Đang tải... (xem toàn văn)
Giới thiệu chung về phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC
2/8/12 1 S!C K" L#NG HI$U N%NG CAO HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY N&I DUNG • Ngun t!c • Các b" ph#n c$a HPLC • %ng d&ng c$a HPLC 1. NGUN T!C • Là phương pháp tách dựa trên 2 quá trình • * Hấp phụ • * Giải hấp phụ • Xảy ra liên tục giữa 2 pha: • * Pha tónh : thường là rắn hoặc lỏng • * Pha động : chất lỏng (một chất hoặc hỗn hợp nhiều chất) 2. CÁC B& PH'N C(A HPLC • Ngu'n cung c(p pha )"ng • B*m cao áp • B" ph#n b*m m+u vào máy (b,ng tay/t- )"ng) • C"t s!c k. • /0u dò • B" ph#n ghi tín hi1u 2/8/12 2 Heä thoáng HPLC Bình ch)a dung môi gi*i ly c+t 2.1. Ngu,n cung c-p pha .+ng 2/8/12 3 Kh2 khí (degas) • M&c )ích: lo3i tr4 các b5t khí còn sót l3i trong dung mơi pha )"ng • N6u pha )"ng còn sót b5t khí: – T7 l1 pha )"ng khơng )úng 8 th9i gian l:u thay );i – B*m khơng hút ):<c dung mơi 2.1. Ngu,n cung c-p pha .+ng (tt) • Dung mơi dùng cho HPLC: h=n h<p 2 ho>c 4 lo3i – N:?c, )1m, methanol (MeOH), acetonitril (ACN), … – /" tinh khi6t cao (HPLC grade solvent), khơng l+n b&i b@n, kh2 khơng khí (He, siêu âm, ) • 2 kiAu s2 d&ng pha )"ng trong vi1c giBi ly: – GiBi ly )*n n'ng )" (isocratic elution): lo3i và t7 l1 dung mơi khơng thay );i – GiBi ly n'ng )" tCng d0n tuy6n tính (gradient elution): tính phân c-c c$a pha )"ng ):<c thi6t k6 )A tCng d0n lên t4 t4 )Du )>n Gradient trong sắc ký lỏng • Là sự thay đổi thành phần pha động trong quá trình chạy theo những đònh hướng cụ thể • Mục đích : – Nhằm tăng cường khả năng tách của các chất trên cột. • Nguyên nhân : • + nhiều chất không thể tách được trên cột tách với một thành phần pha động (do tương tác của các chất cần tách với pha động và pha tónh giống nhau) • + Nếu thay đổi thành phần pha động: tương tác giữa chất phân tích và pha tónh, pha động sẽ thay đổi. Vì vậy sẽ tách được các chất. 2/8/12 4 BBng: m"t sE dung môi và tính ch(t c$a chúng Tên dung môi Nhi/t .+ sôi ( 0 C) 0+ nh1t (mN.S.m -2 ) B21c sóng h-p thu UV (nm) Pentan 36 0.24 210 Cyclohexan 69 0.98 210 Tetraclorua carbon 77 0.97 265 Toluen 111 0.59 286 Diethyl ether 35 0.25 218 Chloroform 62 0.57 245 Dichloromethane 40 0.44 235 Tetrahydrofuran 66 0.55 220 N:?c 100 1.0 - BBng: m"t sE dung môi và tính ch(t c$a chúng (tt) Tên dung môi Nhi/t .+ sôi ( 0 C) 0+ nh1t (mN.S.m -2 ) B21c sóng h-p thu UV (nm) 2 – butanon 80 0.32 330 Acetone 56 0.32 330 1,4 – dioxan 107 1.44 215 Ethyl acetate 77 0.45 255 Diethylamine 115 0.33 275 Acetonitril 82 0.37 190 2 – propanol 82 2.50 210 Ethanol 78 1.20 210 Methanol 64 0.59 210 2/8/12 5 2.2. B*m cao áp • M&c )ích: b*m pha )"ng (dung môi) )i xuyên ngang pha tFnh (c"t) • Ch(t li1u chGu ):<c dung môi hHu c* • 3000 – 7000 psi ho>c 250 – 500 at (1 at = 0.98 bar) • B*m phBi t3o dòng liên t&c • L:u l:<ng b*m: 0.1 – 9.999 mL/phút (th:9ng 0.5 – 4.0mL/phút) 2.3. B" ph#n tiêm m+u vào c"t • Ing chJa m+u (sample loop) • Dung tích c$a loop: 5 – 100 KL • Th$ công/t- )"ng 2.4. C"t s!c k. (pha tFnh) • N*i xBy ra quá trình phân tách • Thép không rL dài 10 – 30 cm, ø trong : 1 – 10mm • Di1n tích bêM m>t: 50-250 m 2 /g • Nguyên li1u nh'i c"t: h3t có l= r=ng siêu nhN (microporous particle) v?i kích th:?c, d3ng và )" r=ng khác nhau – Silica: h3t có kích th:?c nhN, di1n tích bD m>t l?n (200 – 300 m 2 /g) và chGu )-ng ):<c áp su(t t:*ng )Ei cao • Silica gel (pha thu#n)/silica gel )ã ):<c silan hóa (pha )Bo) – Alumine, zirconium, nguyên li1u trao );i ion 2.4. C"t s!c k. (pha tFnh) (tt) 2/8/12 6 2.4. C"t s!c k. (pha tFnh) (tt) • Ch(t có MW nhN (<500Da): – Di1n tích bD m>t: 200 – 400 m 2 /g – Kích th:?c l=: 50 – 100 Å • Protein, polysaccharide: – O 300 Å 2.4. C"t s!c k. (pha tFnh) (tt) 2.4.1.Nguyên t!c c$a quá trình s!c k. trong c"t • /Ei v?i m=i ch(t, s- l:u giH ):<c qui )Gnh bPi 3 l-c F1, F2 và F3. trong )ó, F1 và F2 giH vai trò quy6t )Gnh, còn F3 là y6u tE Bnh h:Png không l?n • F1: l-c giH ch(t phân tích trên c"t • F2: l-c kéo c$a pha )"ng )Ei v?i ch(t phân tích ra khNi c"t Ch!t phân tích A +B+C Pha t"nh Pha #$ng F2 F3 F1 2/8/12 7 • Nh: v#y, v?i các ch(t khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau nên sQ di chuyAn trong c"t v?i tEc )" khác nhau và tách ra khNi nhau khi ra khNi c"t • n6u n3p m+u phân tích g'm h=n h<p ch(t phân tích A, B, C,… vào c"t phân tích thì các ch(t A, B, C,… sQ ):<c tách ra khNi nhau sau khi )i qua c"t Minh h%a quá trình tách các ch!t A và B trong c$t tách s&c k' Th(i gian A B Pha #$ng 2.4.1.Nguyên t!c c$a quá trình s!c k. trong c"t • Pha tFnh là ch(t h(p ph&: s!c k. h(p ph& pha thu#n ho>c pha )Bo • Pha tFnh là ch(t trao );i ion: s!c k. trao );i ion • Pha tFnh là ch(t lNng: s!c k. phân bE/chi6t • Pha tFnh là gel: s!c k. gel/rây phân t$ Lo3i c+t Tính ch-t c4a h5p ch-t có th6 phân tích C"t pha th:9ng, pha )Bo, pha t3o nEi MW < 2000, không mang )i1n tích, phân c-c ho>c không phân c-c, hòa tan trong dung môi hHu c*/n:?c C"t trao );i ion MW < 2000, mang )i1n tích, hòa tan trong n:?c C"t s!c k. gel MW nhN ho>c l?n, không mang )i1n tích, hòa tan trong dung môi hHu c*/ n:?c 2/8/12 8 2.4.2. C+t pha thu7n (normal phase) • HPLC pha thu#n: s!c k. h(p ph& – Pha )"ng: không phân c-c (hexane, methylene chloride), Pha tFnh phân c-c – C* ch6 tách ch(t: phân bE các phân t2 ch(t tan giHa dung dGch và s- h(p thu lên trên bD m>t pha tFnh • Nguyên li1u nh'i c"t (s!c k. r!n lNng): silica gel, alumni, graphite,… 2.4.2. C+t pha thu7n (normal phase) Phân tích các nhóm ch(t • Vitamin tan trong d0u (A, D, E, K) • Polyphenol • Carbohydrate • … 2.4.3. C"t pha )Bo (reverse phase) • Silica ):<c bi6n );i thành d3ng không phân c-c b,ng cách g!n các chu=i hydrocarbon dài t4 8-18C. • Dung môi phân c8c: th29ng là h:n h5p c4a n21c và m+t alcohol (methanol), ACN, … • Các ch(t có c-c sQ di chuyAn nhanh h*n các ch(t không c-c, do )ó sQ thoát ra ngoài c"t tr:?c. Reverse Phase Chromatography Core Bead Silica or Copolymer Hydrocarbon Phase Coating Hydrocarbon Phase Coating can be different chain lengths usually 18C, 8C or 2C OH OH OH OH Free -OH groups on Silica 2/8/12 9 Reverse Phase Chromatography C 18 C 2 / C 18 End Capped C 8 C 2 Strongly Hydrophobic Mildly Hydrophobic Weakly Hydrophobic How does it work? C 4 Phân tích các nhóm ch(t • Protein th-c v#t • Vitamin: tan trong d0u và n:?c • Lipid • Ch(t chEng oxy hóa • H<p ch(t th*m (vanillin), s!c tE (carotenoid, chlorophyll, anthocyanin) 2.4.3. C"t pha )Bo (reverse phase) 2.5. /0u dò (detector) • B" ph#n phát hi1n các ch(t khi chúng ra khNi c"t )A có thA )Gnh tính và )Gnh l:<ng A = k.C Trong )ó: A: tín hi1u )o ):<c C: n'ng )" ch(t phân tích K: h,ng sE th-c nghi1m c$a detector )ã ch5n • Tín hi1u có thA là: )" h(p th& quang, c:9ng )" phát x3, c:9ng )" hi1u )i1n th6, )" d+n )i1n, )" d+n nhi1t,… 2/8/12 10 • M=i lo3i )0u dò có 1 nguyên t!c ho3t )"ng khác nhau, nh:ng )Du phBi )3t )6n m&c )ích cuEi cùng b,ng m"t tín hi1u )i1n t2 và tín hi1u này phBi tL l1 v?i m"t sE tính ch(t c$a ch(t phân tích – VD: mJc h(p thu UV, chL sE khúc x3,… • MJc )" )áp Jng c$a )0u dò tL l1 v?i sE l:<ng m=i ch(t phân tích hi1n di1n trong h=n h<p m+u 2.5. /0u dò (detector) (tt) /0u dò l. t:Png • /" bDn cao, không làm h: h3i m+u phân tích • Có )" nh3y cao và cho k6t quB có tính l>p lai (reproducible) • Cho )áp Jng t:*ng )'ng )Ei v?i nhHng ch(t phân tích có c(u trúc t:*ng )'ng • Không thay );i khi có s- thay );i nhi1t )" ho>c áp su(t • Có th9i gian )áp Jng ng!n, )"c l#p v?i v#n tEc dòng chBy c$a dung môi giBi ly • DR s2 d&ng Phân lo3i )0u dò • Theo dõi 1 tính ch(t hóa h5c )>c tr:ng c$a các ch(t (dung môi giBi ly không có tính ch(t này), phát hi1n s- hi1n di1n c$a ch(t tan trong dòng chBy: UV, huSnh quang • Theo dõi s- hi1n di1n c$a 1 khEi v#t ch(t trong dung môi giBi ly: chL sE khúc x3, h,ng sE )i1n môi • … 2.5.1. /0u dò )o h(p thu tia t2 ngo3i (ultraviolet detector) • H1 thEng )0u dò = ngu'n sáng + thi6t bG l-a ch5n b:?c sóng + Eng quang )i1n (phototube) + Eng chJa dung dGch m+u phân tích [...]... Speak, chiDu cao peak • Th6 h1 m?i: ph0n mDm l:u thông sE: tính )Ei xJng, h1 sE phân giBi, x2 l., tính toán theo yêu c0u 14 2/8/12 CHXN /IYU KIZN S[C K\ • • • • • C"t Pha )"ng Lo3i detector ThA tích b*m m+u Nhi1t )", )" nh3y c$a detector, b:?c sóng phân tích C"t s!c k • Lo3i pha tFnh C"t s!c k C"t s!c k (tt) • C"t pha thu#n: silica gel trung tính – C"t pha thu#n – C"t pha )Bo – … • Kích th:?c... sáng trong chân không/v#n tEc ánh sáng trong môi tr:9ng • >1 – EtBr, Acridine orange, flourescein, clorua dansyl • Nh3y h*n )0u dò UV, có thA phát hi1n h . CHROMATOGRAPHY N&I DUNG • Ngun t!c • Các b" ph#n c$a HPLC • %ng d&ng c$a HPLC 1. NGUN T!C • Là phương pháp tách dựa trên 2 quá trình. Dung mơi dùng cho HPLC: h=n h<p 2 ho>c 4 lo3i – N:?c, )1m, methanol (MeOH), acetonitril (ACN), … – /" tinh khi6t cao (HPLC grade solvent),