Đang tải... (xem toàn văn)
Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR xác định Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV) trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii)
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR XÁC ĐỊNH Macrobrachium rosenbergii NODAVIRUS (MrNV) VÀ EXTRA SMALL VIRUS (XSV) TRÊN TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: PHẠM DUY LÃM Thành Phố Hồ Chí Minh 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR XÁC ĐỊNH Macrobrachium rosenbergii NODAVIRUS (MrNV) VÀ EXTRA SMALL VIRUS (XSV) TRÊN TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS NGUYỄN VĂN HẢO PHẠM DUY LÃM Th.S NGƠ XN TUYẾN Thành Phố Hồ Chí Minh 8/2005 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường Đại Học Nông Lâm tận tình dạy sỗ, truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian em học trường Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Văn Hảo, người tận tình bảo, hướng dẫn giải đáp vấn đề khó khăn tạo điều kiện tốt để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Em xin cảm ơn Anh Ngô Xuân Tuyến, chị Trì Thanh Thảo, anh Cao Thành Trung, anh Chu Quang Trọng nhiệt tình hướng dẫn, trợ giúp em nguyên vật liệu, dụng cụ suốt thời gian em thực đề tài Em xin cảm ơn anh chị làm việc Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, phòng lab DNA TRung Tâm Chẩn Đoán YKhoa Hoà Hảo, anh chị Trại Thực Nghiệm Thủ Đức, quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài Bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, khoá luận không tránh khỏi khiếm khuyết định, mong giúp đỡ bảo ý kiến đóng góp quý thầy cô, anh chị bạn sinh viên Sau cùng, em xin cảm ơn gia đình bè bạn quan tâm, giúp đỡ, động viên em hoàn thành tốt đề tài TpHCM, tháng năm 2005 Sinh viên Phạm Duy Lãm iii TĨM TẮT Tơm xanh đối tƣợng nuôi quan trọng ngành nuôi trồng thủy sản Ở Châu Á tôm xanh đƣợc mở rộng tăng cƣờng nuôi với qui mô công nghiệp số nƣớc nhƣ Ấn Độ, Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan, nƣớc chiếm sản lƣợng lớn tôm xanh giới Sự mở rộng tăng cƣờng nuôi tôm xanh làm phát sinh nhiều bệnh Một bệnh đƣợc ghi nhận gần xuất bể ƣơng tôm xanh gây thiệt hại cho ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản Ấn Độ, sau xuất Đài Loan tỉnh thuộc Trung Quốc Bệnh có biểu trắng đuôi nên đƣợc gọi “bệnh trắng ” Tác nhân gây bệnh phức hợp hai loại virus Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) Extra small virus (XSV) Hiện nay, bể ƣơng tôm xanh Việt Nam xuất dấu hiệu lâm sàng trắng đi, bể có tỷ lệ chết cao Để xác định nguyên nhân gây chết bể ƣơng có phải MrNV XSV gây hay không Chúng tiến hành thử nghiệm qui trình Single - Step PCR Widada Sahul Hameed để xác định có hay khơng diện MrNV XSV mẫu bệnh nghi ngờ bệnh trắng Những kết thử nghiệm qui trình Single - Step PCR mà chúng tơi đạt đƣợc có kết nhƣ sau: Xác định đƣợc diện đồng thời MrNV XSV mẫu tôm thịt bệnh trắng đuôi đƣợc cung cấp từ Ấn Độ qui trình Single - Step RT - PCR Khảo sát đƣợc hai qui trình tách chiết AquaPure RNA Isolation Kit Trizol mẫu tôm thịt bệnh trắng Ấn Độ qui trình Single - StepRT - PCR Khảo sát đƣợc nồng độ mồi hai virus cho phản ứng Single - Step RTPCR 20 mol cho MrNV 20 mol cho XSV Khảo sát đƣợc nhiệt độ lai tối ƣu hai virus cho phản ứng Single - Step PCR 550C Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc 50 mẫu tôm xanh thu từ thực địa, kết phát đƣợc mẫu tôm mẹ, mẫu tôm postlarvae có diện đồng thời MrNV XSV mẫu tôm bệnh trắng đuôi iv ABSTRACT Freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) plays an economically important role in aquaculture However, The recent report of new disease in freshwater prawn hatcheries, this disease is responsible for mortalities in hatchery - reared Freshwater Prawn which losses aquaculture industry in India The disease was reported in Guadeloupe and Martinique (India) subsequently in the five provinces of China The clinical sign of disease is whitish appearance of the tail and has given rise to the name “White tail disease” Lately, scientists have been detected a nodavirus like particles from freshwater prawn suffering from White tail disease (WTD), named Macrobrachium rosenbergii nodavirus Subsequently a second virus - like particle, named XSV XSV has always been found associated with the MrNV Untill, The relationships between these two viruses remain unknown Although White tail disease (WTD) caused by Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and virus-like particle (XSV) which hasn’t reported in Viet Nam Therefore In this study, process of Single - Step RT - PCR of Widada and Sahul Hameed et al was use to identify whether this disease existed in Viet Nam To optimal of Single - Step RT-PCR of Widada and Sahul Hameed et al for the laboratory, positive control from India was used We experimented successful process of Single-Step RT-PCR of Widada and Sahul Hameed The suitable condition for a Single-Step RT-PCR RT-PCR reaction is 1,5 mM Mg2+, 20 mol primer and 550C annealing temperature Based on this method, 50 samples of freshwater prawn collected in the Thu Duc and other provinces in Mekong Delta were extracted RNA and amplified with two couples of primer MrNV-RNA2-F, MrNV-RNA2-R for MrNV and XSV-F, XSV-R for XSV Seven samples were confirmed to be infected by MrNV and XSV In short, MrNV and XSV have been detected in Viet Nam It is essential to carry out further studies to identify the outbreak conditions and to suggest the treatment methods so that the freshwater prawn farming can be developed v Mục lục Lời cảm ơn iii Abstract iv Tóm tắt v Mục lục vi Danh mục hình bảng ix Danh mục từ viết tắt x PHẦN LỜI MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT GIỐNG TƠM CÀNG XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 2.1.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm xanh giới 2.1.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tơm xanh Việt Nam 2.2 MỘT SỐ BỆNH TRÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH 2.2.1 Bệnh hoại tử 2.2.2 Bệnh chu kỳ ấu trùng 2.2.3 Bệnh hoại tử vi khuẩn 2.2.4 Bệnh phát sáng 2.2.5 Bệnh lột xác dính vỏ 2.2.6 Bệnh Protozoa 2.2.7 Bệnh virus 2.2.8 Bệnh trắng đuôi 2.3 NHỮNG PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG CHẨN ĐỐN BỆNH TRẮNG ĐI DO VIRUS GÂY RA TRÊN TÔM CÀNG 10 2.3.1 Phƣơng pháp mô học 10 2.3.2 Phƣơng pháp lai Dot-lot 10 2.3.3 Phƣơng pháp lai chỗ (in situ hybridization) 11 2.3.4 Phƣơng pháp Sandwich - ELISA (A sandwich enzyme linked immunosorbent assay) 12 2.3.5 Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 12 2.3.6 Phƣơng pháp RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Reaction) 15 vi PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 NỘI DUNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 18 3.2 VẬT LIỆU 18 3.2.1 Mẫu tôm 18 3.2.2 Mồi sử dụng cho qui trình 18 3.2.3 Hạt Bead RT - PCR: Ready - To - Go (Chế phẩm sử dụng ngay) 19 3.2.4 Bộ Kit AquaPure RNA Isolation Kit 19 3.2.5 Thang DNA X174 RF Hae III (Boehringer Mannheim) 20 3.2.6 Hoá chất khác 20 3.2.7 Dụng cụ thiết bị 21 3.3 PHƢƠNG PHÁP 21 3.3.1 Phƣơng pháp tách chiết RNA virus 21 3.3.1.1 Tách chiết RNA Trizol 21 3.3.1.2 Tách chiết AquaPure RNA Isolation kit (Bio-Rad) 22 3.3.2 Phƣơng pháp Single - Step RT - PCR RNA MrNV, XSV 22 3.3.3 Phƣơng pháp điện di nucleic acid gel agarose 23 3.4 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 24 3.4.1 Thử nghiệm qui trình Single - Step RT-PCR phát MrNV, XSV từ mẫu tôm bệnh (chứng dƣơng) đƣợc cung cấp từ Ấn Độ 24 3.4.2 Khảo sát số điều kiện qui trình Single - Step RT-PCR 24 3.4.2.1 So sánh hai qui trình tách chiết RNA Trizol (Peter Walker) AquaPure RNA Isolation Kit (Bio-Rad) 24 3.4.2.2 Khảo sát nồng độ mồi 25 3.4.2.3 Khảo sát nhiệt độ lai mồi 25 3.4.3 Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc kiểm tra số mẫu tôm xanh thu thực địa 25 vii PHẦN KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ MẪU TÔM BỆNH ĐƢỢC CUNG CẤP TỪ ẤN ĐỘ 26 4.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN CỦA QUI TRÌNH SINGLE STEP RT - PCR 27 4.2.1 Kết so sánh hai qui trình tách chiết 27 4.2.2 Kết khảo sát nồng độ mồi 30 4.2.3 Kết khảo sát nhiệt độ lai mồi 30 4.3 KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH KHẢO SÁT ĐƢỢC KIỂM TRA MỘT SỐ MẪU TÔM CÀNG XANH THU THỰC ĐỊA 32 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 36 5.2 Tồn 36 5.3 Đề xuất 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 38 Tiếng nƣớc 39 viii Danh mục hình bảng Hình 2.1: Biểu bệnh trắng tơm xanh Hình 2.2: Vị trí MrNV họ gia đình Nodavirus Hình 2.3: Lai chỗ cách sử dụng probes MrNV 11 Hình 2.4: Phƣơng pháp Single - Step RT - PCR để khuếch đại RNA PCR 17 Hình 4.1: Kết điện di sản phẩm khuếch đại từ mẫu tôm xanh nhiễm MrNV, XSV 26 Hình 4.2: Kết điện di sản phẩm RT - PCR từ mẫu chứng dƣơng đƣợc tách Kit Trizol 28 Hình 4.3: Kết điện di sản phẩm RT-PCR từ mẫu chứng dƣơng nồng độ mồi khác 29 Hình 4.4: Kết điện di khảo sát nhiệt độ lai mồi hai virus MrNV, XSV 30 Hình 4.5: Kết điện di phát MrNV XSV số mẫu tơm xanh 33 Hình 4.6: Kết điện di mẫu tôm mẹ thu Trại Thực Nghiệm Thủ Đức 34 Biểu đồ 2.1: Số lƣợng trại giống sản lƣợng tôm xanh ĐBSCL từ 1999 - 2003 .4 Bảng 3.1: Các mồi sử dụng cho phản ứng RT- PCR 18 Bảng 3.2: Thang DNA X174 RF Hae III 20 Bảng 3.3: Thành phần hai Mix sử dụng Single - Step RT - PCR 22 Bảng 3.4: Bảng khảo sát nhiệt độ lai mồi 25 Bảng 3.5: Các loại mẫu tôm xanh thu giai đoạn khác 25 Bảng 4.1: Kết điện di sản phẩm RT - PCR đƣợc tách chiết Kit Trizol 28 Bảng 4.2: Kết biểu tín hiệu sản phẩm hai dãy nhiệt độ 31 Bảng 4.3: Kết thực phản ứng RT - PCR 50 mẫu tôm xanh 35 ix Danh mục từ viết tắt DNA: Deoxyribonucleic acid ss-DNA: Single strand - Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid mRNA: Messenger ribonucleic acid cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid Bp: Base pair (cặp base) dATP: 2’-deoxyadenosine-5’-triophosphate dCTP: 2’-deoxycytosine-5’-triophosphate dGTP: 2’-deoxyguanine-5’-triophosphate dTTP: 2’-deoxythymine-5’-triophosphate UV: Ultra Violet- tia cực tím TE: Tris-EDTA DIG: Digoxigenin DEPC: Diethyl Prycacbonat ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long FAO: Food and Agrculture Organization NoV: Nodamura virus BoV: Boolaara virus AhNNV: Atlantic halibut nervous necrosis virus GGNNV: Greasy grouper nerous necrosis virus SJNNV: Striped jack nervous necrosis virus PaV: Pariacoto virus MrNV: Macrobrachium rosenbergii nodavirus XSV: Extra small virus PCR: Polymerase Chain Reaction RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Reaction RFLP: Restriction fragment lenght polymorphism S - ELISA: A sandwich enzyme linked immunosorbent assay Tm: Nhiệt độ lai mồi x 30 Phƣơng pháp Trizol phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số phƣơng pháp đơn giản tốn thời gian, hố chất tƣ pha Lƣợng RNA thu đƣợc dễ bị lẫn phenol tạp chất khác trình tách chiết thao tác khơng cẩn thận, phƣơng pháp Trizol sử dụng phenol chloroform, hai chất độc ngƣời tách chiết Hoá chất Trizol tự pha nên sai sót q trình pha, nhƣ việc hút phenol khơng cách, khơng đủ thể tích, cân khơng đủ lƣợng, dễ nhiễm RNAase, vi sinh vật Các yếu tố ảnh hƣởng lớn đến trình tách chiết Phƣơng pháp tách chiết theo Kit đòi hỏi theo điều kiện tách chiết Kit, hoá chất sử dụng Kit tuân theo qui trình sản xuất nghiêm ngặt, không nhiễm RNAase, vi sinh vật nên lƣợng RNA thu đƣợc nhiều không gãy vụn, sử dụng phenol chloroform nên khơng độc ngƣời tách chiết Trong q trình tách chiết khơng bị lẫn tạp chất nhiều Tuy nhiên tách chiết phải ủ đá suốt trình tách chiết Nếu thực thời gian dài lƣợng đá phải đƣợc bổ sung, công việc làm ngắt quảng trình tách chiết làm thời gian Nhƣ vậy, qua hai q trình tách chiết từ mẫu tơm bệnh đƣợc cung cấp từ Ấn Độ Chúng nhận thấy dịch tách chiết mẫu tôm thịt bị nhiễm bệnh tồn hai virus MrNV XSV 4.2.2 Kết khảo sát nồng độ mồi Tiến hành pha lỗng mồi từ ống gốc có nồng độ 30 mol theo dãy sau: 10 mol, 15 mol, 20 mol, 25 mol, 30 mol Sau lần lặp lại thí nghiệm, kết tƣơng đối giống nhau, khơng có thay đổi đáng kể Hình 4.3 hình đại diện cho lần lặp lại thứ Tiến hành 10 phản ứng Single - Step RT - PCR mẫu RNA mẫu chứng dƣơng nồng độ pha loãng khác với kết nhƣ sau: 31 10 15 20 25 30 M 10 10 A 15 20 25 30 M B Hình 4.3: Kết điện di sản phẩm RT - PCR từ mẫu chứng dƣơng nồng độ mồi khác Hình A: dãy khảo sát nồng độ MrNV Hình B: dãy khảo sát nồng độ XSV (-): mẫu chứng âm Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III Ở Hình A, nhận thấy nồng độ 20 mol vạch sản phẩm có độ sáng rõ đậm gần tƣơng đồng với nồng độ 25 mol, nồng độ 30 mol vạch sản phẩm có tƣợng smear nhiều chứng tỏ lƣợng mồi thừa để tiết kiệm mồi mà phát đƣợc MrNV nên chọn nồng độ 20 mol Ở Hình B, nồng độ 20 mol có vạch sản phẩm gần nồng 25 mol nhƣng yếu 30 mol Vậy để tiết kiệm lƣợng mồi mà phát đƣợc XSV nên chúng tơi chọn nồng độ 20 mol 4.2.3 Kết khảo sát nhiệt lai mồi Trƣớc tiến hành khảo sát hai dãy nhiệt độ MrNV, XSV lựa chọn mẫu chứng dƣơng tách chiết theo Kit để khảo sát Kết thu đƣợc nhƣ sau: 11 12 32 540 550 560 570 580 M 540 550 560 570 580 A B MrNV XSV Hình 4.4: Kết điện di khảo sát nhiệt lai mồi hai virus MrNV, XSV Phần A: dãy khảo sát nhiệt độ XSV Phần B: dãy khảo sát nhiệt độ MrNV (-): mẫu chứng âm Bảng 4.2: Kết biểu tín hiệu sản phẩm hai dãy nhiệt độ Nhiệt độ 540C 550C 560C 570C 580C Tín hiệu sản phẩm ++ +++++ +++ ++ ++ ++ ++++ + + +++ (MrNV) Tín hiệu sản phẩm (XSV) (+): biểu mức độ sáng sản phẩm Để dễ đánh giá mức độ sáng sản phẩm, dùng ký hiệu dấu cộng, quan sát từ điện di ta thấy tín hiệu sản phẩm tối ƣu MrNV nhiệt độ 550C có độ sáng cao tín hiệu sản phẩm tối ƣu XSV nhiệt độ 550C , nên cho ký hiệu năm dấu cộng để biểu mức độ sáng tối ƣu MrNV bốn dấu cộng để biểu mức độ sáng tối ƣu XSV Cứ lần lƣợt nhƣ thế, tùy theo mức độ sáng sản phẩm mà ta ký hiệu dấu cộng nhiều hay Ở dựa vào độ sáng tƣơng đồng để ký hiệu theo bảng Dựa vào kết khảo sát dãy nhiệt độ MrNV, nhận thấy khơng có thay đổi lớn tín hiệu sáng sản phẩm, từ nhiệt độ 540C -> 580C, ngồi nhiệt độ 550C tối ƣu nhất, thấy nhiệt độ 560C sáng so với nhiệt độ lại Ngƣợc lại với dãy nhiệt độ MrNV dãy nhiệt độ XSV có thay đổi lớn tín hiệu sáng sản phẩm nhiệt độ, từ 540C -> 580C, nhiệt độ 33 550C tối ƣu nhất, thấy nhiệt độ 580C sáng so với nhiệt độ cịn lại Từ nhận xét đó, ta thấy từ nhiệt độ tối ƣu 55 0C tăng 10C (550C - 560C) dãy khảo sát MrNV tín hiệu sản phẩm sáng 560C so với nhiệt độ lại , dãy nhiệt độ XSV tăng lên đến 30C (550C - 580C) thấy 580C sáng so với nhiệt độ lại trừ nhiệt độ 550C Điều cho thấy hai dãy nhiệt độ MrNV XSV tỷ lệ nghịch tín hiệu sáng sản phẩm Điều thuận lợi để phát triển kỹ thuật multiplex So sánh hai dãy nhiệt độ MrNV XSV cặp nhiệt độ 560C, ta thấy có tƣơng quan ngƣợc rõ rệt hai tín hiệu sản phẩm nhiệt độ 560C, tín hiệu sản phẩm MrNV sáng nhiều so tín hiệu sản phẩm XSV Ngoài trừ cặp nhiệt độ 550C tối ƣu tất cặp nhiệt độ không cho sản phẩm tối ƣu Điều thuận lợi để phát triển kỹ thuật multiplex Nhƣ vậy, nhiệt độ 550C theo qui trình Single - Step RT - PCR tối ƣu cho hai mồi MrNV XSV 4.3 KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR KHẢO SÁT ĐƢỢC PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ NHỮNG MẪU TÔM THU THỰC ĐỊA Dựa qui trình khảo sát đƣợc, chúng tơi tiến hành khảo sát 50 mẫu tôm xanh thu từ Trại Thực nghiệm Thủ Đức mẫu tôm mẹ thu ĐBSCL Chúng tiến hành khảo sát mẫu tôm mẹ thu ĐBSCL mẫu tôm postlarvae nghi bệnh trắng đuôi trƣớc Kết hình 4.5 34 M 10 11 A MrNV M 10 11 B XSV 4.5: Kết điện di phát MrNV XSV số mẫu tôm xanh Hình A: kết điện di phát MrNV Hình B: Kết điện di phát XSV Giếng 1, , 4, 6, 7, 8: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm mẹ nhiễm MrNV XSV Giếng 9: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm postlarvae nhiễm MrNV XSV Giếng 5: âm tính Giếng 3: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm mẹ nhiễm MrNV Giếng 10: mẫu chứng dƣơng Giếng 11: mẫu chứng âm (H20 - DEPC) Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III Kết thu đƣợc mẫu tôm mẹ dƣơng tính thu ĐBSCL mẫu postlarvae dƣơng tính thu Trại Thực Nghiệm Thủ Đức Trong có mẫu bệnh nặng nhiễm đồng thời virus MrNV XSV giếng 1, 2, 4, 7, mẫu bệnh mức độ trung bình nhiễm đồng thời MrNV XSV giếng 6, mẫu bệnh mức độ nhẹ nhiễm MrNV giếng 35 Tiếp tục khảo sát 40 mẫu tơm xanh cịn lại Các mẫu khơng thấy có biểu bệnh trắng M 10 11 12 MrNV M 10 11 12 XSV 4.6: Kết điện di mẫu tôm mẹ thu Trại Thực Nghiệm Thủ Đức (hình đại diện 10 mẫu) Giếng :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 âm tính Giếng 11: mẫu chứng dƣơng Giếng 12: mẫu chứng âm (H20 - DEPC) Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III Kết điện di 40 mẫu âm tính nhiên 10 mẫu tôm mẹ mà thu khơng có mẫu tơm mẹ sinh đàn postlarvae bệnh trắng đi, nên chƣa thể xác định có lây bệnh từ tôm mẹ cho đàn ấu trùng hay không Chúng tiến hành phản ứng Single - Step PCR 50 mẫu tôm xanh giai đoạn ấu trùng, tơm postlarvae, tơm mẹ có đƣợc kết nhƣ sau: 36 Bản g 4.3: Kết thực phản ứng RTPCR 50 Kết MrNV XSV - Ký hiệu mẫu Giai đoạn Địa điểm thu -> 30 Ấu trùng Trại Thực Nghiệm TĐ 31 Postlarvae Trại Thực Nghiệm TĐ - - 32 Postlarvae Trại Thực Nghiệm TĐ +++ +++ 33-> 42 Tôm mẹ Trại Thực Nghiệm TĐ - - 43 Tôm mẹ ĐBSCL +++ +++ 44 Tôm mẹ ĐBSCL +++ +++ 45 Tôm mẹ ĐBSCL + - 46 Tôm mẹ ĐBSCL +++ +++ 47 Tôm mẹ ĐBSCL - - 48 Tôm mẹ ĐBSCL ++ + 49 Tôm mẹ ĐBSCL +++ + 50 Tôm mẹ ĐBSCL ++ ++ mẫu tôm xanh (+) : biểu mức độ nhiễm bệnh trắng 37 Tóm lại 50 mẫu mà chúng tơi thực có mẫu tôm nhiễm đồng thời MrNV, XSV mẫu tơm nhiễm MrNV (giếng 3, hình 4.5) Ở mẫu ta thấy có diện MrNV khơng có diện XSV Ở đƣa hai lý đƣợc cho thích hợp để giải thích kết này, theo Widada Bonami (2004), XSV sử dụng RNA Polymerase MrNV nên phụ thuộc vào khả chép MrNV nhiều, mẫu ta thấy sản phẩm khuếch đại MrNV yếu chứng tỏ lƣợng RNA không đủ nhiều, điều chứng tỏ diện MrNV mẫu bệnh không cao, XSV sử dụng RNA Polymerase MrNV nên lƣợng RNA XSV lƣợng RNA MrNV nhiều nên không đủ sản phẩm khuếch đại đủ để thấy bảng điện di Hoặc thao tác tách chiết không đƣợc tốt nên phát MrNV mẫu bệnh Tuy nhiên kết giải thích cho mẫu bệnh mối quan hệ MrNV XSV chƣa đƣợc biết nên cần phải có nhiều mẫu bệnh khẳng định đƣợc hai lý có hợp lý hay không 38 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Cả hai phƣơng pháp tách chiết Kit Trizol cho kết tƣơng thích Phát đƣợc diện đồng thời MrNV, XSV nhiễm mẫu tôm mẹ bệnh trắng đuôi thu ĐBSCL mẫu tôm postlarvae thu Trại Thực Nghiệm Thủ Đức Thử nghiệm thành công kỹ thuật Single - Step RT - PCR Widada, Sahul Hameed cộng với điều kiện hoá chất Trung Tâm Quốc Gia Quan Cảnh Báo Mơi Trƣờng Phịng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II: Nồng độ Mg2+ 1,5 mM Nồng độ mồi 20 mol cho MrNV 20 mol cho XSV Nhiệt độ lai 550C Ngoài chúng tơi có thử nhiệt độ lai tạo cDNA 460C thử nồng độ Mg2+ mM Thì thấy nồng độ Mg2+ mM làm cho Taq - polymerase hoạt động mạnh tạo sản phẩm không chuyên biệt sản phẩm khơng thấy rõ, cịn nhiệt độ lai tạo cDNA 460C thấy sản phẩm không đặc hiệu, nhiệt độ lai không làm cho mồi bắt cặp với RNA không chuyên biệt Do nhiệt độ lai tạo cDNA nồng độ Mg2+ nhân tố quan trọng cần đƣợc khảo sát thêm phản ứng chƣa đạt tối ƣu Trong trình thực phản ứng RT - PCR phát tần xuất diện MrNV XSV mẫu tôm bệnh trắng đuôi cao Có thể khẳng định có hai virus gây bệnh trắng đuôi tôm xuất Việt Nam 5.2 Tồn Chƣa xác định đƣợc có hay khơng lây nhiễm từ tơm mẹ bị bệnh trắng đuôi cho đàn ấu trùng Chƣa phát đƣợc diện hai virus MrNV XSV giai đoạn ấu trùng tôm xanh 39 Số lƣợng mẫu bệnh nên chƣa thể khẳng định tần xuất diện MrNV XSV mẫu tôm bệnh trắng đuôi cao hay không 5.3 Đề xuất Trong phạm vi đề tài, thu đƣợc số kết định mở số vấn đề nghiên cứu sâu Do chúng tơi có số đề nghị: Phát triển kỹ thuật multiplex để phát đồng thời hai virus MrNV XSV Ở nhiệt độ 550C nhiệt độ lai tối ƣu cho hai virus, điều thuận lợi phát triển kỹ thuật multiplex Tuy nhiên sử dụng nhiệt độ tối ƣu cho hai virus có tƣợng cạnh tranh mồi Vì tơi đề nghị cần khảo sát dãy nhiệt độ lai lớn để tìm nhiệt độ lai tối ƣu riêng virus, nhiệt độ lai tối ƣu MrNV có mồi MrNV bắt cặp, nhiệt độ lai tối ƣu XSV có mồi XSV bắt cặp Sau đƣa thêm nhiệt độ lai tối ƣu mồi MrNV chu kỳ, nhiệt độ lai tối ƣu mồi XSV chu kỳ Mục đích việc phát kỹ thuật multiplex để tránh tƣợng cạnh tranh hai cặp mồi, thành công so sánh hai phƣơng pháp, phƣơng pháp sử dụng nhiệt độ tối ƣu chung cho hai virus 550C phƣơng pháp sử dụng nhiệt độ lai tối ƣu mồi, để xác định phƣơng pháp tối ƣu cho việc phát đồng thời MrNV XSV Cần phải có cảm nhiễm tôm xanh giai đoạn khác để xem virus xuất nhiều giai đoạn Cảm nhiễm tôm mẹ, sau lấy chân bơi tơm mẹ để kiểm tra qui trình Single - Step RT - PCR để xác định có diện virus hay không, tôm mẹ bị nhiễm, ta cho tôm mẹ đẻ đàn ấu trùng, sau kiểm tra đàn ấu trùng xem có diện virus hay không Cần tách riêng hai virus MrNV XSV, sau thực hai lơ thí nghiệm, lơ cảm nhiễm MrNV lô cảm nhiễm đồng thời hai virus MrNV XSV, thí nghiệm đƣợc tiến hành tơm thịt Việc tiến hành thí nghiệm với mục đích xác định vai trò XSV nhƣ bệnh trắng Cần có bƣớc giải trình tự hai virus MrNV XSV từ sản phẩm PCR để so sánh với mẫu chứng dƣơng từ Ấn Độ, để xác định hai virus Việt Nam có đột biến hay giống hoàn toàn với sản phẩm PCR từ mẫu đối chứng dƣơng từ Ấn Độ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998 Sinh học phân tử NXB Giáo Dục Trần Ngọc Hải ctv, 2000 Hiện trạng triển vọng giải pháp phát triển sản xuất giống tôm xanh Đồng Bằng Sông Cửu Long Viện Hải Sản, Đại Học Cần Thơ Trần Thanh Phục, 2001 Cải tiến công nghệ sản xuất, hạ giá thành giống tôm xanh Macrobrachium rosenbergii de man Đồng Bằng Sông Cửu Long BCKH 50 trang Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2000 Kỹ thuật sản xuất giống tôm xanh NXB Nông nghiệp 67 trang Nguyễn Việt Thắng, 1993 Một số đặc điểm sinh học ứng dụng quy trình sản xuất giống tơm xanh Macrobrachium rosenbergii de man (1879) đồng Nam Bộ Luận án PTS khoa học Nông Nghiệp.Trƣờng Đại Học Thủy Sản Nha Trang 175 trang Nguyễn Việt Thắng, 1997 Đặc điểm sinh học kỹ thuật sản xuất giống tôm xanh Đồng Bằng Nam Bộ BCKH Bùi Trang Việt, 2002 Sinh học phân tử ĐH Quốc gia TPHCM Khoa Sinh Học - Trƣờng ĐHKHTN.144 trang Báo Cáo Hội Thảo, 1999 Phát triển nuôi tôm xanh Đồng Bằng Nam Bộ An Giang, 5/1999 Bộ Thủy Sản, 2004 Tuyển tập hội Thảo toàn quốc Về Nghiên Cứu Và ứng Dụng Khoa Học Công Nghệ Trong Nuôi Trồng Thủy Sản NXB Nông Nghiệp 41 TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 10 Akiyama D.M , Brock J.A and Haley S.R , 1982 Idiopathic Muscle Necrosis in the fresh prawn, Macrobrachium rosenbergii de man Veterinary Medicine, Small Clinician: 1119 – 1121 11 Anderson I.G., Nash and M Shariff.,1990 Mass larval mortalities in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii De Man, cultured in Malaysian modified static “green water” systems Jounal of Fish Diseases 13: 127 – 134 12 Aquacop , 1977 Macrobrachium rosenbergii De Man Culture Polynesia: progress in the developing a mass intensive larval rearing technique in clear water Proceedings of the World Mariculture Society 8: 311 - 326 13 Arcier J.M., Herman F., Lightner D.V., Redman R , Mari J , Bonami, J.R , 1999 A viral disease associated with mortalities in the hatchery - reared postlarvae of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii Dis Aquat Org 38: 177 - 181 14 Ban N , Larson S B and McPherson A (1995) Structural comparison of the plant satellite viruses Virology 214: 571 - 583 15 Bespalova I.N , Adkins S and Burmeidter M , 1998 3’- Race Skewed Ratio of specific to general PCR primers improves yield and specificity Biotechniques 24: 375 - 577 16 Bonami J.R , Shi Z , Qian D and Widada J.S , 2005 White tail disease of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: separation of the associated virions and characterization of MrNV as a new of nodavirus Journal of Fish Disease 28 (1): 23 – 32 17 Brock J.A , 1983 Diseases (infectious and non-infectious), metazoan parasites, predators and public health considerations in Macrobrachium culture and fisheries CRC Handbook of Mariculture 42 18 Brock J.A , 1988 Diseases and husbandry problems of cultured Macrobrachium rosenbergii Disease Diagnosis and Control in North American Marin Aquaculture (C.J Sidermann , and D.U Lightner ) p 134 - 180 19 Dieffenbach C.W and Dveksler G.S , 1995 PCR primer: A laboratory manual Molecular cloning (J Sambrookp and D W Russell) Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Habor, New York p 133 - 142 20 Forhman , 1995 Rapid amplification of cDNA ends In PCR primer: A Laboratory manual Molecular cloning (J Sambrookp and D W Russell) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.p.381- 409 21 Johnson S.K , 1982 Diseases of Macrobrachium In:Giant Prawn Farming Developments in Aquaculture and Fisheries Science (M.B New ),Vol.10 p.269 - 277 22 Lee C.C and Caskey C.T., 1990 cDNA cloning using degenerate primers In PCR protocols: A guide to methods and applications ( M.A Innis et al) p 46 - 53 Academic Press, SanDiego, California 23 Lightner D.V , 1993 Diseases of culture penaeid shrimp Handbook of Marine culture, (J.P Mevei ), vol , Crustacean Aquaculture 24 Mori K.I , Nakai T , Muroga , Arimoto M , Musiake.K and Furusawa I , 1992 Properties of a new virus belonging to Nodaviridae found in larval striped jack (Pseudocarnx dentex) with nervous necrosis Virology 187: 368 - 371 25 Nash G , S.Chinabut and Limsuwan C., 1987 Idiopathic Muscle Necrosis in the fresh prawn, Macrobrachium rosenbergii de man, Cultured in Thailand.Jounal of Fish Diseases 10: 109 - 120 26 Qian D , Shi Z , Zhang S , Cao Z , Liu W , Li L , Xie Y , Cambournac I and Bonami J R , 2003 Extra small virus-like particles (XSV) and nodavirus associated with whitish muscle disease in the giant fresh water prawn Macrobrachium rosenbergii Journal of Fish Disease 26:521 - 527 27 Roegge M.A , Rutle W.P and Guest W.C , 1979 Chemical control of Zoothamnium on larval Macrobrachium acanthurus In: Proceedings of the Second 43 28 Biennial Crustacean Health Workshop (ed D.H Lewis and J.K Leong) p 295-299 TAMU - SG - 117, College Station, Texas 29 Romestand B , and Bonami J.R , 2003 A sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (S - ELISA) for detection of MrNV in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man) Journal of fish Diseases 26: 71 - 75 30 Sahul Hameed A.S , 2003 Studies on white tail disease of Macrobrachium rosenbergii In Freshwater Prawns 2003, International Symposium, Cochin, 20 - 23 August 2003 31 Sahul Hameed A.S ,Yoganandhan K , Widada J.S , Bonami J.R , 2004 Experimental transmission and tissue tropsim of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus like-particles in Macrobrachium rosenbergii Dis Aquat Org 62: 191 - 196 32 Salin K.R and Nair C.M , 2003 Emerging diseases of giant freshwater prawn in India - a potential threat to sustainability In the In Freshwater Prawns 2003, International Symposium, Cochin , 20 - 23 August 2003 33 Sahul Hameed A.S , Yoganandhan K , Widada J.S and Bonami J.S , 2004a Studies on the occurrence of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus - like (XSV) associated with white tail disease (WTD) of Macrobrachium rosenbergii in India by RT - PCR detection Aquaculture 238: 127 - 133 34 Schaefer B.C , 1995 Revolution in Rapid amplification of cDNA ends: New strategies for polymerase chain reaction cloning of full-length ends Anal, Biochem 227: 255 - 273 35 Tonguthai Kamonporn., 1997 Diseases of Fresh Prawn, Macrobrachium rosenbergii The AAHRI Newsletter Article, Vol.4, No.2, December 1997 Bangkok 10900, Thailand 36 Tung C W , Wang C S and Chen S N , 1999 Histological and electron microscopy study on Macrobrachium 37 Muscle virus (MMV) infection in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man), cultured in Taiwan Journal of Fish Disease 22 : - 44 42 Tung C.W., Wang CS and Chen S.N , 1999 Histologiacal and electron microscopic study on Macrobrachium muscle virus (MMV) infection in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de man), cultures in Taiwan Jounal of Fish Diseases 22: 319 - 324 43 Van Regenmortel M.H.V , Fauquer C.M , Bishop D.H.L , Cartens E.B , Estes M.K , Lemon S.M , Maniloff J , Mayo M.A , McGeoch D.J , Pringle C.R and Wickner R.B , 2000 Virus taxaonomy:Classifisstion and Nomenclature of Viruses Seventh Report of International Committee on Taxonomy of Viruses Academic Press, San Diego, CA 44 Vijayan K.K , Raj V.S , Alavandi S.V , Sekhar V.T , Vaseeharan.B and Santiago T.C , 2003 Need of novel diagnotics in the health management of Macrobrachium rosenbergii, with special reference to an emerging epizootic in India, the white muscle syndrome (WMS) In Freshwater Prawns 2003 45 Walker P.J , 2003 Molecular characteristic of Yellow head Virus (YHV) and White Spot Syndrome Virus CSIRO Tropical Agriculture, Private Bag 3, Indooroopilly, Qld 4068, Australia 46 Widada J.S , Durand S , Cambournac , Qian D , Shi Z , Dejonghe E , Richard V , Bonami J.R , 2003 Genome - based detection methods of Macrobrachium rosenbergii nodavirus, a pathogen of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: dot - blot, in situ hybridization and RT PCR Jounal of Fish Diseases 26 : 583 - 590 47 Widada J.S , Richard V , Shi Z , Qian D and Bonami J.R , 2004 Dot lot hybridization and RT - PCR detection of extra small virus (XSV) associated with white tail disease of prawn Macrobrachium rosenbergii Disease of Aquatic Organism 58: 83 - 87 48 Yoganandhan K , Widada J.S , Bonami J.R and Sahul Hameed A.S , 2005 Simultaneous detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus and extra small virus by a single tube, one - step multiplex RT - PCR assay Journal of Fish Disease 28: 65 - 69 ... Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) Extra small virus (XSV) tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) ” với: Mục đích Xác định diện hai loại virus MrNV XSV tôm xanh kỹ thuật RT- PCR Nội dung nghiên cứu... sử dụng cho phản ứng Single - Step RT - PCR Virus MrNV XSV Primer Trình tự MrNV-RNA2-F 5’-GATACAGATCCACTAGATGACC-3’ MrNV-RNA2-R 5’-GACGATAGCTCTGATAATCC-3’ XSV-F 5’-GGAGAACCATGAGATCACG-3’ XSV-R... DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT- PCR XÁC ĐỊNH Macrobrachium rosenbergii NODAVIRUS (MrNV) VÀ EXTRA SMALL
