Đang tải... (xem toàn văn)
Phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan bằng phương pháp PCR
1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ٭٭٭000٭٭٭ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ٭٭٭000٭٭٭ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS LÊ ĐÌNH ĐƠN NGUYỄN THỊ THANH HÀ KS DƢƠNG THÀNH LAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY HO CHI MINH CITY DEPARMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** TO FIND BACTERIUM: Erwinia carotovora subsp carotovora ON THE Cymbidium BY THE PCR Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: PhD LE DINH DON NGUYEN THI THANH HA BSc DUONG THANH LAM Term:2002 – 2006 Ho Chi Minh City 8/2006 LỜI CẢM TẠ Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, nhận đƣợc nhiều ủng hộ giúp đỡ từ gia đình, thầy bạn bè Nay xin chân thành cảm ơn đến: Cha mẹ ngƣời thân tạo điều kiện, động viên suốt trình học tập trƣờng Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Mơn Công Nghệ Sinh Học tất thầy cô tận tình giúp đỡ, dạy dỗ, truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học trƣờng Thầy Lê Đình Đơn hết lịng hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực tập tốt nghiệp Thầy Dƣơng Thành Lam tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ suốt thời gian thực tập tốt nghiệp Anh Nguyễn Văn Lẫm, anh chị làm việc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, anh chị làm việc Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật khoa Nông Học trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khóa luận Các bạn sinh viên lớp công nghệ sinh học 28 động viên, giúp đỡ suốt thời gian học làm đề tài tốt nghiệp TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2006 Nguyễn Thị Thanh Hà TÓM TẮT KHĨA LUẬN NGUYỄN THỊ THANH HÀ, Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh.Tháng năm 2006 “PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR” Giáo viên hƣớng dẫn: Thầy Lê Đình Đơn Thầy Dƣơng Thành Lam Địa điểm: Phịng Thí Nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học Thực Vật – Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh - Trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Đối tƣợng nghiên cứu: vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora địa lan (Cymbidium) Hiện nay, vƣờn địa lan thành phố Đà Lạt bị thiệt hại lớn bệnh thối làm chết gây Cho đến thời điểm ngƣời ta chƣa xác định xác tác nhân gây bệnh chƣa có loại thuốc đặc trị hữu hiệu Do đó, việc tìm hiểu phƣơng pháp chẩn đoán, phát tác nhân gây bệnh cần thiết giúp xây dựng quy trình phịng trừ bệnh hiệu Nội dung nghiên cứu bao gồm: Điều tra tình hình bệnh hại địa lan số vƣờn trồng địa lan địa bàn TP Đà Lạt – Lâm Đồng Phân lập mẫu vi khuẩn chủng bệnh lên củ khoai tây địa lan Nhân sinh khối dòng vi khuẩn phân lập đƣợc Khuếch đại đoạn DNA nằm vùng 16S/23S rDNA vùng gen pel mã hóa pectate lyase vi khuẩn phƣơng pháp PCR Kết đạt đƣợc: Tỷ lệ nhiễm bệnh vƣờn điều tra: - Bệnh vi khuẩn: 20,17% - Bệnh virus: 9,5% - Bệnh nấm: 11,6% Phân lập đƣợc dịng vi khuẩn có màu khuẩn lạc đặc trƣng: - Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, trịn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc trịn nhẵn - Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc trịn nhẵn Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây địa lan: - Trên củ khoai tây: dòng vi khuẩn có khả gây bệnh mạnh sau 48 chủng bệnh (ở nhiệt độ phòng) - Trên địa lan: hầu nhƣ dịng vi khuẩn khơng gây bệnh sau chủng bệnh 10 ngày (ở 250C), có dịng EC06-8 gây bệnh Khuếch đại đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc 1,5 kb nằm vùng 16S/23S rDNA dòng vi khuẩn phân lập đƣợc MỤC LỤC Phần Trang Trang tựa ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách hình x Danh sách bảng xi PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.2.3 Giới hạn PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Điều kiện tự nhiên TP Đà Lạt với việc nuôi trồng Cymbidium 2.2 Giới thiệu lan Cymbidium 2.2.1 Phân loại – phân bố 2.2.2 Đặc điểm thực vật học 2.2.3 Yêu cầu sinh thái 2.2.4 Sâu bệnh 2.2.5 Tình hình sản xuất lan Cymbidium Tp Đà Lạt giới 2.3 Giới thiệu vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora tác hại 2.3.1 Phân loại 2.3.2 Erwinia carotovora 2.3.3 Erwinia carotovora subsp carotovora 2.4 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh vi khuẩn gây 13 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Vật liệu thí nghiệm 17 3.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17 3.1.2 Vật liệu 17 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 3.2.1 Điều tra tình hình bệnh chết địa lan TP Đà Lạt – Lâm Đồng 18 3.2.2 Phân lập mẫu vi khuẩn 18 3.2.3 Quan sát vi khuẩn môi trƣờng KB môi trƣờng YDC 19 3.2.4 Chủng vi khuẩn lên củ khoai tây địa lan 19 3.2.5 Tăng sinh khối vi khuẩn môi trƣờng LB lỏng 21 3.2.6 Ly trích DNA tổng số vi khuẩn 21 3.2.7 Thực phản ứng PCR 22 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Tình hình bệnh hại địa lan TP Đà Lạt – Lâm Đồng 25 4.1.1 Các triệu chứng bệnh địa lan 25 4.1.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh vi khuẩn, virus, nấm gây qua vƣờn điều tra 27 4.2 Phân lập mẫu vi khuẩn 28 4.3 Quan sát vi khuẩn môi trƣờng KB môi trƣờng YDC 29 4.3.1 Trên môi trƣờng KB 29 4.3.2 Trên môi trƣờng YDC 30 4.4 Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây địa lan 31 4.4.1 Trên củ khoai tây 31 4.4.2 Trên địa lan 32 4.5 Ly trích DNA tổng số vi khuẩn 32 4.6 Phản ứng PCR 34 4.6.1 Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 Xan 322 34 4.6.2 Phản ứng PCR với cặp primer Erw1 Erw2 35 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Đề nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 10 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR : Polymerase chain reaction DNA : Deoxyribonucleotide acid RNAse : Ribonuclease TE : Tris EDTA SDS : Sodium dodecyl sulfate NaCl : Natri clorua TAE : Tris Acetate EDTA dNTP : Deoxynucleotide triphosphate Taq : Thermus aquaticus UV : Ultra violet LB : Luria – Bertani KB : King et al 's medium B agar CVP : Crystal violet - pectate PGA : Potato Glucose Agar EtBr : Ethidium bromide YDC : Yeast extract – dextrose – CaCO3 Ecc : Erwinia carotovora subsp carotovora CTAB : Cethyltrimethylammonium bromide Tm : Melting temperature ELISA : Enzyme linked Immuno Sorbent Assay μl : micro lít μg : micro gam μM : micro mol / lít mM : mili mol / lít ctv : cộng tác viên : hecta ng : nano gam bp : base pair ... NGHỆ SINH HỌC ٭٭٭000٭٭٭ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR Giáo vi? ?n hƣớng dẫn: Sinh vi? ?n thực hiện: TS LÊ ĐÌNH ĐƠN NGUYỄN... Minh.Tháng năm 2006 “PHÁT HIỆN VI KHUẨN Erwinia carotovora subsp carotovora TRÊN CÂY ĐỊA LAN (Cymbidium) BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR? ?? Giáo vi? ?n hƣớng dẫn: Thầy Lê Đình Đơn Thầy Dƣơng Thành Lam Địa điểm: Phịng... nêu trên, chúng tơi tiến hành đề tài ? ?Phát vi khuẩn Erwinia carotovora subsp carotovora địa lan (Cymbidium) phƣơng pháp PCR? ?? 1.2 Mục đích – yêu cầu 1.2.1 Mục đích: thiết lập quy trình PCR cho vi
