Đang tải... (xem toàn văn)
Phát hiện nấm Fusarium spp. gây bệnh thối xương rồng (Cactaceae) bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN LOÀI Fusarium spp. GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG PHƢƠNG PHÁP POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện : PHẠM THỊ HẰNG Thành phố Hồ Chí Minh - Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** PHÁT HIỆN LOÀI NẤM Fusarium spp. GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện KS. DƢƠNG THÀNH LAM PHẠM THỊ HẰNG TS. LÊ ĐÌNH DÔN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 ii LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi nhận đƣợc rất nhiều sự ủng hộ và giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè. Nay tôi xin chân thành cảm ơn đến: Cha Mẹ và những ngƣời thân luôn tạo điều kiện, động viên con trong suốt quá trình con học tập tại trƣờng. Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả Thầy Cô đã tận tình giúp đỡ, dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Thầy Lê Đình Đôn và thầy Dƣơng Thành Lam đã hết lòng giúp đỡ, hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Anh Nguyễn Văn Lẫm, các Anh Chị làm việc tại phòng thí nghiệm 105 Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật khoa Nông Học cùng các Anh Chị làm việc tại Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Các Bạn sinh viên lớp công nghệ sinh học 29 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài tốt nghiệp. Tp. Hồ Chí Minh tháng 9 năm 2007 Phạm Thị Hằng iii TÓM TẮT PHẠM THỊ HẰNG, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9-2007 “PHÁT HIỆN LOÀI NẤM Fusarium spp. GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)” tại phòng Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Học trƣờng Đại học Nông Lâm và Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng – phòng Công nghệ Sinh học Thực vật Trƣờng Đại học Nông Lâm – TP.HCM. Thời gian thực hiện đề tài: 20/3/2007 đến 30/7/2007. Giáo viên hƣờng dẫn: KS. Dƣơng Thành Lam. TS. Lê Đình Đôn. Nội dung nghiên cứu Điều tra tình hình bệnh hại xƣơng rồng trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh. Thu thập xƣơng rồng bị bệnh từ các vƣờn điều tra. Từ đó phân lập, nhân và thu sinh khối các dòng nấm đã phân lập đƣợc. Ly trích thu DNA. Thực hiện quy trình phản ứng PCR khuếch đại trình tự nằm trong vùng tef bằng primer ef1 và ef2 của các dòng nấm phân lập đƣợc. Giải trình tự sản phẩm PCR. Chủng bệnh lên xƣơng rồng khỏe mạnh. Kết quả đạt đƣợc Tỷ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn điều tra: Bệnh do vi khuẩn: 7,43%. Bệnh do nấm: 18,2%. Bệnh do virus: 0,16%. Phân lập đƣợc 12 dòng nấm từ các mẫu xƣơng rồng bị bệnh với 2 hình thái có màu khuẩn lạc đặc trƣng: Khuẩn lạc nấm màu trắng, tròn, tơ mịn. Khuẩn lạc nấm màu tím, tròn, tơ mịn. iv Ly trích đƣợc DNA tổng số của 12 dòng nấm phân lập đƣợc. Khuếch đại đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc 700 bp nằm trong vùng tef của các dòng nấm (dựa vào thang ladder). Giải trình tự vùng tef của 3 dòng nấm thuộc Fusarium spp. gồm: FC07 – 3, FC07 – 7, FC07 – 10. Xác định dòng FC07 – 3 và FC07 – 10 là nấm Fusarium solani. Còn dòng FC07 – 7 đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu. Chủng bệnh nấm trên xƣơng rồng khỏe: 7 dòng nấm có khả năng gây bệnh nặng sau 4 ngày chủng bênh (ở nhiệt độ phòng). v MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ . ii TÓM TẮT . iii MỤC LỤC . v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH SÁCH CÁC HÌNH . ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ . x DANH SÁCH ĐỒ THỊ . x Chƣơng 1: MỞ ĐẦU . 1 1.1. Đặt vấn đề . 1 1.2. Mục đích - yêu cầu . 2 1.2.1. Mục đích . 2 1.2.2. Yêu cầu . 2 1.3 Giới hạn của đề tài 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Một số đặc tính để phát triển kiểng xƣơng rồng 3 2.2. Phân loại thực vật và giới thiệu về cây xƣơng rồng (Cactaceae) 4 2.2.1. Phân loại thực vật 4 2.2.2. Giới thiệu về cây xƣơng rồng và các cây cùng họ 4 2.2.3. Tình hình sản xuất và phát triển xƣơng rồng ở Tp. Hồ Chí Minh và trên thế giới 5 2.2.3.1. Tại Tp. Hồ Chí Minh . 5 2.2.3.2. Trên thế giới 6 2.2.4. Đặc tính thực vật và điều kiện sinh thái của xƣơng rồng (theo Huỳnh Văn Thới, 2004) . 6 2.2.4.1. Đặc tính thực vật 6 2.4.2.2. Điều kiện sinh thái 10 vi 2.2.5. Bệnh hại trên cây xƣơng rồng . 11 2.2.5.1. Bệnh thối gốc xƣơng rồng . 11 2.2.5.2. Bệnh đốm than . 11 2.2.5.3. Tuyến trùng hại xƣơng rồng 12 2.2.5.4. Rệp sáp hại xƣơng rồng . 12 2.3. Sự phân loại, phân bố, phạm vi kí chủ, đặc điểm phát sinh phát triển và khả năng gây bệnh của nấm Fusarium 12 2.3.1. Sự phân loại 12 2.3.2. Sự phân bố 14 2.3.3. Phạm vi kí chủ 14 2.3.4. Đặc điểm phát sinh phát triển của nấm Fusarium 14 2.4. Khả năng gây hại của nấm Fusarium spp. gây ra và biện pháp phòng trừ 14 2.4.1. Khả năng gây hại 14 2.4.2. Một số biện pháp chủ yếu để phòng trị nấm Fusarium spp. . 16 2.4.2.1. Sử dụng cây giống kháng bệnh . 16 2.4.2.2. Biện pháp canh tác . 16 2.4.2.3. Biện pháp hóa học . 17 2.5. Tổng quan về vùng tef trên genome của nấm Fusarium 17 2.6. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nấm 18 2.6.1. Khái niệm 18 2.6.2. Nguyên tắc 19 2.6.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng PCR . 20 2.6.4. Ứng dụng của PCR . 22 2.7. Giới thiệu sơ lƣợc về kỹ thuật DNA sequencing . 22 2.8. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do nấm Fusarium spp. 22 2.8.1. Trên thế giới 22 2.8.2. Tại Việt Nam . 25 2.9. Danh mục một số loài Fusarium đƣợc tìm thấy ở Việt nam 26 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 27 vii 3.1. Vật liệu thí nghiệm . 27 3.1.1. Thời gian – địa điểm nghiên cứu 27 3.1.2. Vật liệu 27 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 29 3.2.1 Điều tra tình hình bệnh chết trên cây xƣơng rồng tại TP. Hồ Chí Minh . 29 3.2.2. Phân lập mẫu nấm . 29 3.2.3. Tăng sinh khối nấm trên môi trƣờng nhân sinh khối 31 3.2.4. Ly trích DNA tổng số của nấm . 32 Quy trình này đƣợc thực hiện dựa trên quy trình của Lee và Taylor. . 32 3.2.5. Điện di xem DNA tổng số 32 3.2.6. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng tef các dòng nấm Fusarium spp. 33 3.2.7. Đọc trình tự sản phẩm PCR 35 3.2.8. Chủng nấm lên cây xƣơng rồng 36 3.2.8.1. Tiến hành chủng bệnh trên xƣơng rồng . 36 3.2.8.2. Đánh giá kết quả 36 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1. Tình hình bệnh hại xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh 37 4.2. Các triệu chứng bệnh trên xƣơng rồng . 37 4.2.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra (số liệu điều tra tháng 04 năm 2007). . 39 4.3. Phân lập mẫu nấm 40 4.4. Kết quả ly trích thu DNA tổng số từ các loài nấm Fusarium spp. . 41 4.5. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng tef 43 4.6. Kết quả giải trình tự vùng tef . 43 4.7. Chủng bệnh trên xƣơng rồng 50 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 5.1. Kết luận 52 5.2. Đề nghị . 53 viii TÀI LIỆU THAM KHẢO . 54 PHỤ LỤC 58 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR :Polymerase chain reaction. DNA :Deoxyrybonucleotide acid. TE :Tris EDTA. TAE :Tris Acetate EDTA. dNTP :Deoxynucleotide triphosphate. Taq :Thermus aquaticus. UV :Ulta violet. PGA :Potato glucose agar. WA :Water agar. EtBr :Ethidium bromide. l :micro lít. g :micro gam. M :micro gam/ lít. mM :mili gam/ lít. ctv :cộng tác viên. ng :nano gam. bp :base pair. rDNA : ribosomal DNA RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism. Tm : Melting Tempereture. TEF : Translation elongation factor. ITS : Internal Transcribed Spacer. ix NCBI : National Center for Biotechnology Informatic. DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Hình thái bào tử nấm Fusarium spp. . 13 Hình 2.2. Vùng gen tef trên nấm Fusarium sử dụng trong FUSARIUM-ID 17 Hình 4.1. Xƣơng rồng với triệu chứng thối gốc 38 Hình 4.2. Xƣơng rồng với triệu chứng thối vàng và đen ở gốc . 39 Hình 4.3. Xƣơng rồng với triệu chứng thối thân . 39 Hình 4.4. Xƣơng rồng cắt dọc với triệu chứng thối từ lõi ra ngoài 39 Hình 4.5. Nấm phân lập từ xƣơng rồng bệnh trên môi trƣờng PGA . 42 Hình 4.6. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của nấm 43 Hình 4.7. Sản phẩm PCR khi khuếch đại bằng cặp primer ef1 và ef2. 44 Hình 4.8. Xƣơng rồng khỏe mạnh trƣớc khi chủng bệnh 51 Hình 4.9. Xƣơng rồng với triệu chứng thối sau khi chủng 51 Hình 4.10. Nấm phân lập từ xƣơng rồng bị bệnh sau khi chủng nấm 4 ngày trên môi trƣờng PGA. 52 [...]... hƣ hại dẫn đến giảm phẩm chất, bệnh nặng và có thể chết hàng loạt gây thiệt hại cho nhà vƣờn và ngƣời sử dụng Các bệnh thƣờng gặp trên xƣơng rồng: bệnh thối gốc, bệnh đốm than… và một trong những bệnh phổ biến nhất là bệnh thối do nấm Fusarium spp., bệnh này gây nguy hiểm cho tất cả các loại xƣơng rồng Vì vậy, vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác tác nhân gây bệnh để từ đó có những định hƣớng... về bệnh do nấm Fusarium spp 2.8.1 Trên thế giới Tuy hiện nay các kỹ thuật công nghệ sinh học rất phát triển nhƣng dƣờng nhƣ việc ứng dụng các kỹ thuật này để định danh hay chẩn đoán bệnh do nấm Fusarium spp gây hại trên xƣơng rồng rất ít Và theo chúng tôi tìm hiểu thì chƣa thấy có tài liệu nào nói về kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán, phát hiện 22 nấm Fusarium spp gây bệnh trên xƣơng rồng. .. một số dòng nấm Fusarium gây bệnh cho ngƣời và động vật nhƣ: gây ung thƣ họng ở ngƣời và ung thƣ bán cầu đại não trên ngựa và chuột (Thiel, P.G và ctv, 1991) 2.3.4 Đặc điểm phát sinh phát triển của nấm Fusarium Theo Bugnicourt F (1939), nấm Fusarium có phổ kí chủ rất rộng trong các điều kiện khác nhau và có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ 5ºC– 400C 2.4 Khả năng gây hại của nấm Fusarium spp.. . đích - yêu cầu 1.2.1 Mục đích Xác định tên loài Fusarium spp gây bệnh thối xƣơng rồng nhằm tìm ra quy trình phòng trừ hữu hiệu cho xƣơng rồng 1.2.2 Yêu cầu Điều tra tình hình bệnh hại tại các vƣờn trồng xƣơng rồng trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh Thu thập và phân lập mẫu nấm trên xƣơng rồng bệnh Nhân sinh khối các dòng nấm Fusarium spp Ly trích DNA các dòng nấm phân lập đƣợc Thiết lập quy trình phản ứng... của cây ghép Ban đầu là các đốm thối chứa nhiều nƣớc màu xám hoặc nâu đen, các chấm mốc màu đỏ tím hoặc màu trắng ở nơi tiếp giáp phần bệnh và phần khỏe Đó là thể quả nấm và chất tiết của nấm Khi bệnh lan rộng đến xung quanh thân, cây có thể bị khô mà chết Nguyên nhân gây bệnh thối gốc xƣơng rồng là do nấm lƣỡi liềm (Fusarium oxysporum Schlecht) thuộc lớp nấm bào tử sợi gây ra Bào tử không màu hình lƣỡi... bệnh trên xƣơng rồng Chỉ có chẩn đoán và phát hiện nấm Fusarium spp bằng biện pháp sinh học phân tử trong một số lĩnh vực nhƣ là: Ralph A Wang, Yi-Hong và cộng sự, (2002) đã sử dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện genotype kháng Fusarium gây bệnh héo trên cây trồng Nghiên cứu này nhằm mục đích phát hiện genotype của cây họ bầu bí kháng hay mẫn cảm với sự nhiễm Fusarium Các nhà nghiên cứu này đã sử dụng... xuất hiện ở các vùng mƣa nhiều và đất thoát nƣớc kém Là loài phổ biến nhất ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới Chúng gây thối rễ, cổ rễ của nhiều loại cây trồng: đậu, cà chua Gây thối củ, gây bệnh loét, chết khô của nhiều loại cây trồng ( Nelson, 1981) Loài F oxysporum: loài này phổ biến trong đất canh tác ở vùng ôn đới và nhiệt đới Loài này gồm nhiều dòng khác nhau và gây bệnh nghiêm trọng: gây héo... giới, nấm Fusarium gây thiệt hại trên các loại cây trồng và gây ảnh hƣởng rất lớn đến kinh tế, đặc biệt ở vùng Châu Phi, Châu Mỹ và các nƣớc nhƣ: Australia, Panama, Hawaii, Philippines, Taiwan và các nƣớc Đông Nam Á Bệnh do nấm Fusarium đƣợc phát hiện vào năm 1809 do nhà bác học Link, H.F Sau đó vào năm 1821 đƣợc nhà bác học Fries, E bổ sung thêm 2.3.3 Phạm vi kí chủ Theo Bùi Xuân Đồng (1986), nấm Fusarium. .. tốt Với vùng nhiệt độ thấp, xƣơng rồng vẫn chịu đựng đƣợc, mặc dầu sự sinh trƣởng có phần chậm lại 10 Độ ẩm Độ ẩm không khí cũng rất cần thiết cho sự sinh trƣởng của xƣơng rồng, tuy nhiên độ ẩm quá thấp lại không tốt 2.2.5 Bệnh hại trên xƣơng rồng 2.2.5.1 Bệnh thối gốc xƣơng rồng Là bệnh khá phổ biến và nguy hiểm cho tất cả các loại xƣơng rồng Bệnh gây hại chủ yếu là thối gốc hoặc một số vết thƣơng... en.wikipedia.org/wiki /Fusarium) b a Hình 2.1 Hình thái bào tử nấm Fusarium spp a Nấm có dạng hình lƣỡi liềm b Vách ngăn (Nguồn:http://www.botany.utoronto.ca/ResearchLabs/MallochLab/Malloch/ Moulds/Illustrations /Fusarium_ drawing.jpg) Nấm Fusarium thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), giai đoạn sinh sản hữu tính là gibberella thuộc lớp nấm nang (Ascomycetes) Có tế bào sinh bào tử trần Fusarium đặc trƣng bởi hệ sợi nấm . MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** PHÁT HIỆN LOÀI NẤM Fusarium spp. GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain. Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9-2007 “PHÁT HIỆN LOÀI NẤM Fusarium spp. GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase
