Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi sona và tạo hạt nhân tạo ở cây lan Hồ Điệp
1 Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Từ lâu hoa Lan tôn vinh “Mỹ Nữ Sơn Lâm” lồi hoa, khơng loại hoa vương giả đẹp lộng lẫy, mê hồn mà cịn tượng trưng cho tính hướng thiện người Trong dân gian, lưu truyền nhiều câu chuyện có liên quan đến lồi hoa Người ca ngợi hoa Lan đức Khổng Phu Tử (Trung Quốc - 551 B.C), ví hoa Lan lồi hoa qn tử Và trước nữa, vua Thần Nông (Trung Quốc - 2800 B.C) dùng hoa Lan trị bệnh liều thuốc tiên, nên từ dân gian âm thầm gọi hoa Lan vua loài hoa Tương truyền nước ta có kể rằng: vua Trần Nhân Tông rời kinh thành Yên Tử, Quảng Ninh đêm ngủ mộng Ngài thấy có người đến yết kiến dâng tặng giò hoa đẹp Sáng ra, nghi nghi hoặc nhà vua sâu vào núi bắt gặp khe sâu có lồi hoa lạ, đẹp vơ khiết Đời sau người ta gọi loài hoa lan Trần mộng (giấc mộng vua Trần) để điển tích rũ bụi trần bước vào cõi thiền khiết Ngài Do đó, thú chơi Lan mang ý nghĩa đặc biệt, chăm Lan người ta không chăm chút đẹp cho hoa mà cịn dưỡng Tâm sáng cho Ngày nay, thấy hoa lan khắp nơi dễ bị choáng ngợp trước vẻ đẹp quyến rũ, biến hóa mn màu mn vẻ loài lan Cattleya, Hồ Điệp , Dendrobium, Mokara, Vanda, Cymbidium, Oncidium Hoa lan ưa chuộng phải biểu tượng niềm khát khao sống phong lưu hạnh phúc bền bỉ Hoa lan q tạo hóa, khơng lồi hoa đẹp có giá trị mặt tinh thần mà cịn có giá trị kinh tế cao có thị trường tiêu thụ mạnh nước xuất Tại khu vực Đông Nam Á ngành hoa lan phát triển mạnh, Thái Lan nước xuất lan nhiều giới (có đến 1.000 giống hoa lan), Malaysia phủ qui hoạch hẳn 300 đất Johor giao cho Hiệp hội hoa lan tổ chức thành khu “Trung Tâm Sản Xuất Hoa Cảnh Xuất Khẩu”, ngành trồng hoa lan Đài Loan tăng nhanh tốc độ từ 15-20%, đạt doanh thu năm 9,3 tỷ đài tệ Ở Việt Nam, nghề trồng Lan phát triển chậm nước nhiều Việc trồng lan địa bàn TP.HCM lâu chủ yếu tự phát nên diện tích trồng cịn nhỏ trình độ tay nghề nơng dân chưa đồng đều, ngồi người trồng lan chưa chủ động nguồn giống, việc trồng lan khó khăn, đặc biệt trồng lan Hồ Điệp Loại lan trồng khó phải đầu tư lớn, từ việc cung cấp dưỡng chất giữ ẩm thiết bị nhà ươm, chăm sóc… phải nhập ngoại chịu thuế cao Đặc biệt, sau năm trở cho thu hoạch lúc thị trường bão hịa, lợi nhuận thu không tương xứng với vốn công sức bỏ Theo tình hình có nhiều cơng trình nghiên cứu nuôi cấy in vitro lan Hồ Điệp nhằm tạo nguồn hoa ổn định Từ nuôi cấy mô, nguồn gene từ dòng lan sưu tập lưu giữ lại để nâng cao chất lượng giống, đồng thời tổ chức nhân nhanh để cung cấp cho nhu cầu thị trường ngồi nước Tuy có số thành tựu đáng kể thực tế cịn nhiều hạn chế chất lượng giống khơng đồng thực quy mô lớn Dựa vào thực tế nêu trên, với đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp )”, chúng tơi mong muốn góp phần vào công nghiệp sản xuất hoa lan Hồ Điệp Trong đề tài này, lan Hồ Điệp sản xuất phương pháp nhân giống in vitro tốc độ cao tạo giống có đặc điểm kiểu gen kiểu hình đồng với nguồn mẫu ban đầu Từ đó, cho đời nhiều giống hoa lan Hồ Điệp có chất lượng tốt để ngày đáp ứng nhu cầu người yêu hoa Lan Hiện giới, cơng trình nghiên cứu phôi soma đạt thành công định thực vật hai mầm, mầm cịn gặp nhiều khó khăn Vì ứng dụng tốt đẹp mà phơi soma mang lại, đề tài chúng tơi thử nghiệm phương pháp tạo phôi soma hoa lan Hồ Điệp cho việc tạo phôi soma trở nên thật đơn giản hiệu Từ kết thu nhận việc tạo phôi soma lan Hồ Điệp, xa nữa, cách sử dụng phôi soma để tạo hạt nhân tạo Công nghệ hạt nhân tạo phương pháp tạo dạng hạt mô hạt tự nhiên, có phơi sinh dưỡng "chồi ngủ" bọc lớp dung dịch alginate (một chất có tác dụng tạo lớp vỏ cứng bên cho mầm hạt) có chứa chất dinh dưỡng, phơi sau nảy mầm thành hoàn chỉnh Đây vấn đề nhà khoa học giới quan tâm ứng dụng bảo quản phơi vơ tính, chất mầm thực vật dài hạn Đồng thời mở hướng cho việc sử dụng hạt vô tính thay cho hạt hữu tính có khả nẩy mầm thấp không đồng loạt Khi thực đề tài này, hy vọng mang đến hiểu biết q trình hình thành phơi vơ tính lan Hồ Điệp nói riêng hoa lan nói chung, đồng thời đem lại ứng dụng thiết thực cho ngành nuôi cấy mô thực vật Việt Nam 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích - Tìm hiểu vai trị tác động chất điều hịa sinh trưởng lên hình thành mơ sẹo phát sinh phôi soma lan Hồ Điệp - Tạo hạt nhân tạo có ý nghĩa cơng tác trì nguồn mẫu, nguồn gen thực vật quí thời gian dài phục vụ cho mục đích sử dụng khác tương lai - Làm sở cho việc kiểm chứng khác hoa lan Hồ Điệp in vitro có nguồn gốc từ phôi soma với hoa lan Hồ Điệp từ nguồn mô khác - Làm sở để nghiên cứu tiếp khả tạo mô sẹo phát sinh phôi soma loại thân thảo mầm khác 1.2.2 Yêu cầu - Tạo hoa lan Hồ Điệp có đặc điểm kiểu gen kiểu hình đồng với nguồn mẫu ban đầu Từ đó, tạo số lượng lớn có chất lượng tốt, đồng thời làm giảm giá thành - Hình thành quy trình nhân giống vơ tính in vitro tạo hạt nhân tạo hoa lan Hồ Điệp, để góp phần nghiên cứu giải nhu cầu giống phục vụ cho việc tiêu thụ hoa nước xuất Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu lan Hồ Điệp Cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) loại đơn trục sống biểu sinh, thuộc : Ngành : Hạt kín (Angiospermae) Lớp : Một mầm (Monocotyledoneae) Bộ : Lan (Orchidales) Họ : Phong lan (Orchidaceae) Cây phong lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) sinh trưởng phát triển tốt điều kiện khí hậu Việt Nam Hồ Điệp có hoa đẹp, đa dạng, màu sắc phong phú lại lâu tàn, trung bình phát hoa có từ – 15 hoa, thời gian hoa tươi kéo dài từ – tháng Đó tính chất hẳn phong lan Hồ Điệp so với loại phong lan khác, giúp cho lan Hồ Điệp có giá trị kinh tế cao nước nước Khả tự sinh lan thiên nhiên thấp Thông thường để tạo số lượng lớn giống lan này, người ta dùng phương pháp gieo hạt nuôi cấy in vitro Tuy nhiên mọc từ hạt thường tăng trưởng không đồng đều, lâu trổ hoa, đặc điểm hoa không Nhân giống đường tạo mô sẹo phát sinh phôi soma khắc phục nhược điểm 2.1.1 Nguồn gốc phân bố Cây phong lan Hồ Điệp có nguồn gốc Tây Nam Châu Á, trải rộng vùng núi cao Trung Quốc Tây Tạng đến Châu Úc, vùng kinh tuyến bao gồm Ấn Độ Dương Thái Bình Dương Người ta gặp giống Sumatra, Bornéo, Célèbes, Nouvelle Calédonie (Marry Noble, 1971) Đây sống biểu sinh, cao rừng dầy có ẩm độ cao gần đất, nhỡ (arbuter), hay sống bám hốc đá, hay đám rêu dày, vài loài sống vùng ven biển Lan Hồ Điệp thích hợp với nắng so với loại phong lan có giả hành Nhiệt độ thích hợp cho tăng trưởng phát triển 15oC – 38oC giống thường sống cao độ 200m400m (William Kramer, 1983) Tên Phalaenopsis có nguồn gốc từ Phalaina (phalène) d’Opsis (apparence), Blume (nhà thực vật học người Hà Lan) đặt vào năm 1852 ơng khám phá lồi lan đặc biệt có hoa giống cánh bướm, Phalaenopsis amabilis Đa số tác giả đồng ý xếp chi Hồ Điệp có nhụy, kiểu phát hoa bên có cấu tạo đơn trục Trong chi có khoảng 70 loài, phân bố vùng khu vực khác Các loài thường xuyên lai chéo với nhau, phả hệ nhận phức tạp Thế hệ cháu chúng không Tuy nhiên lai tạo đưa đến lợi ích lớn để cung cấp cá thể ln đổi đặc tính quyến rũ hoa (Perlz, 1974) 2.1.2 Vị trí lan Hồ Điệp thị trường So với đa số loại lan thị trường nay, lan Hồ Điệp bật hơn, đặc tính hoa đa dạng, màu sắc phong phú, hoa lâu tàn, trung bình hoa tươi cành kéo dài từ 3-4 tháng (Broly, 1982) Trục phát hoa dài, đường kính to, mang nhiều hoa to, trung bình 7-15 hoa, thuận lợi cho việc trang trí, cắt cành xuất khẩu, chuyên chở xa mà không ảnh hưởng đến chất lượng hoa Hồ Điệp có giá trị kinh tế cao số giống lan khác Nếu biết dùng biện pháp kỹ thuật để thúc đẩy việc hoa sớm có lợi nhiều việc kinh doanh Hình 2.1 Một số loại lan Hồ Điệp phổ biến 2.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1 Khái niệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay cịn gọi ni cấy in vitro công cụ cần thiết nhiều lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng ngành công nghệ sinh học Nhờ áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô, người thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh gấp nhiều lần so với tự nhiên Do tạo hàng loạt cá thể giữ nguyên tính trạng di truyền thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất Hơn dựa vào kĩ thuật ni cấy mơ trì bảo quản nhiều giống trồng quí để phục tráng giống trồng Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật mảnh nhỏ thực vật vô trùng đặt mơi trường dinh dưỡng thích hợp Chồi hay mơ sẹo mà mẫu cấy sinh tăng sinh phân chia cấy chuyền để nhân giống 2.2.2 Lịch sử phát triển Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức Schleiden Schwann đề xướng học thuyết tế bào nêu rõ: Mọi sinh vật phức tạp gồm nhiều sinh vật nhỏ, tế bào hợp thành, tế bào phân chia mang thông tin di truyền chứa tế bào đầu tiên, trứng sau thụ tinh đơn vị độc lập từ xây dựng lại tồn thể Năm 1902, Haberlandt đề xướng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính tồn tế bào, nghĩa tế bào mang đầy đủ thông tin di truyền cá thể Ơng tiến hành họ hịa thỏa (cây mầm) lọai khó thực ơng bị thất bại Năm 1922, Kote (học trị Haberlandt) Robbins (nhà khoa học người Mỹ) lặp lại thí nghiệm Haberlandt ni cấy đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ loại thuộc họ hòa thảo tạo hệ rễ nhỏ có rễ phụ Tuy nhiên sinh trưởng tồn thời gian sau chậm lại ngừng hẳn tác giả chuyển sang môi trường Năm 1934, White nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) Năm 1937, Gautheret Nobecout tạo trì sinh trưởng mơ sẹo cà rốt thời gian dài môi trường thạch cứng Năm 1941, Overbeck chứng minh vai trị chất kích thích sinh trưởng ni cấy phơi họ cà Trong thời gian chất hích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin nghiên cứu tổng hợp hóa học thành cơng Và năm 1948 Steward xác định tác dụng nước dừa nuôi cấy mô sẹo cà rốt Năm 1955, người ta tìm tác dụng kích thích phân bào kinetin.Sau chất cytokinine khác BAP, IP, Zeatin phát Năm 1957, SKoog Miller công bố kết nghiên cứu ty lệ kinetin/auxin hình thành quan từ mô sẹo thuốc Từ năm 1954, đến năm1959 kỹ thuật tách nuôi cấy tế bào đơnđã phát triển, tác giả gieo tế bào đơn nuôi cấy tạo hồn chỉnh Năm 1966, Guha Mahheswari ni cấy thành công tế bào đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cà độc dược Năm1967, Bougin Nistsh tạo thành công đơn bội từ túi phấn thuốc 2.2.3 Ứng dụng Năm 1986, số lượng lớn trồng sản xuất phương pháp nuôi cấy mô tiêu thụ tên thị trường thương mại với hàng chục triệu dollar Kỹ thuật thể số ưu điểm ứng dụng: - Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh - Tạo bệnh kháng bệnh - Cảm ứng tuyển lựa dòng đột biến - Sản xuất đơn bội qua nuôi cấy túi phấn - Lai xa - Lai tế bào soma tạo dịng protoplast - Gây biến tính thực vật qua hấp thụ DNA ngoại lai - Cố định nitrogen - Cải thiện hiệu quang tổng hợp - Bảo quản nguồn gen quý 2.2.4 Các phương pháp nuôi cấy in vitro Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Mẫu cấy bao gồm: đỉnh sinh dưỡng, chồi đỉnh, chồi bên, có kích thước khoảng 0.58 - cm Đây phương pháp dễ dàng nhất, mẫu sau vô trùng nuôi cấy môi trường thích hợp cho loại sau thời gian nuôi cấy tạo thành hay nhiều chồi Sau đó, ni cấy mơi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng tạo thành nhiều chồi, rễ, tạo thành hồn chỉnh Ni cấy mô sẹo Mẫu cấy tế bào đỉnh sinh trưởng hay nhu mô tách môi trường giàu auxin mơ sẹo hình thành Mơ sẹo tế bào vơ tổ chức có màu trắng Khối mơ sẹo có khả tái sinh thành hồn chỉnh mơi trường khơng có chất kích thích sinh trưởng tạo mơ sẹo Ni cấy mơ sẹo thực khơng có khả nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng tái sinh từ mơ sẹo có nhiều chồi so với tái sinh từ đỉnh sinh trưởng, nhiên mức độ biến dị tế bào soma phương pháp cao Phương pháp nuôi cấy tế bào đơn Những khối sẹo nuôi cấy môi trường lỏng, đặt máy lắc khối sẹo dứơi tác dụng học hóa học tách nhiều tế bào đơn lẻ gọi tế bào đơn Những tế bào đơn ni cấy mơi trường đặc biệt tăng sinh khối Sau thời gian nuôi cấy môi trường lỏng tế bào đơn tách đặt trải mơi trường thạch phát sinh thành tế bào mô sẹo Những tế bào mô sẹo ni cấy mơi trường cytokinin/auxin thích hợp tái sinh thành hồn chỉnh Trong chọn giống trồng người ta dựa vào phương pháp để tạo giống cách đột biến tế bào đơn hóa chất hay phóng xạ Nuôi cấy protoplast- chuyển gen Protoplast (tế bào trần ), thực chất tế bào đơn tách vỏ cellulose, có sức sống trì chức sẵn có Protoplast tái sinh trực tiếp từ thân, lá, rễ học, từ tế bào đơn sẵn có Trong mơi trường thích hợp protoplast 10 có khả tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia tái sinh thành hoàn chỉnh Trong chọn giống trồng người ta sử dụng phương pháp để cải tiến giống trồng cách cho dung hợp protoplast protoplast loài khác lồi Protoplast có khả hấp thu tế bào ngoại lai để cải thiện đặc tính số loại trồng mà không thông qua phương pháp chuyển gen khác Nuôi cấy tế bào đơn bội Hạt phấn trồng nuôi cấy môi trường thích hợp tạo thành mơ sẹo, mơ sẹo có khả tái sinh thành hồn chỉnh có nhiễm sắc thể n gọi đơn bội Trong nuôi cấy mô thực vật người ta sử dụng mô sẹo xử lý colchicin để tạo thành đa bội 2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng ni cấy in vitro 2.3.1 Chất điều hồ sinh trưởng Chất sinh trưởng thực vật hay gọi chất điều hòa sinh trưởng thực vật hợp chất hữu (bao gồm sản phẩm thiên nhiên thực vật hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết q trình sinh trưởng phát triển, làm biến đổi trình sinh lý thực vật đó, nồng độ thấp Chúng chất dinh dưỡng hay sinh tố dùng thực vật Một số chất điều hoà sinh trưởng thường dùng: (1) Auxin Auxin nhóm chất tổng hợp chủ yếu đầu thân, đầu rễ, vận chuyển đến phận khác thể để kích thích tăng trưởng tế bào ... Dựa vào thực tế nêu trên, với đề tài ? ?Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp )”, chúng tơi mong muốn góp phần vào công nghiệp sản xuất hoa lan Hồ Điệp. .. soma hoa lan Hồ Điệp cho việc tạo phôi soma trở nên thật đơn giản hiệu Từ kết thu nhận việc tạo phôi soma lan Hồ Điệp, xa nữa, cách sử dụng phôi soma để tạo hạt nhân tạo Công nghệ hạt nhân tạo phương... vitro tạo hạt nhân tạo hoa lan Hồ Điệp, để góp phần nghiên cứu giải nhu cầu giống phục vụ cho việc tiêu thụ hoa nước xuất 4 Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu lan Hồ Điệp Cây lan Hồ Điệp