng • Giám định virus bằng kỹ thuật PCR Giám định virus bằng kỹ thuật PCR Chẩn đoán virus học Chẩn đoán virus học Lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm Lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm • Lấy mẫu ổ nhớp: Dịch ở nhớp được lấy bằng tăm Lấy mẫu ổ nhớp: Dịch ở nhớp được lấy bằng tăm bông tại lỗ huyệt , sau đó được đặt vào trong bông tại lỗ huyệt , sau đó được đặt vào trong ống nhựa đã khử trùng chứa 1-2 ml dung dịch ống nhựa đã khử trùng chứa 1-2 ml dung dịch bảo quản có kháng sinh liều cao để hạn chế sự bảo quản có kháng sinh liều cao để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn . phát triển của vi khuẩn . • Mẫu được giữ ở 40C và phải tiến hành phân lập Mẫu được giữ ở 40C và phải tiến hành phân lập virus trong phạm vi 48 giờ kể từ khi lấy mẫu , virus trong phạm vi 48 giờ kể từ khi lấy mẫu , nếu cần bảo quản trong thời gian dài hơn thì nếu cần bảo quản trong thời gian dài hơn thì phải giữ ở nhiệt độ -700 C phải giữ ở nhiệt độ -700 C Lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm Lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm • Mẫu bệnh phẩm được pha trong PBS(pH 7,2) Mẫu bệnh phẩm được pha trong PBS(pH 7,2) thành huyễn dịch 10% thành huyễn dịch 10% • Ly tâm huyễn dịch 1000vòng/phút thu dịch nổi Ly tâm huyễn dịch 1000vòng/phút thu dịch nổi • Bổ sung kháng sinh 10 X (đặc 10 lần) gồm Bổ sung kháng sinh 10 X (đặc 10 lần) gồm Kanamycin, Penicilin, Steptomycin theo tỷ lệ Kanamycin, Penicilin, Steptomycin theo tỷ lệ 1/10 vào huyễn dịch bệnh phẩm trên, để trong 1/10 vào huyễn dịch bệnh phẩm trên, để trong tủ lạnh 40 C ít nhất trong vòng 2 giờ để kháng tủ lạnh 40 C ít nhất trong vòng 2 giờ để kháng sinh tác dụng. Các huyễn dịch bệnh phẩm nếu sinh tác dụng. Các huyễn dịch bệnh phẩm nếu không được xử lý kháng sinh thì có thể lọc qua không được xử lý kháng sinh thì có thể lọc qua màng lọc 0,45μm hoặc 0,22μm. màng lọc 0,45μm hoặc 0,22μm. Phân lập virus trên phôi gà Phân lập virus trên phôi gà • Phân lập virus từ bệnh phẩm bằng cách tiêm Phân lập virus từ bệnh phẩm bằng cách tiêm vào túi niệu phôi gà 9-11 ngày tuổi vào túi niệu phôi gà 9-11 ngày tuổi • Tiêm truyền trên phôi gà Tiêm truyền trên phôi gà • Đặt trứng lên khay, xoay buồng hơi lên phía trên Đặt trứng lên khay, xoay buồng hơi lên phía trên • Sát trùng vỏ trứng và đục một lỗ trên buồng hơi Sát trùng vỏ trứng và đục một lỗ trên buồng hơi • Dùng syringen tiêm truyền bệnh phẩm theo lỗ Dùng syringen tiêm truyền bệnh phẩm theo lỗ đã đục vào túi niệu lượng 0,1-0,2 ml huyễn đã đục vào túi niệu lượng 0,1-0,2 ml huyễn dịch/trứng . Mỗi bệnh phẩm tiêm 3 trứng. dịch/trứng . Mỗi bệnh phẩm tiêm 3 trứng. • Gắn lỗ tiêm bằng keo gắn vỏ trứng hoặc parafin Gắn lỗ tiêm bằng keo gắn vỏ trứng hoặc parafin Phân lập virus trên phôi gà Phân lập virus trên phôi gà • Ấp trứng ở 370 C trong 7 ngày Ấp trứng ở 370 C trong 7 ngày • Thu hoạch nước trứng Thu hoạch nước trứng • Cất trứng vào tủ lạnh 40 C trong 4 giờ hoặc để trong tủ Cất trứng vào tủ lạnh 40 C trong 4 giờ hoặc để trong tủ ấm -200 C trong 30 phút . ấm -200 C trong 30 phút . • Dùng panh kẹp hoặc kéo đầu nhọn mở nắp trứng ở phía Dùng panh kẹp hoặc kéo đầu nhọn mở nắp trứng ở phía buồng hơi buồng hơi • Hút nước niệu mô bâừng pipet, cho vào ống nghiệm Hút nước niệu mô bâừng pipet, cho vào ống nghiệm 10ml. 10ml. • Bảo quản nước trứng đã thu hoặch được trong tủ ấm Bảo quản nước trứng đã thu hoặch được trong tủ ấm -700 C -700 C • Mẫu đã phân lập được kiểm tra bằng phản ứng HA. Nếu Mẫu đã phân lập được kiểm tra bằng phản ứng HA. Nếu âm tính có thể cấy chuyển trên phôi gà thêm 2-3 lần âm tính có thể cấy chuyển trên phôi gà thêm 2-3 lần Phản ứng RT-PCR Phản ứng RT-PCR Bước1: chiết tách RAN từ bệnh phẩm bằng TRIZOL Bước1: chiết tách RAN từ bệnh phẩm bằng TRIZOL • Cho 750 μl bệnh phẩm vào ống 1,5 ml Cho 750 μl bệnh phẩm vào ống 1,5 ml • Thêm 250 μl TRIZOL. Thêm 250 μl TRIZOL. • Giữ 5 phút ở nhiệt độ phòng . Giữ 5 phút ở nhiệt độ phòng . • Thêm 250 μl chlorofrom, đậy nắp chặt. Thêm 250 μl chlorofrom, đậy nắp chặt. • Lắc ống trên máy lắc trong 15 giây. Lắc ống trên máy lắc trong 15 giây. • Giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. • Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Phản ứng RT-PCR Phản ứng RT-PCR Bước1: chiết tách RNA từ bệnh phẩm bằng TRIZOL Bước1: chiết tách RNA từ bệnh phẩm bằng TRIZOL • Hút 450-500 μl sang một ống mới. Hút 450-500 μl sang một ống mới. • Thêm 500 μl iso propanol, trộn bằng pipet rồi Thêm 500 μl iso propanol, trộn bằng pipet rồi giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút. giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút. • Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/ phút trong thời Ly tâm với tốc độ 13000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút. gian 5 phút. • Thêm 1ml ethanol 75% rồi ly tâm với tốc độ Thêm 1ml ethanol 75% rồi ly tâm với tốc độ 10000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút. 10000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút. • Để khô ở nhiệt độ phòng . Để khô ở nhiệt độ phòng . • Cho thêm 20 -60 μl nước. Cho thêm 20 -60 μl nước. Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc ) ) Nguyên liệu Nguyên liệu : : • Kit QIAGen Onestep RT-PCR (catalog #210212) Kit QIAGen Onestep RT-PCR (catalog #210212) gồm: gồm: • Hỗn hợp enzyme QIAGen Onestep RT-PCR (chứa Hỗn hợp enzyme QIAGen Onestep RT-PCR (chứa Omn iscript TMRT, Sesicript TMRT và HotstarTaq Omn iscript TMRT, Sesicript TMRT và HotstarTaq TM DNA polymerase) TM DNA polymerase) • Dung d ịch QIAGen Onestep RT-PCR, 5X. Dung d ịch QIAGen Onestep RT-PCR, 5X. • Dung d ịch Q-solution- 5X. Dung d ịch Q-solution- 5X. Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc ) ) • Hỗn hợp dNTP,10mM mỗi loại . Hỗn hợp dNTP,10mM mỗi loại . • Nước RNAse- Free. Nước RNAse- Free. • Chất ức chế RNAse( 40U/ μl). Chất ức chế RNAse( 40U/ μl). • Ông ly tâm nhỏ vô tr ùng 0,5ml. Ông ly tâm nhỏ vô tr ùng 0,5ml. • Pipet và đầu tip các cỡ 10,20 và 100 μl. Pipet và đầu tip các cỡ 10,20 và 100 μl. • Máy ly tâm ống nhỏ tốc độ 13000 vòng/ phút Máy ly tâm ống nhỏ tốc độ 13000 vòng/ phút Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc Bước 2:Tiến hành RT-PCR ( 1 b ư ớc ) ) • Máy lắc vortex. Máy lắc vortex. • Máy nhân gen . Máy nhân gen . • RNA của virus kiểm tra . RNA của virus kiểm tra . • RNA đối chứng dương tính . RNA đối chứng dương tính . • Primer forward và primer reverse . Primer forward và primer reverse . • Primer đặc hiệu H5N1: H5N1F và H5N1R. Primer đặc hiệu H5N1: H5N1F và H5N1R. [...]... DNA đối chứng dương tính Các bước tiến hành • Lấy một miếng thạch 0,8% từ khuôn ra đặt vào • • • buồng điện di, đổ dung dịch TBE 1X che phủ lớp thạch Đánh dấu các ống ly tâm nhỏ 0,5 ml a, b, c Lấy 5 μl các sản phẩm PCR từ các ống phản ứng vào các ống ly tâm nhỏ tương ứng , trộn với 2μl dung dịch nạp(GLB) Cho 5μl marker trọng lượng phân tử vào giếng thứ nhất của miếng thạch 1,5% Các bước tiến hành • Cho... bước tiến hành • Cho 7μl sản phẩm PCR/GLB từ các ống ly tâm • • • nhỏ vào các giếng 2, 3, 4, …10 của miếng thạch theo thứ tự từ a đến c Đóng nắp buồng điện di và cực nối điện , chạy điện di ở điện thế 120V trong 30- 40 phút Đọc kết quả của marker và vạch của sản phẩm PCR với đèn cực tím cầm tay với ánh sáng cực tím có bước sóng 302nm Ghi lại hình bằng máy ảnh Các hoá chất sử dụng trong xét nghiệm phân... giây (tách sợi ) 500 C trong 30 giây (gắn primer) 720 C trong 1 phút Quay lại bước sáu 34 lần 720 C trong 10 phút • 40 C Bước3: Chạy điện di sản phẩm PCR Nguyên liệu • Khay đổ khuôn thạch và buồng điện di • Nguồn điện và điện cực • Đèn cực tím cầm tay(302 nm) hoặc hộp đèn cực tím • Máy ảnh và phim • Pipette và đầu tip 10 μl • Thạch agarose 0,8% pha trong dung dịch TBE 1X( Invitrogen) • Dung d ịch TBE.. .Các bước tiến hành phản ứng PCR (1 bước ) • • • • • • • • • • • • • đánh dấu c ác ống ly tâm nhỏ 0,5 ml A, B, C riêng rẽ Chuẩn bị hỗn hợp PCR như sau : Dung dịch 5XRT- PCR 10 μl 10mM dNTPs 2 μl Enzym hỗn hợp 2 μl Chất ức chế RNAse 0,25 μl Nước RNAse- free 31,75 μl Nhỏ 46 μl hỗn hợp PCR vào mỗi ống PCR Th êm 1 μl Primer H5N1F v à H5N1R vào các ống A, B,C Th êm 2 μl RAN... H5N1R vào các ống A, B,C Th êm 2 μl RAN ki ểm tra v ào c ác ống A 2 μl RNA đối chứng H5N1 vào ống B 2 μl nước RNAse – Free vào ống C Ly tâm nhẹ để dịch tập trung xuống đáy ống Các bước tiến hành phản ứng PCR (1bước ) • Đặt các ống trong máy nhân gen , đặt chương trình để nhân gen – – – – – – – – – – 60o C trong 1 phút 42o C trong 0,5 phút 42o C trong 10 phút 500 C trong 30 phút 950 C trong 15 phút . Các phương pháp chẩn đoán bệnh cúm Các phương pháp chẩn đoán bệnh cúm gia cầm gia cầm Chẩn đoán huyết thanh học Chẩn đoán huyết thanh. trở ngưng kết hồng cầu gà(HI) Chẩn đoán virus học Chẩn đoán virus học • Phưong pháp phân lập virus trên phôi trứng Phưong pháp phân lập virus trên phôi