Tập bài giảng Hóa học thực phẩm http://www.ebook.edu.vn Trang 1 CHƯƠNG I PROTEIN I. VAI TRÒ VÀ GIÁ TRỊ CỦA PROTEIN TRONG DINH DƯỠNG VÀ TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 1. Vai trò sinh học của protein Protein là thành phần không thể thiếu được của tất cả các cơ thể sống. Protein là nền tảng về cấu trúc và chức năng của cơ thể sinh vật. Dưới đây là một số chức năng quan trọng của protein. 1.1 Xúc tác Các protein có chức năng xúc tác các phản ứng gọi là enzyme. Hầu hết các phản ứng c ủa cơ thể sống từ những phản ứng đơn giản như phản ứng hydrat hóa, phản ứng khử nhóm carboxyl đến những phản ứng phức tạp như sao chép mã di truyền đều do enzyme xúc tác. 1.2 Vận tải Một số protein có vai trò như những xe tải vận chuyển các chất trong cơ thể. Ví dụ: hemoglobin, myoglobin (ở động vật có xương sống), hemoxiamin (ở động vật không xương số ng) kết hợp với oxy rồi tải oxy đến khắp mô và cơ quan trong cơ thể. Nhờ các chất tải này, mặc dù oxy có độ hòa tan trong nước thấp vẫn đảm bảo thỏa mãn được nhu cầu oxy của cơ thể. 1.3 Chuyển động Nhiều protein trực tiếp tham gia vào quas trình chuyển động như: co cơ, chuyển vị trí của nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào. Ở động vật có xương sống có sự co cơ vẫn được thực hiện nhờ chuyển động trượt lên nhau của hai loại sợi protein: sợi to chứa protein myosin và sợi mảnh chứa các protein actin, troponiosin và troponin. 1.4 Bảo vệ Các kháng thể trong động vật có xương sống là những protein đặc biệt có khả năng nhận biết và “bắt” những chất lạ xâm nhập vào cơ thể như protein lạ, virus, vi khuẩn hoặc tế bào lạ. Như vậy ở đây ta th ấy protein như những “lính gác” nhận biết được những vật lạ để loại trừ chúng ra khỏi cơ thể. Các interferon là những protein do tế bào động vật có xương sống tổng hợp và tiết ra để chống lại sự nhiễm virus, Tác dụng của các interferon rất mạnh chỉ cần ở nồng độ 10 -11 M đã có hiệu quả kháng virus rõ rệt. Interferon kết hợp vào màng nguyên sinh chất của các tế bào khác trong cơ thể và cảm ứng trạng thái kháng virus của chúng. Tập bài giảng Hóa học thực phẩm http://www.ebook.edu.vn Trang 2 Các protein tham gia trong quá trình đông máu có vai trò bảo vệ cho cơ thể sống khỏi bị mất máu. Ở một số thực vật có chứa các protein có tác dụng độc đối với động vật, ngay cả liều lượng rất thấp chúng cũng có tác dụng bảo vệ thực vật khỏi sự phá hại của động vật. 1.5 Truyền xung thần kinh Một số protein có vai trò trung gian cho phản ứng trả lời của tế bào thần kinh đối với các kích thích đặc biệt. Ví dụ: vai trò của chất màu thị giác rodopsin ở màng lưới mắt. 1.6 Điều hòa Một số protein có chức năng điều hòa quá trình truyền thông tin di truyền, điều hòa quá trình trao đổi chất. 2. Giá trị dinh dưỡng của protein - Protein là hợp phần chủ yếu, quyết định toàn bộ các đặc trưng của khẩu phần thức ăn. Chỉ trên nền tảng protein cao thì tính chất sinh h ọc của các cấu tử khác mới thể hiện đầy đủ. - Khi thiếu protein trong chế độ ăn hàng ngày sẽ dẫn đến nhiều biểu hiện xấu cho sức khỏe như suy dinh dưỡng, sút cân mau, chậm lớn (đối với trẻ em), giảm khả năng miễn dịch, khả năng chống đỡ của cơ thể đối với một số bệnh. - Thiếu protein sẽ gây ảnh hưởng xấu đến hoạt động bình thường của nhiều cơ quan chức năng như gan, tuyến nội tiết và hệ thần kinh. - Thiếu protein cũng sẽ làm thay đổi thành phần hóa học và cấu trúc hình thái của xương (lượng canxi giảm, lượng magie tăng cao). Do vậy mức protein cao chất lượng tốt (protein chứa đầy đủ các acid amin không thay thế) là cần thiết trong thức ăn cho mọi lứa tuổi. 3. Vai trò củ a protein trong công nghệ thực phẩm Ngoài giá trị sinh học và dinh dưỡng trong công nghệ sản xuất thực phẩm, protein cũng có vai trò rất quan trọng: - Protein là chất có khả năng tạo cấu trúc, tạo hình khối, tạo trạng thái cho các sản phẩm thực phẩm. Nhờ khả năng này mới có quy trình công nghệ sản xuất ra các sản phẩm tương ứng từ các nguyên liệu giàu protein. Ví dụ: nhờ có protein của tơ cơ ở thị t, cá mới tạo ra được cấu trúc gel cho các sản phẩm như chả giò,…. Công nghệ sản xuất bánh mì là dựa trên cơ sở tính chất tạo hình, tính chất cố kết và tính chất giữ khí của hai protein đặc hữu trong bột mì là gliadin và glutenin. Tập bài giảng Hóa học thực phẩm http://www.ebook.edu.vn Trang 3 Nhờ có các protein hòa tan của malt mà bọt CO 2 (một thành tố quan trọng của chất lượng bia) trong bia mới giữ được bền. Nhờ tính chất đặc thù casein trong sữa mới chế tạo ra được 2000 loại phomat hiện nay trên thế giới. Gelatin của da có khả năng tạo ra gel và giữ gel bền bằng liên kết hydro nên mới có công nghệ tạo ra màng để bọc kẹo và bao các viên thuốc (mà khi cho vào miệng thì với nhiệt độ cơ thể đủ để phá vỡ liên kết hydro và gel tan chả y. - Protein còn gián tiếp tạo ra chất lượng cho các thực phẩm Các acid amin (từ protein phân giải) có khả năng tương tác với đường khi gia nhiệt để tạo ra được màu vàng nâu cũng như hương thơm đặc trưng của bánh mì gồm 70 cấu tử thơm. Các protein còn có khả năng cố đinh mùi tức là khả năng giữ hương được lâu bền cho các thực phẩm. II. ACID AMIN 1. Công thức chung Định nghĩ a: Acid amin là những hợp chất hữu cơ mạch thẳng hoặc mạch vòng mà trong phân tử có chứa ít nhất một nhóm amin (-NH 2 ) và một nhóm carboxyl (- COOH). 2. Phân loại acid amin Có nhiều cách phân loại các acid amin. Tuy nhiên do mạch R là yếu tố quyết định các tương tác nội phân tử và tương tác giữa các phân tử nên người ta thường dựa vào tính chất của gốc R để phân loại các acid amin thành: Tập bài giảng Hóa học thực phẩm http://www.ebook.edu.vn Trang 4 Những acid amin có gốc R không phân cực và không tích điện: isoleucine, leucine, methionine, phenyl-alanine, proline, valine, tryptophan, glycine, alanine trong đó ba acid amin cuối mang tính trung gian giữa không phân cực và phân cực trung tính, có đọ hoà tan kém hơn các acid amin phân cực. Hoạt tính kỵ nước tăng khi chiều dàu của gốc R tăng. Các acid amin có gốc R phân cực nhưng không tích điện, có các nhóm chức trung tính và phân cực, có khả năng tạo các lien kết hydro với một số phân tử như nước. Sự phân cực của serine, threonine, tyrosine là do nhóm –OH, của asparagines, glutamine là do nhóm amide (CO-NH 2 ), của cystein là do nhóm –SH. Các acid amin có gốc R tích điện dương ở pH ≈ 7 như histidine, lysine (do nhóm ε- NH 2 ) và arginine (do nhóm guanidin). Các acid amin có gốc R tích điện âm ở pH ≈ 7 do các nhóm carboxyl –COOH như acid aspartic và acid glutamic. Dựa trên giá trị dinh dưỡng và vai trò sinh lý, người ta chia các acid amin thành nhóm không thay thế: valine, leucine, isoleucine, phenyl-alanine, tryptophan, methionine, threonine, histidine; bán thay thế: lysine, arginine và acid amin thay thế: glycine, alanine, proline, serine, cystein. Tyrosine, asparagines, glutamine, acid aspartic và acid glutamic. 3. Tính chất của acid amin 3.1 Tính chất vật lý - Sự phân ly của acid amin Acid amin có nhóm carboxyl (-COOH) thể hiện tính acid (cho proton), đồng thời có nhóm amin (-NH 2 ) thể hiện tính bazơ (nhận proton) Mọi acid amin trong dung dịch nước, pH trung tính sẽ tồn tại ở dạng: Ctct Tuỳ thuộc vào điều kiện pH, trong dung dịch nước acid amin có thể ở dạng cation, anion hoặc trung tính. Quá trình này đặc trưng bởi hằng số phân ly pK, điểm đẳng điện pI. Như vậy, acid amin là các phân tử mang tính lưỡng tính. Ở điểm đẳng điện pI, tổng điện tích của các acid amin trong dung dị ch bằng 0. - Cấu trúc và hoạt tính quang học Tất cả các acid amin trong protein đều các cấu hình không gian dạng L. Acid amin dạng D ít phổ biến tuy cũng xuất hiện trong tự nhiên ở một số peptide của vi sinh vật. Acid amin dạng D không được tiêu hoá trong cơ thể người. Hiện tượng quay quang học và góc quay của acid amin trong dung dịch phụ thuộc vào pH và nhiệt độ. Acid Tập bài giảng Hóa học thực phẩm http://www.ebook.edu.vn Trang 5 amin dạng D có thể được tạo ra trong quá trình tổng hợp hoá học hoặc trong các quá trình chế biến thực phẩm. Để loại acid amin dạng D, người ta thường kết tinh chọn lọc các L acid amin bằng phương pháp enzyme hoặc phương pháp sắc ký. - Độ hoà tan Độ hoà tan trong nước của các acid amin rất khác nhau. Proline, hydroxyl-proline, glycine, alanine tan tốt trong dung dich, cystein và tyrosine hầu như không tan còn các acid amin khác có độ hoà tan thấp. Thêm acid hoặc bazơ có thể làm tăng độ hoà tan của acid amin, acid amin trong hợp phần với các acid amin khác tan tốt hơn khi chỉ có riêng một mình. Độ hoà tan của acid amin trong dung môi hữu cơ thấp do chúng có tính phân cực. Tất cả các acid amin đều không tan trong eter, một số ít tan trong ethanol. 3.2 Tính chất hoá học Phản ứng của nhóm carboxyl α-COOH Phản ứng ester hoá Đây là phản ứng được sử dụng để bảo vệ các nhóm –COOH trong quá trình tổng hợp peptide. Các ester tự do của acid amin có xu hướng tạo vòng di-peptide hoặc polypeptide mạch hở. R-COOH + R ’ -OH Phản ứng khử Được sử dụng để nhận dạng acid amin ở đầu mạch protein. Pt Phản ứng khử carboxyl (phản ứng decarboxyl hoá) Phản ứng này có thể xảy ra dưới tác dụng của enzyme, nhiệt, acid hoặc kiềm Pt Phản ứng tạo amide Acid amin phản ứng với NH 3 để tạo thành các amide. Asparagine và glutamine là những amide của acid aspartic và glutamic có mặt trong thành phần của protein. Pt Phản ứng tạo peptide Pt Phản ứng của nhóm amine α-NH 2 Tập bài giảng Hóa học thực phẩm http://www.ebook.edu.vn Trang 6 Một trong những phản ứng đặc trưng nhất của nhóm amin là sự tác dụng tương hỗ với ninhydrin. Đây là phản ứng có thể sử dụng để định lượng acid amin có trong dung dịch ở nồng độ không lớn lắm. Khi pH của phản ứng cao hơn 5 thì quá trình xảy ra hai giai đoạn: Giai đoạn một: ninhydrin khử được tạo thành do sự desamin hóa oxy hóa acid amin, đồng thời xảy ra sự khử CO 2 của nó: Ptpu Giai đoạn hai: NH 3 được tạo thành ở giai đoạn trên phản ứng với lượng tương đương mol của ninhydrin oxy hóa và ninhydrin khử, tạo nên sản phẩm màu tím xanh, có bước sóng hấp thu cực đại là 580nm. Cường độ màu tỷ lệ thuận với lượng acid amin có trong dung dịch. Proline và oxyproline có các nhóm α-amin thay thế, chúng tạo với ninhydrin những dẫn xuất nhuộm màu vàng (bước sóng hấp thu cực đại ở 440nm) và không tạo NH 3 . Người ta ứng dụng phản ứng với ninhydrin trong sắc ký để phát hiện các acid amin, để định lượng acid amin bằng cách đo độ màu của nó qua máy phân tích tự động. Phản ứng với fomaldehyde Khi thêm một lượng dư formaldehyde trung tính vào dung dịch acid amin thì formaldehyde sẽ tác dụng với nhóm –NH 2 của acid amin. Nhờ phản ứng này, nhóm α- NH 2 bị kìm hãm do đó mà ta có thể định lượng acid amin bằng chuẩn độ nhóm – COOH bằng NaOH chuẩn. ptpu III. PEPTIDE Peptide là những protein gồm từ hai đến vài chục acid amin nối với nhau bằng liên kết petide và có trọng lượng phân tử nhỏ hơn 6000 D. Trong tự nhiên dưới dạng tự do với hoạt tính sinh học nhất định hoặc chúng là sản phẩm thủy phân dở dang của protein. Peptide đơn giản thường có 2,3,4 gốc acid amin (số acid amin nhỏ hơ n 10). Theo quy ước một mạch peptide có hai đầu tận cùng: Đầu N tận cùng bên trái và đầu C tận cùng bên phải. Peptide được tạo thành từ các acid amin qua liên kết –NH-CO- (liên kết peptide). Khi thủy phân peptide thu được các acid amin. CTCT Tập bài giảng Hóa học thực phẩm http://www.ebook.edu.vn Trang 7 Liên kết peptide được tạo nên từ nhóm –COOH của acid amin đầu kết hợp với nhóm – NH 2 của acid amin sau và tách ra một phân tử nước. Đặc điểm cấu tạo của liên kết peptide: Các nguyên tử tham gia cấu tạo liên kết peptide không phân bố theo đường thẳng mà tạo góc. Tất cả 4 nguyên tử của liên kết peptide (C, H, O, N) và 2 nguyên tử carbon α nằm trên một mặt phẳng. Oxy của nhóm carboxyl và hydro của NH 2 của liên kết peptide thường xuyên ở dạng trans và dạng trans bền hơn dạng cis 2 Kcal/mol. Cấu tạo Các acid amin trong phân tử peptide nối với nhau bằng liên kết peptide. Đây là liên kết cơ bản nhất trong phân tử peptide và protein. Bản chất của nó là liên kết amid (liên kết đồng hóa trị) tức là liên kết được tạo do sự kết hợp giữa nhóm α – COOH của acid amin này với nhóm α – NH 2 của acid amin kia loại đi một phân tử nước. Cách gọi tên Gọi tên theo acid amin - Dipeptide (2 acid amin) - Tripeptide (3 acid amin) - Polypeptide chỉ các peptide có 10 acid amin trở lên nhưng cách gọi tên peptide theo các gốc acid amin. Bắt đầu từ acid amin N tận, lần lượt tới acid amin C tận. Theo nguyên tắc giữ nguyên C tận, thay đuôi tận các acid amin khác bằng đuôi –yl. Ví dụ: Chuỗi peptide gồm các acid amin sau: Alanine – Serine – Methionine – Valine – Glycine Để biểu thị thành phần và thứ tự các acid amin trong phân tử peptide: Trước hết dùng ký hiệu 3 chữ (hoặc 1 chữ nếu chuỗi polypeptide dài) của acid amin viết liền nhau theo thứ tự đã được xác định từ acid amin N tận đến acid amin C tận. Ví dụ: Seryl – Glycyl – Tyrosyl – Alanine Ser – Gly – Tyr – Ala Tính chất của peptide Tập bài giảng Hóa học thực phẩm http://www.ebook.edu.vn Trang 8 Tính chất vật lý Trong dung dịch nước, tùy thuộc vào pH, các peptide có thể phân ly ở dạng cation, anion hoặc trung tính với hằng số phân ly đặc trưng pK và điểm đẳng điện pI. Có thể dùng phương pháp điện di để xác định thành phần các acid amin trong chuỗi peptide. Tính chất cảm quan Ngoại trừ dipeptide của acid amin aspartic có vị ngọt, các peptide còn lại có vị đắng hoặc không vị. Vị của peptide không phụ thuộc vào cấu hình D hoặc L. Cường độ vị cũng phụ thuộc vào tính kỵ của các đoạn mạch R và không phụ thuộc vào trình tự của acid amin. Vị đắng của peptide có thể xuất hiện khi thủy phân một phần protein (phomat khi chín chưa hoàn hảo có thể bị đắng). Cần chú ý khi sử dụng protein trong biến tính protein. Hóa tính Peptide cho phản ứng màu Biure, có thể định lượng phức màu Biure bằng quang phổ kế. Các nhóm α – NH 2 , α – COOH của peptide có tính chất giống như acid amin tự do trong mạch R, tính chất acid, bazơ của peptide thấp hơn so với acid amin tự do. VI. PROTEIN Định nghĩa Protein được tạo thành từ hàng trăm đến hàng ngàn các acid amin nối với nhau bằng liên kết peptide, có trọng lượng phân tử lớn hơn 6000. Liên kết peptide là liên kết chủ yếu của protein, ngoài ra trong phân tử protein còn có các liên kết khác như liên kết cầu disulfite S-S, liên kết hydro… Hình dạng Có 2 loại: protein hình sợi và protein hình cầu Protein hình sợ i: thường gặp ở keratin của bông, fibroin của tơ, myosin của cơ. Những protein hình sợi chúng có chiều dài gấp hàng trăm hàng ngàn chiều rộng. Đa số các protein này không tan trong nước và dung dịch muối loãng. Các chuỗi polypeptide của protein hình sợi nằm dọc theo một trục thành những sợi dài. Protein hình cầu có tỷ lệ trục lớn trên trục nhỏ b/a khoảng 4.3 đến 20.1. Protein hình cầu thường gặp trong albumin của trứng, globin của sữa, hemoglobin của huyết thanh. Các protein này th ường tan trong nước hoặc dung dịch muối loãng. Trong một điều kiện nhất định protein hình cầu chuyển thành protein hình sợi và ngược lại. Tập bài giảng Hóa học thực phẩm http://www.ebook.edu.vn Trang 9 Cấu trúc phân tử protein Cấu trúc của protein được xác định dựa trên hai đặc tính chủ yếu: bản chất, vị trí của các acid amin trong mạch polypeptide (gốc R của acid amin); các tính chất hóa học và hình học của liên kết peptide. Sáu nguyên tử gồm hai Cα gần nhau, nhóm C=O và –NH liên kết với nhau và cùng nằm trong một mặt phẳng với cấu hình kiểu trans. Sự chuyển vận liên hợp điện tử đưa đến sự phân cực đi ện và xuất hiện điện tích (+) ở H (nhóm NH) và điện tích (-) ở O (nhóm C=O). Các nguyên tử này có xu hướng tạo nên liên kết hydro (hydrogen bond) với các phân tử của các liên kết khác. Các liên kết hydro đóng vai trò quan trọng đối với cấu trúc bậc 2 của protein như xoắn kép α, tấm xếp gấp β và cả đối với cấu trúc bậc 3. Trong dung dịch nước, các liên kết hydro có thể tạo thành giữa phân tử protein với các phân tử nước và đóng vai trò nh ất định đối với tính hòa tan của một số protein. Cấu trúc bậc 1 Cấu trúc bậc 1 được hiểu là số lượng và trình tự các acid amin trong mạch polypeptide và vị trí của các liên kết disulfide. Liên kết cơ bản của cấu trúc bậc một trong protein là liên kết peptide. Liên kết này khá nghiêm ngặt nên tính linh động cấu hình bị hạn chế. Liên kết peptide là liên kết bền vững nên khó bị bẻ gãy và phá vỡ so với các liên kết khác trong chuỗi protein. Mạch peptide có nhóm amin tự do trên m ột đầu (đầu N) còn đầu kia là nhóm carboxyl (đầu C). Cấu trúc bậc 1 là cấu trúc thẳng là cấu trúc cơ sở của protein. Tính chất đặc trưng của từng loại protein phụ thuộc vào cấu trúc bậc 1. Quan trọng là trình tự sắp xếp giữa các acid amin. Trình tự này do AND quyết định. Nếu thay đổi trình tự sắp xếp sẽ dẫn đến những rối loạn về sinh lý. Giáo trình sinh hóa – Phạm Thu Cúc Cấu trúc bậc 1 được hi ểu là số lượng và trình tự các acid amin trong mạch polypeptide. Một số protein đã biết rất ngắn (như glucagon, secretin) chỉ chứa 20 – 100 acid amin; đa phần các protein chứa từ 100 – 500 acid amin; chỉ có rất ít acid amin chứa vài ngàn gốc acid amin. Liên kết peptide rất bền (400J/mol), do đó để phân cắt liên kết này bằng thủy phân cần nhiều năng lượng và xúc tác hoặc thời gian dài. Xác định trình tự acid amin của protein Trình tự acid amin được phân tích sau khi thủy phân bằng acid hoặc sau khi chuyển thành các dạ ng dẫn xuất của acid amin và xác định các dẫn xuất đó. Tập bài giảng Hóa học thực phẩm http://www.ebook.edu.vn Trang 10 Trọng lượng phân tử (MW) của protein có thể được xác định bằng phương pháp sắc ký, siêu lọc, hoặc SDS-Page (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacryamide). Protein có thể chứa một chuỗi polypeptide hoặc nhiều chuỗi liên kết với nhau qua các cầu disulfide hoặc các liên kết không đồng hóa trị. Thông thường, chúng sẽ gây biến tính bằng cách thay đổi pH, nhiệt độ, gây biến tính bằng các tác nhân hóa học như SDS, guanidine hydrochloride. Hóa học thực phẩm – Hoàng Kim Anh Cấu trúc bậc 2 Cấu trúc bậc 2 là sự tươ ng tác không gian giữa các acid amin gần nhau trên cùng một mạch polypeptide hoặc trên hai chuỗi polypeptide khác ở kề nhau. Do các nguyên tử carbon α có thể quay tự do xung quanh trục tạo thành bởi các liên kết đồng hóa trị đơn làm cho chuỗi polypeptide có rất nhiều hình thể. Tuy nhiên trong những điều kiện bình thường, đặc biệt là pH và nhiệt độ thì một chuỗi protein có một hình thể đặc trưng gọi là hình thể tự nhiên. Về phương diện nhiệt động học, hình thể tương ứng với một hệ thống bền, có tổ chức và có năng lượng tự do là cực tiểu. Đương nhiên, để có được một hình thế như thế là tùy thuộc vào độ có cực, độ kỵ nước và độ cồng kềnh không gian của các mạch bên R. Trong các protein, người ta đã phát hiện thấy các cấu trúc bậc 2 chủ yếu sau: - Cấu trúc xoắn ốc: xoắn α, xoắn γ - Cấ u trúc gấp nếp β: cấu trúc tờ giấy xếp, cấu trúc mặt cong β. Cấu trúc xoắn α Cấu trúc xoắn α là cấu trúc có trật tự, rất bền vững, tương tự như lò xo. Mỗi vòng xoắn ốc có 3,6 gốc acid amin (18 gốc thì tạo được 5 vòng). Các nguyên tử carbon α nằm trên đường sinh của hình trụ. Các mạch bên R hướng ra phía ngoài. Xoắn ốc α được giữ chặt bởi mộ t số liên kết hydro tối đa. Các liên kết hydro gần như song song với trục của xoắn ốc và nối nhóm –NH- của liên kết peptide này với nhóm –CO- của liên kết peptide thứ ba kề đó. Cứ mỗi nhóm –CONH- tạo được 2 liên kết hydro với hai nhóm –CONH- khác. Xoắn α rất phổ biến trong mọi protein. Có protein có tỷ lệ xoắn lên đến 75% như trong hemoglobin và myoglobin nhưng cũng có protein có tỷ lệ xoắn rất thấp. Cấu trúc gấp n ếp β Cấu trúc gấp nếp β là một cấu trúc hình chữ chi. Xoắn α có thể chuyển thành cấu trúc gấp nếp β khi không còn các liên kết hydro.