GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo Tiểu luận Thu nhận và khảo sát một số đặc tính của enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis Luận văn tốt nghiệp GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo MỤC LỤC 1. KHẢO SÁT HIỆU SUẤT THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TỪ CANH TRƯỜNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS VỚI CÁC LOẠI TÁC NHÂN TỦA KHÁC NHAU …………………………………………………………… 1 2. KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ PROTEASE ……………………2 3. KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP LOWRY ……………………………………………………….3 3.5 Khảo sát hàm lượng protein của CPE protease được tủa bằng muối amoni sulfat ……………………………………………………………….4 Luận văn tốt nghiệp GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo 1. KHẢO SÁT HIỆU SUẤT THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TỪ CANH TRƯỜNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS VỚI CÁC LOẠI TÁC NHÂN TỦA KHÁC NHAU . Bảng 1.1: Lượng chế phẩm enzyme protease thu được và hiệu suất thu nhận với các loại tác nhân tủa khác nhau. Tác nhân tủa enzyme Khối lượng canh trường (g) Khối lượng tủa (g) Khối lượng tủa trung bình (g) Hiệu suất thu nhận (%) 1 2 3 Cồn 50 2,59 2,74 2,68 2,67 5,34 Acetone 50 1,84 1,87 1,83 1,85 3,70 Amoni sulfat 50 1,16 0,96 1,09 1,07 2,14 Nhận xét : Lượng chế phẩm enzyme thu được và hiệu suất thu nhận enzyme cao nhất là trong trường hợp tác nhân tủa là cồn. 2. KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ PROTEASE . 2.1 Đường chuẩn Tyrosin : Bảng 2.1: Đường chuẩn Tyrosin . Lượng Tyrosin(µmol) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 OD (750 nm) 0 0,181 0,355 0,529 0,704 0,878 Luận văn tốt nghiệp GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 NOÀNG ÑOÄ TYROSIN (µmol) MAÄT ÑOÄ QUANG OD (750 nm) Hình 2.1 : Đường chuẩn Tyrosin. 2.2 Khảo sát hoạt độ protease trong canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis: Cân 20 g canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis, tiến hành như mục II.3.1, phần dịch thu được 200 ml, pha loãng 2 lần, đem 0,5ml tiến hành xác định hoạt độ theo phương pháp Anson cải tiến như mục II.3.2 Bảng 2.2: Hoạt độ protease của canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis. Lần OD M OD ĐC ∆OD = OD M - OD ĐC µmol Tyrosin Hoạt độ (UI/g CT) Hoạt độ trungbình (UI/g CT) 1 0,998 0,915 0,083 0,091 1,46 1,63 2 1,012 0,915 0,097 0,107 1,71 3 1,013 0,915 0,098 0,108 1,73 Nhận xét : Hoạt độ protease của canh trường vi khuẩn là 1,63 UI/g CT (giá trị trung bình) . Luận văn tốt nghiệp GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo 2.3 Khảo sát hoạt độ protease của chế phẩm enzyme được tủa bằng cồn 96 0 : Cân 1g chế phẩm enzym protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó pha loãng 2 lần, lấy 0,5ml tiến hành xác định hoạt độ theo phương pháp Anson cải tiến như mục II.3.2 Bảng 2.3: Hoạt độ protease của chế phẩm enzyme được tủa bằng cồn 96 0 . Lần OD M OD ĐC ∆OD = OD M - OD ĐC µmol Tyrosin Hoạt độ (UI/g CPE) Hoạt độ trung bình (UI/g CPE) 1 0,425 0,300 0,125 0,139 22,24 22,61 2 0,427 0,310 0,117 0,130 20,80 3 0,429 0,290 0,139 0,155 24,80 Nhận xét : Hoạt độ của chế phẩm enzyme protease được tủa bằng cồn 96 0 là 22,61 UI/g CPE (giá trị trung bình) . 2.4 Khảo sát hoạt độ protease của chế phẩm enzyme được tủa bằng aceton : Cân 1g chế phẩm enzym protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó pha loãng 2 lần, lấy 0,5ml tiến hành xác định hoạt độ theo phương pháp Anson cải tiến như mục II.3.2 Bảng 2.4: Hoạt độ protease của chế phẩm enzyme được tủa bằng acetone. Lần OD M OD ĐC ∆OD = OD M - OD ĐC µmol Tyrosin Hoạt độ (UI/g CPE) Hoạt độ trung bình (UI/g CPE) 1 0,493 0,410 0,083 0,091 14,56 14,29 2 0,492 0,402 0,090 0,099 15,84 3 0,495 0,424 0,071 0,078 12,48 Nhận xét : Hoạt độ của chế phẩm enzyme protease được tủa bằng aceton là 14,29 UI/g CPE (giá trị trung bình) . 2.5 Khảo sát hoạt độ protease của chế phẩm enzyme được tủa bằng amoni sulfat: Cân 1g chế phẩm enzym protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó pha loãng 2 lần, lấy 0,5ml tiến hành xác định hoạt độ theo phương pháp Anson cải tiến như mục II.3.2 Bảng 2.5: Hoạt độ protease của chế phẩm enzyme được tủa bằng Amoni sulfat. Luận văn tốt nghiệp GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo Lần OD M OD ĐC ∆OD = OD M - OD ĐC µmol Tyrosin Hoạt độ (UI/g CPE) Hoạt độ trung bình (UI/g CPE) 1 0,517 0,458 0,059 0,064 10,24 6,93 2 0,489 0,462 0,027 0,027 4,32 3 0,524 0,487 0,037 0,039 6,24 Nhận xét : Hoạt độ của chế phẩm enzyme protease được tủa bằng muối amoni sulfat là 6,93 UI/g CPE (giá trị trung bình) . 2.6 Sự so sánh hoạt độ các CPE protease tủa bởi các tác nhân khác nhau: Bảng 2.6: So sánh hoạt độ của các CPE protease với tác nhân tủa khác nhau. Tác nhân tủa Hoạt độ (UI/g CPE) Hoạt độ trung bình (UI/g CPE) Cồn 96 0 22,24 22,61 20,80 24,80 Acetone 14,56 14,2915,84 12,48 Amoni sulfat 10,24 6,93 4,32 6,24 Nhận xét : Trong các loại chế phẩm protease, chế phẩm có hoạt độ cao nhất là chế phẩm enzyme được tủa bằng cồn (22,61 UI/g CPE). 3. KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP LOWRY . 3.1 Đường chuẩn Albumin : Bảng 3.1: Đường chuẩn Albumin Nồng độ protein (µg/ml) 0 50 100 150 200 250 OD (750 nm) 0 0,208 0,404 0,598 0,795 0,988 Luận văn tốt nghiệp GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 50 100 150 200 250 300 NOÀNG ÑOÄ ALBUMIN (µg/ml) MAÄT ÑOÄ QUANG OD (750 nm) Hình 3.1: Đường chuẩn Albumin 3.2 Khảo sát hàm lượng protein trong canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis : Cân 20 g canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis, tiến hành như mục II.3.1, phần dịch thu được 200 ml, pha loãng 50 lần, đem1ml tiến hành thí nghiệm theo phương pháp Lowry như mục II.3.3 Luận văn tốt nghiệp GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo Bảng 3.2: Hàm lượng protein của canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis : Lần OD M OD ĐC ∆OD = OD M - OD ĐC Nồng độ protein tương ứng (µg/ml) Hàm lượng protein (mg/g CT) Hàm lượng protein trung bình (mg/g CT) 1 0,774 0,035 0,739 187,872 93,94 94,92 2 0,783 0,035 0,748 190,179 95,09 3 0,788 0,035 0,753 191,462 95,73 Nhận xét : Hàm lượng protein của canh trường vi khuẩn Bacillus subtilis là 94,92 mg/g CT (giá trị trung bình) . 3.3 Khảo sát hàm lượng protein của CPE protease được tủa bằng cồn 96 0 : Cân 1g chế phẩm enzyme protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó pha loãng 20 lần, lấy 1ml xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry như mục II.3.3 Bảng 3.3: Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme được tủa bằng cồn 96 0 . Lần OD M OD ĐC ∆OD =OD M -OD ĐC Nồng độ protein tương ứng (µg/ml) Hàm lượng protein (mg/g CPE) Hàm lượng protein trung bình (mg/g CPE) 1 0,631 0,035 0,666 169,154 338,31 318,60 2 0,639 0,035 0,604 153,256 306,51 3 0,645 0,035 0,610 155,487 310,97 Nhận xét : Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme protease được tủa bằng cồn 96 0 là 318,60 mg/g CPE (giá trị trung bình) . 3.4 Khảo sát hàm lượng protein của CPE protease được tủa bằng aceton: Cân 1g chế phẩm enzyme protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó pha loãng 20 lần, lấy 1ml xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry như mục II.3.3 Bảng 3.4: Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme được tủa bằng cồn Acetone. Luận văn tốt nghiệp GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo Lần OD M OD ĐC ∆OD = OD M - OD ĐC Nồng độ protein tương ứng (µg/ml) Hàm lượng protein (mg/g CPE) Hàm lượng protein trung bình (mg/g CPE) 1 0,598 0,035 0,563 142,744 285,49 284,63 2 0,594 0,035 0,559 141,718 283,44 3 0,597 0,035 0,562 142,478 284,97 Nhận xét : Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme protease được tủa bằng aceton là 284,63 mg/g CPE (giá trị trung bình) . 3.5 Khảo sát hàm lượng protein của CPE protease được tủa bằng muối amoni sulfat : Cân 1g chế phẩm enzyme protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó pha loãng 20 lần, lấy 1ml xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry như mục II.3.3 Luận văn tốt nghiệp GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo Bảng 3.5: Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme được tủa bằng amoni sulfat. Lần OD M OD ĐC ∆OD = OD M - OD ĐC Nồng độ protein tương ứng (µg/ml) Hàm lượng protein (mg/g CPE) Hàm lượng protein trung bình (mg/g CPE) 1 0,456 0,035 0,421 106,333 212,67 203,44 2 0,414 0,035 0,379 95,564 191,13 3 0,444 0,035 0,409 103,256 206,51 Nhận xét : Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme protease được tủa bằng aceton là 203,44 mg/g CPE (giá trị trung bình) . 3.6 Sự so sánh hàm lượng protein của chế phẩm protease tủa bởi các tác nhân khác nhau : Bảng 3.6: So sánh hàm lượng protein của các loại chế phẩm enzyme protease với tác nhân tủa khác nhau. Tác nhân tủa Hàm lượng protein (mg/g CPE) Hàm lượng protein trung bình (mg/g CPE) Cồn 96 0 338,31 318,60 306,51 310,97 Aceton 285,49 284,63 283,44 284,97 Amoni sulfat 212,67 203,44 191,13 206,51 Nhận xét : Hàm lượng protein cao nhất ở chế phẩm enzyme protease được tủa bằng cồn 96 0 là 307,85 mg/g CPE (giá trị trung bình ) 4. HOẠT ĐỘ RIÊNG CỦA PROTEASE . Bảng 4.1: Hoạt độ riêng của canh trường vi khuẩn. Hoạt độ protease (UI/g CT) Hàm lượng protein (mg protein/g CT) Hoạt độ riêng (UI/mg Pr) 1,63 94,92 0,017 Luận văn tốt nghiệp [...]... 5 KHẢO SÁT SỰ PHỤ THU C HOẠT ĐỘ CỦA CÁC CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE VÀO NHIỆT ĐỘ 5.1 Khảo sát sự phụ thu c hoạt độ của CPE protease (tủa bằng cồn) theo nhiệt độ: Cân 1g chế phẩm enzym hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó pha lỗng 2 lần, ở mỗi nhiệt độ khảo sát từ 30 0 C đến 800 C, lấy 0,5ml tiến hành xác định hoạt độ theo Anson cải tiến như mục II.3.2 Luận văn tốt nghiệp GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu. .. độ enzyme vào nhiệt độ đối với CPE (tủa bằng aceton) : Cân 1g chế phẩm enzym protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó pha lỗng 2 lần, ở mỗi nhiệt độ khảo sát từ 30 0 C đến 800 C, lấy 0,5ml tiến hành xác định hoạt độ theo Anson cải tiến như mục II.3.2 Bảng 5.2: Khảo sát sự phụ thu c hoạt độ enzyme vào nhiệt độ đối với CPE (tủa bằng aceton) : Luận văn tốt nghiệp GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu. .. Nhận xét : Ở 550C, chế phẩm enzyme protease được tủa bằng aceton có hoạt độ cao nhất là 42,88 UI/g CPE (giá trị trung bình) 50 40 30 HOẠT ĐỘ 20 (UI/g CPE) 10 0 -10 0 20 40 60 NHIỆT ĐỘ (ĐỘ C) Luận văn tốt nghiệp 80 100 GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo Hình 5.2: Sự phụ thu c của hoạt độ chế phẩm protease (tủa bằng aceton) theo nhiệt độ 5.3 Khảo sát sự phụ thu c hoạt độ enzyme. .. độ enzyme vào nhiệt độ đối với CPE (tủa bằng amoni sulfat) : Cân 1g chế phẩm enzym protease hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó pha lỗng 2 lần, ở mỗi nhiệt độ khảo sát từ 30 0 C đến 800 C, lấy 0,5ml tiến hành xác định hoạt độ theo Anson cải tiến như mục II.3.2 Luận văn tốt nghiệp GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo Bảng 5.3: Khảo sát sự phụ thu c hoạt độ của CPE protease. .. SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT ĐỘ CỦA CHẾ PHẨM PROTEASE TỪ BACILLUS SUBTILIS THEO pH Cân 1g chế phẩm enzym hòa tan trong 100ml nước cất, sau đó pha lỗng 2 lần, ở nhiệt độ 550C, mỗi pH khảo sát từ 3 đến 10, lấy 0,5ml tiến hành xác định hoạt độ theo Anson cải tiến như mục II.3.2 Luận văn tốt nghiệp GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo Bảng 6.1: Sự biến đổi hoạt độ của CPE protease theo pH pH... PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo Bảng 4.2: So sánh hoạt độ riêng của từng loại chế phẩm enzyme protease với tác nhân tủa khác nhau Tác nhân tủa Hoạt độ protease Hàm lượng protein Hoạt độ riêng (UI/g CPE) (mg Pr/g CPE) (UI/mg Pr) Cồn 96 22,61 318,60 0,072 Acetone 14,29 284,63 0,050 Amoni sulfat 6,93 203,44 0,034 Nhận xét : Hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme protease được tủa bằng... 13,55 2,99 Nhận xét : Ở 550C, chế phẩm enzyme protease được tủa bằng cồn 96 0 có hoạt độ cao nhất là 63,40 UI/g CPE (giá trị trung bình) Luận văn tốt nghiệp GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo 70 60 50 HOẠT ĐỘ 40 (UI/g CPE) 30 20 10 0 0 20 40 60 NHIỆT ĐỘ (ĐỘ C) 80 100 Hình 5.1: Sự phụ thu c của hoạt độ chế phẩm protease (tủa bằng cồn) theo nhiệt độ 5.2 Khảo sát sự phụ thu c hoạt... 0,18 Nhận xét : ở pH = 6,0; chế phẩm enzyme protease được tủa bằng cồn 96 0 có hoạt độ cao nhất là 78,45 UI/g CPE (giá trị trung bình ) Luận văn tốt nghiệp GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo 90 80 70 60 HOẠT ĐỘ 50 (UI/g CPE) 40 30 20 10 0 0 2 4 6 8 10 12 pH Hình 6.1: Sự phụ thu c hoạt độ của chế phẩm protease (tủa bằng cồn) theo pH 7 KHẢO SÁT Q TRÌNH THỦY PHÂN PROTID CỦA... 0,96 Nhận xét : Ở 550C, chế phẩm enzyme protease được tủa bằng muối amoni sulfat có hoạt độ cao nhất là 37,33 UI/g CPE (giá trị trung bình) Luận văn tốt nghiệp GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo 40 35 30 HOẠT ĐỘ (UI/g CPE) 25 20 15 10 5 0 0 20 40 60 80 100 NHIỆT ĐỘ (ĐỘ C) Hình 5.3: Sự phụ thu c của hoạt độ chế phẩm protease (tủa bằng amoni sulfat) theo nhiệt độ 6 KHẢO SÁT... 0,211 0,211 GVHD : PGS-TS Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo Nhận xét : Với cơ chất là albumin, q trình thủy phân có vận tốc tăng nhanh trong khoảng từ 0 – 5 giờ Giờ thứ 6 và thứ 7, lượng N-formol có tăng nhưng lượng có chiều hướng giảm Từ giờ thứ 8, q trình thủy phân gần như ổn định 7.2 Khảo sát q trình thủy phân casein : Với điều kiện nhiệt độ 550C và pH = 6,0 Bảng 7.2: Sự biến đổi lượng . Đồng Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo Tiểu luận Thu nhận và khảo sát một số đặc tính của enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis Luận văn. Thị Thanh Thu SVTH : Phan Trương Hương Thảo MỤC LỤC 1. KHẢO SÁT HIỆU SUẤT THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME PROTEASE TỪ CANH TRƯỜNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS VỚI