Đang tải... (xem toàn văn)
Thử nghiệm hoạt tính estrogen của mầm hạt đậu nành
THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH ESTROGEN CỦA MẦM HẠT ĐẬU NÀNH TÓM TẮT Mục tiêu: Hạt Đậu nành (Glycine max) nguồn nguyên liệu chứa nhiều genistein, loại isoflavonoid có hoạt tính estrogen, dùng liệu pháp hormon thay HRT (hormone replacement therapy) Những thử nghiệm dược lý chứng minh flavonoid mầm hạt Đậu nành hỗ trợ cho trường hợp thiểu estradiol chuột thí nghiệm Đối tượng &phương pháp nghiên cứu: Thử nghiệm chuột nhắt trắng với test Elisa, Atswood thử nghiệm khảo sát tác động estradiol tăng trọng Kết quả: Thử nghiệm ELISA chứng minh cho chuột nhắt trắng dùng bột mầm Đậu nành sau 15 ngày có tác dụng phục hồi giảm hàm lượng estradiol chuột bị giảm sinh dục, tác dụng kiểu estrogen chuột bình thường Bằng thử nghiệm ATSWOOD cho thấy bột mầm Đậu nành làm tăng trọng lượng tử cung chuột bình thường chuột gây giảm sinh dục bị cắt bỏ hai nỗn sào Bên cạnh với thử nghiệm khảo sát tác động estradiol tăng trọng sơ kết luận bột mầm hạt Đậu nành có tác dụng làm giảm tăng trọng chuột giảm sinh dục cắt bỏ nỗn sào Kết luận: Qua kết có thử nghiệm khẳng định bột mầm hạt Đậu nành có tác dụng phytoestrogen Từ khóa: Hoạt tính estrogen, mầm hạt đậu nành, HRT, thử nghiệm ELISA, thử nghiệm Atswood, chuột bị giảm sinh dục, noãn sào chuột ABSTRACT ESTROGENIC-ACTIVITY TESTS OF SOYABEAN SPROUT Nguyen Hoang Linh, Bui My Linh *Y Hoc TP Ho Chi Minh *Vol 14 Supplement of No 1-2010: 73 – 79 Introduction: Soyabean (Glycine max) is the main source of genistein extraction This is an estrogenic-activity isoflavonoid, used as a HRT (hormone replacement therapy) Pharmacological tests revealed the flavonoids in Soyabean sprouts (S.S) can help in the deficient-estradiol cases on the tested mice Methods & Materials: Mice, Elisa test, Atswood test and the test of estradiol activity on the weight Results: ELISA test proved that the utilization of S.S during 15 days only has the effect in recovery of estradiol on the estrogen-deficiency-induced mice, without the estrogenic-activity on the normal mice ATSWOOD test showed the S.S is the evidence in uterus-weight increasing not only normal but also Besides, with the of the test mice , preliminarily conclusion the S.S have the action of decreased-weight in estrogen-deficiency-induced, ovariectomized mice Conclusion: The approved-results from above tests showed the S.S have the action of a phytoestrogen Keywords: estrogenic-activity, Soyabean sprout, HRT, test ELISA, test ATSWOOD, estrogen-deficiency-induced mice, ovariectomized mice ĐẶT VẤN ĐỀ Liệu pháp hormon thay dùng cho phụ nữ độ tuổi tiền mãn kinh mãn kinh(2) để hạn chế rối loạn thiếu estrogen gây Phytoestrogen từ hạt Đậu nành có hoạt tính tạo hormon nữ, giúp cho hoạt động thể gắn vào thụ thể estrogen giúp thể sản sinh estradiol Tác động diện isoflavonoid có tên genistein (4),(5) Trong hạt Đậu nành genistein dạng glycosid genistin tác động gắn kết vào thụ thể hạn chế Trong nghiên cứu cho thấy enzym có hạt Đậu nành nảy mầm thúc đẩy tạo thành estradiol chuột thử nghiệm cắt bỏ hai noãn sào Kết thực nghiệm đánh giá test Elisa thử nghiệm Astwood ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu Nguyên liệu dùng thử nghiệm bột định chuẩn mầm hạt Đậu nành(6) Công ty Nghiên cứu Sản xuất Dược liệu Miền Trung cung cấp Bột mịn có màu vàng xanh lá, vị nhạt béo, mùi thơm Độ ẩm 4,5 % (sản xuất ngày 25-03-2009, PKN số 4770909-HDV) Thuốc đối chiếu dùng nghiên cứu Progynova, hàm lượng mg Estradiol valerate/viên (hãng Bayer Schering Pharma) Bộ KIT Elisa hãng Human (Đức) Máy đọc Elisa hiệu Biotek Elx 808 (USA) Động vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng giống cái, chủng Swiss albino 5-6 tuần tuổi, thể trọng trung bình 22 ± 2g Viện vắc xin sinh phẩm y tế Nha Trang cung cấp Chuột cho ăn uống bình thường để ổn định tuần trước thử nghiệm Phương pháp nghiên cứu Phương pháp chung Chỉ tiêu để đánh giá hoạt tính estrogen định lượng hàm lượng estradiol tự mẫu huyết tương hay huyết (test Elisa) (3),(1) khảo sát thay đổi trọng lượng tử cung (test Astwood)(7) Bên cạnh thay đổi thể trọng thuốc thử nghiệm trước sau uống thuốc ghi nhận Việc đánh giá thực địa: Động vật bình thường động vật bị giảm chức sinh dục (cắt bỏ noãn sào) Khảo sát thời điểm nghiên cứu Liều cho uống: qua tham khảo thử nghiệm cho thấy LD50 đường uống mầm Đậu nành chuột nhắt trắng 500 mg/kg, liều thử nghiệm chọn 10 mg/kg 50 mg/kg thể trọng Bột hòa nước cất dầu olive Liều uống thuốc đối chiếu 0,5 mg/kg thể trọng, pha dầu olive Tiến hành: Chuột chia thành lô, lô từ 10-15 Chuột bình thường Lơ chứng uống nước cất Lô thử uống bột mầm Đậu nành liều 50 mg/kg Lô đối chiếu uống Estradiol valerate Chuột gây giảm sinh dục tiến hành tương tự lô chuột bình thường, lơ thử có thêm liều 10 mg/kg Các chuột lô cho uống với thể tích 10 mg/kg/ml Thời gian cho uống 15 ngày vào buổi sáng trước cho ăn Sau thời gian thử nghiệm, tiến hành xác đinh tiêu sau: Hàm lượng estradiol huyết pg/ml (test Elisa) Trọng lượng tử cung tính g% (test Astwood) Kỹ thuật định lượng Estradiol test Elisa Nguyên tắc: Elisa kỹ thuật sinh hóa dựa nguyên lý tính đặc hiệu kháng nguyên (KN)-kháng thể (KT) dùng để phát kháng nguyên hay kháng thể (ở KN estrogen, KT KT estrogen đưa vào để phát nồng độ estrogen mẫu) thử nghiệm estrogen chuột nhắt estradiol Kỹ thuật định lượng estradiol dựa tương tác cạnh tranh estradiol liên hợp enzym-hormon số lượng giới hạn kháng thể kháng estradiol (trích tử thỏ) cố định sẵn giếng kit Do lượng gắn liên hợp enzym-hormon tỷ lệ nghịch với hàm lượng estradiol mẫu đo Sau ủ mẫu đo liên hợp enzym-hormon giếng kit, phần liên hợp enzym- hormon không gắn bị loại bỏ dung dịch rửa Sau cho chất màu xanh dương xuất màu chuyển sang màu vàng sau cho dung dịch dừng phản ứng Cường độ màu-đo hệ thống máy Elisa tự động-là tỷ lệ nghịch với hàm lượng estradiol mẫu (dựa theo đường cong chuẩn estradiol nồng độ tăng dần) Mẫu máu lấy đuôi chuột, vào buổi sáng, đem ly tâm, lấy phần huyết cho vào ống chứa sẵn EDTA, tiến hành bước cần thiết, đo máy Elisa bước sóng 450 nm 30 phút Trong báo cáo sử dụng phương pháp Elisa sandwich Phương pháp Astwood Tác động estrogen thuốc thử nghiệm đánh giá qua thay đổi trọng lượng tử cung Sau 15 ngày uống thuốc thử nghiệm lô chuột (lơ bình thường lơ cắt bỏ nỗn sào), tiến hành tách mổ tử cung, cân Tính trọng lượng trung bình tử cung theo g% Tính tốn kết Các số liệu biểu thị trị số trung bình M ± SEM (standard Error of the mean: sai số chuẩn giá trị trung bình) Và sử lý thống kê dựa vào phép kiểm T-test với P ≤ 0,05 phép kiểm ANOVA với P ≤ 0,05 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Xây dựng đường cong chuẩn estradiol Bảng Độ hấp thu estradiol chuẩn có nồng độ tăng dần Hàm lượng estradiol Độ hấp thu chuẩn (pg/ml) 2,583 25 1,862 100 1,282 250 0,701 500 0,318 1000 0,161 2000 0,115 Dựa vào bảng ta vẽ đồ thị, kết đo mẫu thử dựa đồ thị Khảo sát hàm lượng Estradiol lô thử nghiệm kỹ thuật Elisa Khảo sát thời điểm nghiên cứu Qua khảo sát cho thấy thời điểm thích hợp cho uống tuần kể từ cắt nỗn sào Khi hàm lượng estradiol nằm giới hạn bình thường chưa giảm đến tối thiểu (bảng 2) Bảng Hàm lượng estradiol chuột bình thường chuột cắt nỗn sào sau 2, tuần Lô P < 0,05 so với chuột bình thường Nhận xét chuột cho thấy hàm lượng estradiol sau lượng nghiệm N = 10-13 estradiol(pg/ml) Bình thường Kết thể bảng thửHàm 8,911 ± 1,045 Cắt noãn sào sau 29,223 ± 0,423 tuần 5,617 ± 1,082* tuần chuột cắt noãn sào Cắt noãn sào sau 32,830 ± 0,702* chuột bình thường khơng có tuần khác biệt đạt ý nghĩa thống kê Cắt noãn sào sau Sau tuần cắt noãn sào hàm lượng tuần estradiol giảm gần phân nửa, đạt ý nghĩa thống kê so với chuột bình thường Hàm lượng estradiol lô chuột bị gây giảm sinh dục Thử nghiệm tiến hành lơ chuột bình thường chuột giảm sinh dục, kết thể hình Hình Đồ thị biểu diễn hàm lượng estradiol lô chuột bị gây giảm sinh dục Nhận xét Hàm lượng estradiol lô chứng cắt noãn sào giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lơ chứng bình thường, chứng tỏ mơ hình nghiên cứu gây giảm sinh dục đạt Hàm lượng estradiol lô uống thuốc đối chiếu estradiol valerate liều 0,5 mg/kg cao so với hàm lượng estradiol lô chứng, đạt ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% Hàm lượng estradiol lô uống bột mầm Đậu nành liều 10 mg/kg cao so với hàm lượng estradiol lô chứng chưa đạt ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% Hàm lượng estradiol lô uống bột mầm Đậu nành liều 50 mg/kg cao so với hàm lượng estradiol lô chứng đạt ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% Do đó, sơ kết luận bột mầm Đậu nành liều uống 50 mg/kg sau 15 ngày có tác dụng phục hồi giảm hàm lượng estradiol chuột giảm sinh dục bị cắt noãn sào Hàm lượng estradiol lơ chuột bình thường Mục đích thử nghiệm nhằm khẳng định xem tác động gián tiếp bột mầm Đậu nành có làm gia tăng hàm lượng estradiol máu thú thử nghiệm bình thương hay khơng Kết thể hình Hình Đồ thị biểu diễn hàm lượng estradiol lơ chuột bình thường Nhận xét Hàm lượng estradiol lơ chuột bình thường uống thuốc đối chiếu estradiol valerate liều 0,5 mg/kg cao so với hàm lượng estradiol lô chứng, đạt ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% Hàm lượng estradiol lô uống bột mầm Đậu nành liều 50 mg/kg không khác đạt ý nghĩa thống kê so với hàm lượng estradiol lơ chứng Do đó, phối hợp với kết phần Chúng kết luận bột mầm Đậu nành liều uống 50 mg/kg sau 15 ngày có tác dụng phục hồi giảm hàm lượng estradiol chuột bị giảm sinh dục, khơng thể tác dụng kiểu estrogen chuột bình thường Khảo sát tác động estradiol tăng trọng Sự thay đổi trọng lượng thú thử nghiệm bình thường Kết thử nghiệm trình bày bảng Bảng Thay đổi (%) trọng lượng so với ban đầu chuột bị giảm sinh dục Trọng Lô thửLiều cholượng nghiệm uống so với N = 10-15 (mg/kg) ban đầu(%) 10,743 Chuột bình Chứng thường ± 2,762 Chuột cắt bỏ 35.037 Chứng ± 4.148# noãn sào 29.222 Bột mầm 10 ± Đậu nành 6.052 17.204 Bột mầm 50 ± Đậu nành 6.654* 2.974± ESTRADIO 0,5 2.091* L Nhận xét Thay đổi trọng lượng so với ban đầu (%) lơ chứng cắt nỗn sào tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường, chứng tỏ mơ hình nghiên cứu gây giảm sinh dục đạt Thay đổi trọng lượng so với ban đầu lô uống thuốc đối chiếu estradiol valerate liều 0,5 mg/kg nhỏ so thay đổi trọng lượng so với ban đầu lô chứng, đạt ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% Thay đổi trọng lượng so với ban đầu lô uống bột mầm Đậu nành liều 10 mg/kg thấp so với thay đổi trọng lượng so với ban đầu lô chứng chưa đạt ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% Thay đổi trọng lượng so với ban đầu lô uống bột mầm Đậu nành liều 50 mg/kg thấp so với thay đổi trọng lượng so với ban đầu lô chứng đạt ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% Do đó, sơ kết luận bột mầm Đậu nành liều uống 50 mg/kg sau 15 ngày có tác dụng giảm tăng trọng chuột giảm sinh dục bị cắt noãn sào Sự thay đổi trọng lượng so với ban đầu thú thử nghiệm bị giảm sinh dục Kết thử nghiệm trình bày bảng Bảng Thay đổi (%) trọng lượng so với ban đầu chuột bình thường Lơ thử Trọng lượng Liều cho nghiệm so với ban uống(mg/kg) đầu (%) N = 10-15 10,743 Chứng ± 2,762 Chuột Bột mầm 14.576 50 bình Đậu nành ± 2.061 thường 6.891 Estradiol 0,5 3.307 ± Nhận xét Thay đổi trọng lượng so với ban đầu (%) lơ chuột bình thường uống thuốc đối chiếu estradiol valerate liều 0,5 mg/kg thấp so với thay đổi trọng lượng so với ban đầu lô chứng, chưa đạt ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% Thay đổi trọng lượng so với ban đầu lô uống bột mầm Đậu nành liều 50 mg/kg không khác đạt ý nghĩa thống kê so với thay đổi trọng lượng so với ban đầu Kết hợp với kết bảng 3, kết luận bột mầm Đậu nành liều uống 50 mg/kg sau 15 ngày có tác dụng làm giảm trọng lượng thể chuột bị giảm sinh dục, khơng thể tác dụng chuột bình thường Khảo sát tác động estradiol phương pháp Astwood Trọng lượng tử cung thú thử nghiệm gây giảm sinh dục Kết thử nghiệm trình bày hình Hình Đồ thị biểu diễn thay đổi trọng lượng tử cung lô chuột gây giảm sinh dục Nhận xét Trọng lượng tử cung lơ chứng cắt nỗn sào giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường, chứng tỏ mơ hình nghiên cứu gây giảm sinh dục đạt Trọng lượng tử cung lô uống thuốc đối chiếu estradiol valerate liều 0,5 mg/kg cao so với trọng lượng tử cung lô chứng, đạt ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% Trọng lượng tử cung lô uống bột mầm Đậu nành liều 10mg/kg liều 50 mg/kg cao so với trọng lượng tử cung lô chứng đạt ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% Do đó, sơ kết luận bột mầm Đậu nành liều uống 10-50 mg/kg sau 15 ngày có tác dụng phục hồi giảm trọng lượng tử cung chuột giảm sinh dục bị cắt noãn sào Trọng lượng tử cung thú thử nghiệm bình thường Kết trình bày bảng Bảng Trọng lượng tử cung lơ chuột bình thường Lơ thử Liều choTrọng nghiệm uống N = 10-15 (mg/kg) Chuột lượng tử cung (g%) 0,064 ± Chứng 0,002 bình thường Bột mầm 0,142 50 Đậu nành 0,016* ± 0,502 ± Estradiol 0,5 0,021* * P < 0,05 so với lô chứng tương ứng Nhận xét - Trọng lượng tử cung lô uống thuốc đối chiếu Estradiol valerate liều 0,5 mg/kg cao so với trọng lượng tử cung lô chứng, đạt ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% - Trọng lượng tử cung lô uống bột mầm Đậu nành liều 50 mg/kg cao so với trọng lượng tử cung lô chứng đạt ý nghĩa thống kê độ tin cậy 95% Do đó, phối hợp với kết hình 3, chúng tơi kết luận bột mầm Đậu nành liều uống 10-50 mg/kg sau 15 ngày có tác dụng kiểu estrogen hai địa bình thường địa giảm sinh dục bị cắt noãn sào Tử cung chuột Tử cung chuột cắt Tử cung chuột Tử cung chuột cắt cắt noãn sào noãn sào uống cắt noãn sào noãn sào uống uống nước cất bột mầm Đậu uống estradiol nành 10 mg/kg 50 mg/kg Tử cung chuột Tử cung chuột Tử cung chuột bình bình thường bình thường uống thường uống thuốc uống nước cất bột mầm Đậu đối chiếu Estradiol nành 50 mg/kg bột mầm Đậu nành valerate Hình Hình minh họa khác biệt khối lượng tử cung chuột thử nghiệm với điều kiện thử khác KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua kết nghiên cứu trình bày đến kết luận sau: - Đây lần phương pháp Elisa dùng để đánh giá tác động invivo qua việc xác định hàm lượng estradiol sản sinh gián tiếp qua việc sử dụng bột mầm hạt Đậu nành Kết cho thấy hàm lượng estradiol huyết bột mầm hạt Đậu nành liều uống 50 mg/kg sau 15 ngày có tác dụng phục hồi giảm hàm lượng estradiol chuột bị giảm sinh dục, tác dụng kiểu estrogen chuột bình thường - Đối với thay đổi trọng lượng tử cung, bột mầm Đậu nành có tác dụng làm phát triển tử cung chuột bình thường chuột gây giảm sinh dục Tác dụng thể liều cho uống 10 mg/kg 50 mg/kg Bột mầm Đậu nành có tác dụng kiểu estrogen hai địa bình thường địa giảm sinh dục bị cắt noãn sào - Sơ kết luận bột mầm Đậu nành liều uống 50 mg/kg sau 15 ngày có tác dụng giảm tăng trọng chuột giảm sinh dục bị cắt nỗn sào Qua kết có thử nghiệm Elisa Atswood khẳng định bột mầm hạt Đậu nành có tác dụng phytoestrogen Kiến nghị Nếu đề tài tiếp tục, xin đề nghị thực tiếp phần sau: - Thực phần khảo sát hóa học cho dược liệu nghiên cứu bột sấy phun mầm Đậu nành Công ty nghiên cứu sản xuất Dược liệu miền Trung sản xuất - Chiết xuất chất chuẩn, xây dựng quy trình tiêu chuẩn hóa dược liệu - Sản xuất thành chế phẩm phục vụ nhu cầu hỗ trợ sức khỏe, trị bệnh,… ... định bột mầm hạt Đậu nành có tác dụng phytoestrogen Từ khóa: Hoạt tính estrogen, mầm hạt đậu nành, HRT, thử nghiệm ELISA, thử nghiệm Atswood, chuột bị giảm sinh dục, noãn sào chuột ABSTRACT ESTROGENIC-ACTIVITY... từ hạt Đậu nành có hoạt tính tạo hormon nữ, giúp cho hoạt động thể gắn vào thụ thể estrogen giúp thể sản sinh estradiol Tác động diện isoflavonoid có tên genistein (4),(5) Trong hạt Đậu nành. .. Trong nghiên cứu cho thấy enzym có hạt Đậu nành nảy mầm thúc đẩy tạo thành estradiol chuột thử nghiệm cắt bỏ hai noãn sào Kết thực nghiệm đánh giá test Elisa thử nghiệm Astwood ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG
