Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất

Thông tin tài liệu

1 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vi nấm (Fungi) độc tố vi nấm (Mycotoxin) vấn đề quan trọng công tác bảo quản nông sản, thực phẩm y tế Gần 400 độc tố vi nấm phát [18], đó, aflatoxin độc tố quan tâm nghiên cứu nhiều Aflatoxin tên gọi nhóm chất độc, sản phẩm trình trao đổi chất số loài nấm mà chủ yếu loài Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus… Trong đó, phổ biến độc aflatoxin B1, G1, B2 G2, gây bệnh mức vi lượng Đối với động vật nuôi (gà, vịt, lợn…), aflatoxin gây bệnh nhiễm độc Aflatoxicosis, phổ biến, đặc biệt nước nhiệt đới Bệnh làm vật nuôi phát triển, sức sản xuất giảm, dễ mẫn cảm với bệnh truyền nhiễm, bị ung thư chí bị chết Do đó, hiệu kinh tế chăn nuôi bị ảnh hưởng nghiêm trọng, chịu nhiều tổn thất lớn Đối với người, đáng ý khả gây ung thư gan dị tật thai aflatoxin nhiễm từ sữa mẹ truyền cho Aflatoxin có ảnh hưởng nghiêm trọng lại khó để loại bỏ aflatoxin diện khắp nơi mơi trường lại khó bị phân huỷ nhiệt Do vậy, việc nghiên cứu tìm phương pháp phân tích tối ưu nhằm phát aflatoxin thực phẩm nguyên liệu thực phẩm điều cần thiết Quy trình phân tích aflatoxin thường phải qua nhiều giai đoạn chiết xuất, làm sạch, cô đặc, với việc định tính định lượng aflatoxin phương pháp như: sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng (TLC), sắc kí lỏng cao áp (HPLC) dễ bị sai số phải qua nhiều thao tác, tăng thất cơng đoạn Trước khó khăn trên, sắc kí lực miễn dịch (immuno-affinity chromatography-IAC) đời, sử dụng công đoạn tinh cô đặc mẫu đồng thời, dựa nguyên lí gắn kết đặc hiệu kháng nguyên kháng thể, tạo khả chọn lọc cao mà phương pháp khác khơng có được; quy trình chiết tinh chế aflatoxin phương pháp IAC lại đơn giản đáp ứng nhu cầu độ tin cậy cao kết phân tích Trong số aflatoxin, aflatoxin B1 ý nhiều diện rộng khắp tính độc ngắn hạn dài hạn aflatoxin B1 cao nhiều so với aflatoxin khác Từ sở trên, viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh tiến hành thực đề tài Sản xuất giá lực miễn dịch bắt aflatoxin B1 Giá (cột) sắc kí lực tạo nên cho hiệu cao phân tích định lượng aflatoxin B1 Bên cạnh đó, aflatoxin G1 độc tố vi nấm đứng sau aflatoxin B1 độc tính, có khả gây hại cao cho người vật ni, cấu trúc hố học lại tương đồng với aflatoxin B1 nên đối tượng quan trọng cần tiến hành nghiên cứu Được phân công Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, hướng dẫn PGS TSKH Nguyễn Lê Trang - Viện Pasteur, Tp Hồ Chí Minh TS Nguyễn Ngọc Hải, tơi tiến hành đề tài “Đánh giá khả bắt aflatoxin G1 cột lực miễn dịch Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất” 1.2 Mục đích Khảo sát khả bắt aflatoxin G1 cột lực miễn dịch 1.3 Yêu cầu Xác định đặc tính cột lực miễn dịch việc bắt aflatoxin G1: • Độ nhạy cột • Độ lặp lại cột Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cương aflatoxin 2.1.1 Lịch sử phát Năm 1960 Anh, vụ dịch bệnh xảy làm chết 100.000 gà tây con, mổ xác thấy có xuất huyết hoại tử gan kèm tổn thương thận mà nguyên nhân khơng biết rõ Do đó, người ta gọi bệnh “X” gà tây Sau đó, vụ tương tự quan sát thấy vịt Áo, gà giò Tây Ban Nha, cá hồi Mỹ, trĩ Uganda…Các nhà bác học nhanh chóng tìm mối liên hệ vụ ngộ độc với việc cho ăn khơ dầu đậu phộng họ thấy bệnh xảy gia cầm mà với gia súc, đặc biệt heo, bê, cừu… Với cố gắng phát nguồn độc tố thực phẩm có liên quan, nhà bác học quan sát phân lập loài vi nấm Aspergillus flavus hạt đậu mốc lúa mì mốc Việc tinh chế độc tố từ loại hạt bị nhiễm nấm Aspergillus cho loại hợp chất mà báo cáo Forgacs Carl xuất năm 1962, người ta gọi aflatoxin (A: Aspergillus, fla: flavus toxin có nghĩa chất độc) Đến nay, aflatoxin biết sản phẩm trao đổi chất thứ cấp qua đường polyketide số loài nấm thuộc chủng Aspergillus flavus (khoảng 50% chủng), Aspergillus parasiticus (100% chủng) (Klick Pitt, 1988)[4], Aspergillus nomius; ngồi cịn có Penicillium spp, Rhizopus spp có vai trị gây bệnh thực tế Ở A flavus A parasiticus, đường sinh tổng hợp aflatoxin liên quan 16 phản ứng enzyme mã hóa 25 gen tập trung thành nhóm vùng DNA 70 kilobase nhiễm sắc thể [19] (1) (2) Hình 2.1: A flavus (1) [20] A parasiticus (2) [21] Việc khám phá aflatoxin kích thích nhà khoa học nhiều ngành tập trung nghiên cứu tất mặt aflatoxin ảnh hưởng tới sức khoẻ người động vật 2.1.2 Phân loại Có thể nói Sargeant (1962) người có cơng xác định độc tố Chúng chất có cấu trúc hố học gần có khung hố học giống với dẫn xuất cumarin nên gọi flavacumarin Phân tử aflatoxin gồm gốc cumarin, nhân furan vòng lacton [11] Hiện người ta biết có đến 20 loại aflatoxin (Quinn, 1998)[4] Các aflatoxin sản xuất tự nhiên gồm loại, kí hiệu AFB1, AFB2, AFG1 AFG2 (được gọi tên tính chất phát huỳnh quang tia UV: B: Blue; G: Green) Aflatoxin nhóm B nhóm G khác chỗ nhóm B có nhóm chức lacton nhóm G có chức lacton O O F O L P C O AFB1 O O OMe O F O O O L C O AFG1 OMe F: Vòng furan C: Vòng cumarin L: Vịng lactone P: Vịng pentenone Hình 2.2: Cấu trúc hố học AFB1 AFG1 Các loại aflatoxin khác chuyển hoá aflatoxin nấm thể động vật  AFB2 AFG2 dẫn xuất hydro hoá AFB1 AFG1  AFB2a AFG2a dẫn xuất hemiacetal AFB1 AFG1  AFM1 AFM2 dẫn xuất AFB1 AFB2 tìm thấy sữa, thận gan động vật  Ngoài ra: AFGM1, AFGM2, AFM2a, AFGM2a, AFB3 (parasiticol), dihydroaflatoxin B3, Ro (aflatoxicol), dihydoaflatoxicol, AFP1, AFQ1… O O O O O O O OMe O OMe AFG2 O O O O O OMe AFB2a O O O O O OH O O AFB2 HO O O HO O OH OMe OMe AFG2a O O O O O O AFM1 O O O OMe AFM2 Hình 2.3 : Cấu trúc hố học aflatoxin 2.1.3 Tính chất hóa lí Aflatoxin dễ bị huỷ chất kiềm, tương đối bền với nhiệt Ở nhiệt độ cao 100oC khử phần aflatoxin Aflatoxin tan nước, tan dung môi phân cực như: chloroform, acetonitril, aceton, methanol… Aflatoxin không tan dung mơi hịa tan chất béo n-hexan, ether ethylic, ether dầu hoả… Hầu hết loại aflatoxin phát huỳnh quang khoảng bước sóng 440 nm kích thích ánh sáng có độ dài sóng khoảng 365 nm [10] Các đặc tính lí hóa trình bày phụ lục 2.1.4 Tác động sinh học Aflatoxin chất độc nguy hiểm loài gia súc, gia cầm người Tuy nhiên, mức độ độc hoàn toàn khác nhau, phụ thuộc vào giống loài, lứa tuổi, giới tính, đường xâm nhập, trạng thái sức khoẻ thể, môi trường hàm lượng chất độc ăn phải Hấp thu qua đường tiêu hoá giai đoạn xâm nhập AFB1 vào thể với kiểu hấp thu qua niêm mạc ruột: khuyếch tán, hoà tan lipid vận chuyển nhờ protein mang Sau đó, AFB1 vận chuyển hệ tuần hoàn nhờ liên kết với tế bào máu protein huyết tương (90% dạng liên kết với albumin) Sau vào gan qua hệ thống tĩnh mạch cửa, AFB1 tập trung chủ yếu gan [11] Tại đây, AFB1 có chuyển hóa phức tạp: O O DNA adducts O H O OH O O O O AFB1-8,9-epoxide O O O O O O AFB1-dhd OMe O Protein adducts O O O O O O O OMe O OH OMe O AFB1 O O HO O Aflatoxicol O HO HO O OMe O CH3 O AFP1 O O O GLUCURONIDE Conjugates O O OH OMe O O AFM1 AFB2a OMe O O OMe AFQ1 Milk Hình 2.4: Các sản phẩm chuyển hố cuả AFB1 [13] Các chất chuyển hóa thể cố gắng thải, như: AFM1 AFM2 qua sữa; AFP1 AFQ1 qua nước tiểu Đáng kể, xúc tác hệ enzyme monooxygenase cytochrome P450 (CYP 450) phong phú tế bào gan, chất tạo thành AFB1-8,9-epoxide coi chất biến dưỡng có hoạt tính cao, gắn với đaị phân tử (DNA, RNA protein) làm rối loạn hoạt động bình thường tế bào (Swenson, 1975) 2.1.4.1 Độc tính cấp aflatoxin Nhiễm độc cấp tính ăn phải lượng lớn aflatoxin Thú non mẫn cảm thú trưởng thành, gia cầm mẫn cảm gia súc, biểu theo thứ tự sau: Vịt > gà tây > ngỗng > ngan > gà > chó > heo > bị > ngựa > cừu (Allcroft, 1962) [11] Tính gây độc cấp thể qua liều gây chết 50% (LD50) Bảng 2.1: LD50 AFB1 cho uống lần động vật (Ciegler, 1975) [2] Loài động vật LD50 (Xếp theo thứ tự (mg/ kg thể trọng) mẫn cảm) Vịt Heo Cá hồi Chó Chuột lang Cừu Khỉ Chuột cống Gà Chuột bạch 0,3-0,6 0,6 0,8 1,0 1,4-2,0 2,0 2,2 5,5-17,9 6,3 9,0 Theo bảng bảng xếp loại độc chất dựa vào liều LD50 động vật (xem phụ lục 2), thấy aflatoxin thuộc nhóm độc tố cực độc Triệu chứng nhiễm độc thể qua tổn thương gan triệu chứng thần kinh nằm liệt co giật Chết xảy đột ngột sau thời gian ngắn, thường 72 Giải phẫu bệnh cho thấy hoại tử chảy máu nhu mô gan, viêm tiểu cầu thận cấp, tụ máu phổi [11] Nguyên nhân gây chết gan bị huỷ hoại nhanh (necrosis) theo chế phân tử: O O O O O enzyme O O OMe HO Gan HO AFB1 O O AFB1-dhd acid R2 N C=O O H OH H H O R1 C N C H R3 CH N R4 N C=O H O O O O Shiff's base OMe base (pH=7,4) O H OH O C H O protein C H OMe O CH O OMe Di-aldehyd resonance hybrid Hình 2.5: Cơ chế tác dụng AFB1 mức tế bào gan (Cliford and Rees, 1967) [5] Ở đây, nhóm Dialdehyd phản ứng với nhóm amin protein để tạo thành kiềm Shiff (Shiff’s base) Các kiềm Shiff ức chế sinh tổng hợp DNA, RNA dẫn đến ngăn cản tổng hợp protein làm cho hoạt động gan bị rối loạn tạo nên tình trạng nhiễm độc cấp tính Như vậy, AFG1 tạo thành kiềm Shiff mang liên kết đơi vị trí 8,9 đầu vịng furan Liên kết bão hồ cấu trúc AFB2 AFG2, đó, khơng thể trực tiếp tạo thành kiềm Shiff nên mang tính độc so với AFB1 AFG1[5] 2.1.4.2 Độc tính mãn Thường xảy nhiều so với nhiễm độc cấp tính có tác động dài thể chịu đựng mức phần Khi có nhiễm độc mãn tính, triệu chứng thấy ăn chậm lớn; gan chịu ảnh hưởng nhiều nhất: gan tụ huyết, xuất huyết Khi kiểm tra vi thể xuất thối hố tế bào biểu mơ, thối hố mỡ gan, tế bào lympho bị thâm nhiễm Nhiễm độc kéo dài gây đột biến, ung thư gan Nếu nhiễm aflatoxin thời kì mang thai, thai bị tật, chết sinh quái thai (Nguyễn Lê Trang, 2003) [2] Năm 1988, IARC xếp AFB1 vào danh sách tác nhân gây ung thư cho người, đặc biệt ung thư gan [22] Nếu hấp thu 2,5 mg aflatoxin 89 ngày thấy xuất ung thư gan sau năm Tại Việt Nam có cơng trình nghiên cứu tìm aflatoxin dịch cổ trướng bệnh nhân ung thư nguyên phát có hàm lượng từ 1,1 – 3,5 ppb [13] Cơ chế phân tử nhiễm độc mãn tính: OMe O O O O DNA O O O OMe AFB1-8,9-exo epoxide O O OH O OH O3PO + N HN H2N O O O AFB1-N7-Gua AP Site N N OMe O - O3PO OPO3 O OPO3 AFB1-N7-Gua DNA Adduct O O O O H2N AFB1-FAPY DNA Adduct OH N HN H N N O CHO O - O3PO OPO3 Hình 2.6: AFB1-8,9-epoxide gắn vào DNA (Smela ctv, 2001) [14] AFB1-8,9-epoxide gắn kết đồng trị lên DNA vị trí N7 guanine Do cầu nối glycoside ổn định, nhóm purine bị tách khỏi DNA Hoặc khả khác vòng imidazole cấu trúc purine bị mở thành cấu trúc formamidopyrimidine (AFB1-FAPY) ổn định tồn điều kiện sinh học Các điểm đột biến AFB1 thường nhận thấy đảo chuyển GC TA (dị hoán) Điểm nóng đột biến phát vị trí thứ ba đơn vị mã (codon) 249 gen p53 Gen mã hoá cho phosphoprotein có hoạt tính tăng cường kiềm chế phiên mã số gen có chức kiểm sốt chu trình nhân lên tế bào, để ngăn ngừa tế bào tăng sinh thành tổ chức bất thường, dẫn đến hình thành u Khi cấu trúc DNA bị biến đổi, tế bào phản ứng lại cách thể nhiều phosphoprotein p53 để ức chế chép DNA bị biến đổi Nếu thời gian sửa chữa lại DNA kịp 10 thời (do số enzyme) trước DNA biến đổi chép, bảo tồn di truyền ổn định Các chất độc di truyền tác động trực tiếp hay gián tiếp làm tăng mức protein p53 tế bào Khi AFB1 tác động vào gen p53 làm protein p53 bị biến đổi, hoạt tính, hậu tế bào tăng trưởng khơng kiểm sốt dẫn đến hình thành khối u (Bennett Klich, 2003) [14] Liên quan nhiễm siêu vi viêm gan B (HBV), ung thư tế bào gan vai trò p53 khảo sát nghiên cứu nhiều Với bệnh nhân nước tiểu có AFB1-N7-Gua, tỉ lệ phát ung thư tế bào gan cao lần so với trường hợp âm tính Với bệnh nhân có kháng nguyên bề mặt HbsAg huyết thanh, tỉ lệ lần cao bệnh nhân âm tính HbsAg Và xuất AFB1N7-Gua HbsAg, tỉ lệ cao gấp 60 lần [14] 2.1.5 Sự diện aflatoxin thực phẩm Theo tài liệu FAO, khơng có thực phẩm xem an toàn tuyệt đối khỏi nhiễm độc tố vi nấm, nhiễm độc tố xảy giai đoạn từ lúc trồng cịn ngồi đồng đến thu hoạch, chế biến, bảo quản vận chuyển Và theo ước tính FAO, 25% sản phẩm nông nghiệp giới bị nhiễm độc tố vi nấm [4] Hầu hết số liệu liên quan cho thấy nhiễm aflatoxin thường xảy đậu phộng sản phẩm từ đậu phộng, bắp loại hạt khác gạo, lúa mì, đậu nành, hạt vải… Theo Carlos A Muro-Cacho (2004), tiêu thụ aflatoxin người từ – 30000 ng/kg/ngày, trung bình từ 10 – 200 ng/kg/ngày [15] Nước ta có điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm thích hợp cho phát triển vi nấm sản sinh độc tố thực phẩm, aflatoxin Do đó, vấn đề an toàn thực phẩm đặt nhằm hạn chế thiệt hại kinh tế (gây chết đàn vịt, gà, lợn…) bảo đảm an toàn thực phẩm cho người, dạng chuyển hóa aflatoxin cịn độc tính diện gan, sữa, trứng, thức ăn ngày người 2.1.6 Giới hạn hàm lượng aflatoxin thực phẩm thức ăn gia súc Aflatoxin diện thực phẩm nhiễm bẩn tự nhiên nên người khơng thể kiểm sốt để ngăn chặn chúng Dựa vào nhiều yếu tố như: số liệu giám sát, phân bố aflatoxin thực phẩm, liệu độc chất học, phương pháp phân tích tiêu chuẩn cho phép quốc gia có quan hệ mua bán với mà quốc gia, khu vực giới quy định giới hạn hàm lượng aflatoxin tổng cộng tối đa cho phép loại thực phẩm thức ăn gia súc khác 22 CNBr – activated Sepharose 4B (Amersham Pharmacia BiotechAB) g gel khô trương phồng thành 3,5 ml gel Rửa gel với dung dịch (7), thể tích 200 ml dung dịch/ g gel • Cộng hợp IgG vào Sepharose Cho dung dịch IgG vào gel rửa (từ 2,5 đến 10 mg IgG/ ml gel), để nhiệt độ phòng hay qua đêm 4oC Lấy dịch đo hấp phụ quang λ= 280 nm Rửa lại với đệm (3) Bất hoạt nhóm -C ≡ N+ lại với đệm (4) Rửa với đệm (5) Lần cuối rửa với dung dịch (6) 4oC - 8oC • Nén cột Rửa frit cột ethanol Nén miếng frit vào đáy cột Cho gel cộng hợp IgG vào cột Cho dung dịch (6) vào cột Bảo quản 4oC 3.3.1.2 Phương pháp quang phổ kế để xác định nồng độ AFG1(theo Nollet, 1992) • Nguyên tắc: Photon ánh sáng vùng tử ngoại đèn nguồn phát qua tạo ánh sáng đơn sắc cho qua ánh sáng với bước sóng định, qua dung dịch cốc gây thay đổi lượng điện tử Khi phân tử hấp thụ lượng ánh sáng này, điện tử chuyển lên mức lượng cao Tuy nhiên, có điện tử hợp chất có nối đơi hay/và ba hấp thụ ánh sáng vùng tử ngoại Tiếp đến, nhận tín hiệu, khuyếch đại tín hiệu đồng hồ đo phân tích cho tiêu:  Mật độ quang (OD)  Độ thấu quang (T- transmittance) Cực đại hấp thụ (λmax) bước sóng mà chất cho độ hấp thụ lớn Và cực đại hấp thụ, chất lại có hệ số hấp thụ mol định (Σ) [6] 23 Nồng độ chất phân tích tính theo cụng thc àg / ml = OD max ìM ì 1000 Σ OD360: giá trị hấp thụ cực đại hấp thụ (λmax) M: trọng lượng phân tử chất cần phân tích Đèn nguồn Bộ tạo ánh sáng đơn sắc Cốc đựng mẫu đo Bộ nhận tín hiệu Bộ khuyếch đại tín hiệu Đồng hồ đo Hình 3.1: Sơ đồ hoạt động máy quang phổ tử ngoại • Chuẩn bị dung dịch AFG1 chuẩn xác định nồng độ Mục đích: Pha lỗng dung dịch AFG1 chuẩn, cần thiết cho lượng mẫu dùng thí nghiệm sau Tiến hành: Chuẩn AFG1 1mg Pha thành dung dịch AFG1 có nồng độ 250 ppm (1 mg / ml CHCl3) Lấy 280 µl AFG1/CHCl3 (250 ppm) pha 720 µl CHCl3 thành ml dịch pha Thêm tiếp ml CHCl3vào Đo OD360 Mẫu trắng: dung dịch CHCl3 Cách thực hiện: Cho cóng chứa đầy dung mơi CHCl3 vào quang phổ kế, sau lấy cóng bên ngồi ra, thay dung mơi dung dịch AFG1 pha vào đầy cóng, cho cóng vào lại quang phổ kế Sau đọc kết ánh sáng λ = 360 nm 24 Tính µg AFG1/ml với λ = 360 nm, M=360 Σ= 19500 3.3.1.3 Quy trình chiết xuất, đặc tinh chế AFG1 cột IAC Sử dụng quy trình hãng Vicam (Mỹ) Để cột cân nhiệt độ phòng 15oC Rửa cột 15 ml nước • Với mẫu, quy trình tiến hành 30 g mẫu + g NaCl + 150 ml MeOH 80% Lắc 30 phút Lọc qua giấy lọc thường Cho 20 ml dịch lọc vào bình xác Thêm nước cho đủ 60 ml Lọc qua lọc thuỷ tinh Cho 15 ml dịch lọc vào cột Rửa cột 10 - 15 ml dịch rửa (62 ml nước + ml MeOH + 70 µl Tween 20) Rửa cột 10 ml nước Rửa giải 1ml MeOH Cho tác dụng với 1ml dung dịch Br2 0.003% Đọc kết huỳnh quang kế 3.3.1.4 Phương pháp dùng huỳnh quang kế đo lường hàm lượng aflatoxin • Nguyên tắc: Các phân tử hấp thụ photon ánh sáng thích hợp để chuyển từ trạng thái lên trạng thái kích thích Ngược lại, phân tử trạng thái kích thích trở trạng thái cách giải phóng 25 lượng hấp thụ dạng photon, tức tự phát ánh sáng, gọi phát quang (luminescene) Cường độ bước sóng ánh sáng phát đo lường [6] Nguồn sáng Bộ tạo ánh sáng kích thích đơn sắc Khe sáng vào Đồng hồ đo Bộ khuyếch đại tín hiệu Cốc đựng mẫu đo Bộ nhận tín hiệu Khe sáng Bộ tạo ánh sáng xạ đơn sắc Hình 3.2: Sơ đồ hoạt động huỳnh quang kế Mỗi chất đặc trưng số: Cực đại kích thích (λEx.) bước sóng mà bị kích thích  bước sóng này, chất cho cường độ phát quang tương đối (I tđ) lớn Cực đại xạ (λEm.) bước sóng mà chất cho Itđ lớn  Ở nồng độ loãng, Itđ tỉ lệ với nồng độ chất dung dịch • Tiến hành: Chuẩn bị huỳnh quang kế: mở máy trước 15-20 phút Sau đó, cho ống chuẩn máy (màu đỏ, xanh, vàng) vào để chuẩn máy Chuẩn bị dung dịch cần đo: mẫu chuẩn AFG1 chuẩn bị theo quy trình 3.3.1.3 Đo lượng AFG1: Cuvet (cốc đựng mẫu đo) chứa ml dịch giải hấp ml dung dịch Br2 0,003% (làm tăng khả phát huỳnh quang AFG1) cho vào huỳnh quang kế, đậy nắp lại Sau phút, máy tự động tính hiển thị kết cho biết hàm lượng AFT 3.3.2 Xây dựng đường chuẩn cho AFG1 huỳnh quang kế 26 Mục đích: Khảo sát tương quan tuyến tính lượng AFG1 cường độ sáng máy huỳnh quang Thực hiện: Chuẩn bị dung dịch AFG1 chuẩn/ MeOH (0,25 ng/µl) từ dung dịch AFG1 chuẩn/CHCl3 với nồng độ xác định quang phổ kế (3.3.1.2) Bố trí nồng độ AFG1 theo bảng Bảng 3.1: Bố trí nồng độ AFG1 chuẩn để xây dựng đường chuẩn Lượng AFG1 Dung dịch AFG1 MeOH Dung dịch Br2 chuẩn (ng) (0,25 ng/µl) (µl) 20 (µl) 980 (µl) 1000 10 40 960 1000 20 80 920 1000 40 160 840 1000 50 200 800 1000 Đo huỳnh quang kế với nồng độ AFG1 (thể tích đo ml) Xây dựng đường chuẩn với phần mềm M Excel 2003 3.3.3 Khảo sát tiêu 3.3.3.1 Độ nhạy cột Mục đích: khảo sát khả bắt giữ AFG1 mức thấp cột IAC Thực hiện: Chuẩn bị dung dịch AFG1 chuẩn/ MeOH (0,025 ng/µl) từ dung dịch AFG1 chuẩn/CHCl3 với nồng độ xác định quang phổ kế (3.3.1.2) Bố trí thí nghiệm theo bảng Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm để khảo sát độ nhạy Lượng Thể tích thành phần cho qua cột AFG1 Dung dịch MeOH Nước cất chuẩn AFG1 (µl) (ml) (ng) (µl) 40 80 160 1960 1920 1840 8 27 Cho lượng AFG1 chuẩn với nồng độ 0,025 ng/µl hàm lượng giảm dần ppb, ppb ppb qua cột IAC chiết tách theo quy trình 3.3.1.3 Mỗi hàm lượng thực lặp lại cột Hàm lượng AFG1 tối thiểu sau qua cột IAC xác định phương pháp huỳnh quang kế 3.3.3.2 Độ lặp lại cột Mục đích : khảo sát độ đồng cột IAC (khả bắt giữ cột có không) Thực hiện: Thử nghiệm khả lặp lại cột bắt AFG1 nồng độ ppb 20 ppb Ở nồng độ, chọn ngẫu nhiên 10 cột lô cột sản xuất Chuẩn bị dung dịch AFG1 chuẩn/ MeOH (0,25 ng/µl) từ dung dịch AFG1 chuẩn/CHCl3 với nồng độ xác định quang phổ kế (3.3.1.2) Cho dung dịch AFG1 qua cột tương ứng với ppb 19 ppb chiết tách theo quy trình 3.3.1.3 Hàm lượng AFG1 xác định phương pháp huỳnh quang kế 3.3.4 Phương pháp xử lí số liệu Số liệu thu thập xử lí phần mềm Excel 2003 28 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Cột IAC 2,5 Viện Pasteur Tp HCM sản xuất Cột có đặc điểm  Cột nhựa có kích thước 0,4 x 10 cm  Nồng độ kháng thể kháng AFB1gắn lên cột 2,5 mg/ml gel CNBr - activated sepharose 4B, có khả bắt giữ AFB1 4.2 Nồng độ dung dịch AFG1 chuẩn xác định quang phổ kế Với giá trị OD360= nhận từ huỳnh quang kế, ta có nồng độ Hình 4.1: Cột IAC dung dịch AFG1 chuẩn thuộc 280 µl lấy từ dung dịch m ban u: àgAFG1 / ml = ì 360 × 1000 = 7,38 (µg/ml) hay (ppm) 19500 4.3 Đường chuẩn AFG1 dựa huỳnh quang kế Kết trình bày qua bảng 4.1 minh họa qua biểu đồ 4.1 Bảng 4.1: Kết xây dựng đường chuẩn AFG1 dựa hùynh quang kế Lượng AFG1 (ng) Kết đo hùynh quang kế (ng) r SD (1) 4,6 (2) 3,8 (3) 5,2 (4) 4,5 (5) 3,6 TB 4,34 0,65 CV% 14,9 29 Nồng đ từ huỳnh quang ộ (ng) 10 8,4 9,1 9,8 20 18 18 18 40 37 41 38 50 42 46 48 (r: số lần lặp lại; TB: trung bình) 8,2 19 41 50 9,3 19 39 49 8,96 18,4 39,2 47 0,66 0,55 1,79 3,16 40 50 7,3 4,6 6,7 y = 0,966x - 0,583 60 50 40 30 20 10 0 10 20 30 60 Lượng AFG1 (ng) Biểu đồ 4.1: Mối tương quan lượng AFG1 cường độ phát huỳnh quang Từ bảng đồ thị có nhận xét:  Độ lệch chuẩn (SD) nói lên mức độ chênh lệch số liệu; số liệu rời rạc SD lớn [8] Ở bảng 4.1, SD biến thiên từ 0,55 - 3,16 thấy, với lượng AFG1 lớn SD tăng tương ứng với mức độ sai số xảy cao Các sai số thao tác hút micropipet khơng chuẩn xác, thất AFG1 q trình thực hiện…  Hệ số biến thiên (CV%) nhằm đánh giá độ xác tính khách quan số liệu thu thập [8] Ở bảng 4.1, CV% nhỏ 20% (3% - 14,9%) nên đạt mức chấp nhận phân tích [7]  Đồ thị thể mối liên hệ tuyến tính lượng AFG1 cường độ phát huỳnh quang qua phương trình y = 0,966x – 0,583 với R2 = 0,998 4.4 Độ nhạy cột Cho lượng AFG1 với nồng độ 7,38 ppm hàm lượng giảm dần ppb, ppb, ppb qua cột IAC chiết tách theo quy trình, hàm lượng lặp lại cột, ta thu kết quả: 30 Bảng 4.2: Kết độ nhạy cột AFG1 Lượng AFG1 Lượng thu cho vào cột Lượng AFG1 thu hồi hồi trung (ppb) (ppb) bình (ppb) 3,5 1,8 0,8 3,0 1,9 0,7 3,4 1,9 0,8 3,3 1,87 0,77 CV% 8,02 3,09 7,53 Nhận xét: Bảng 4.2, với CV% từ 3,09-8,02 tức nhỏ 20% cho thấy tính xác khách quan chấp nhận số liệu [7] Từ suy ra, khả bắt giữ phát AFG1 cột IAC huỳnh quang kế hàm lượng thấp ppb Kết tương đương với kết AFB1, với việc sử dụng phương pháp chiết tách hóa học phân tích TLC (Lê Anh Phụng, 2002) Kết lần khẳng định ưu điểm IAC phục vụ tốt cho việc phân tích AFT mức vi lượng; với huỳnh quang kế, việc phân tích trở nên tốn thời gian (đọc kết trực tiếp huỳnh quang kế phút) khơng dùng hóa chất độc hại nên thân thiện với môi trường 4.5 Độ lặp lại cột Thử nghiệm khả lặp lại cột bắt AFG1 nồng độ ppb, 19 ppb , 10 cột lặp lại cho nồng độ, ta thu kết quả: Bảng 4.3: Kết độ lặp lại cột AFG1 lượng ppb Lượng AFG1 cho Lượng AFG1 vào cột (ppb) 4 4 4 thu hồi (ppb) 3,5 3,4 3,9 3,4 4,2 3,7 31 4 4 Trung bình SD CV% 3,7 3,6 3,7 3,2 3,63 0,28 7,8 Bảng 4.4: Kết độ lặp lại cột AFG1 lượng 19 ppb Lượng AFG1 cho Lượng AFG1 vào cột (ppb) 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 Trung bình SD CV% thu hồi (ppb) 16 17 16 15 15 15 16 15 14 14 15,3 1,23 8,03 Nhận xét: Bảng 4.3 bảng 4.4 cho thấy có chênh lệch kết khảo sát cột khác (10 cột) với lượng AFG1 cho vào cột IAC (SD= 0,28 1,23 tương ứng với lượng AFG1 ng 19 ng) Khả bắt giữ AFG1 tương đối đồng đều, thể qua hệ số biến thiên thấp (CV% < 20%, CV% = 7,8% 8,03% tương ứng với lượng AFG1 ng 19 ng) Từ kết thu thí nghiệm bố trí tương tự với AFB1, CV% = 13,17% 9,19% tương ứng với ng 20 ng lượng AFB1[2], thấp 20%, chứng tỏ cột IAC Viện Pasteur sản xuất thể độ đồng chấp nhận phân tích 32 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 33 - Cột IAC tạo thành có kích thước 0,4 x 10 cm với nồng độ kháng thể kháng AFB1 2,5 mg/ml gel CNBr - activated sepharose 4B, có khả bắt giữ AFB1 AFG1 - Độ nhạy cột IAC: ppb - Độ lặp lại cột IAC: CV = 7,8% với lượng ng AFG1 CV = 8,03% với lượng 19 ng AFG1 Đề nghị - Khảo sát tiêu đánh giá khác cột như: dung tích cột, hiệu suất thu hồi để kết lưận thuyết phục khả bắt AFG1 cột IAC - Do có tương đồng cấu trúc vòng difuran AFB1, AFG1 AFM1, vị trí đặc hiệu miễn dịch AFB1, tính độc khả diện sản phẩm sữa, cần thiết khảo sát tiêu đánh giá AFM1 Phần 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 TIẾNG VIỆT Dương Ngọc Diễm, 2003 Tạo kháng thể kháng ochratoxin giá lực bắt Ochratoxin Khóa luận tốt nghiệp, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Bùi Thị Mỹ Duyên, 2004 Khảo sát đặc tính cột sắc kí lực miễn dịch dùng định lượng Aflatoxin B1 Viện Pasteur TP HCM sản xuất Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Bùi Xuân Đồng Nguyễn Huy Văn, 2000 Vi nấm dùng Công Nghệ Sinh Học Nhà xuất Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội 201 trang Trần Minh Đức, 2002 Khảo sát tình hình nhiễm Aflatoxin B1 thức ăn hỗn hợp cho heo thị xã Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Đậu Ngọc Hào Lê Thị Ngọc Diệp, 2003 Nấm mộc độc tố aflatoxin thức ăn chăn nuôi Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội 210 trang Đặng Văn Hịa, 1993 Giáo trình kiểm nghiệm thuốc, trường Đại học Y Dược, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Đặng Văn Giáp, 1997 Phân tích liệu khoa học chương trình MS – Excel Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Ngọc Kiểng, 2000 Toán – Thống kê sinh vật, lý thuyết xác suất Trường Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Đỗ Ngọc Liên, 2004 Thực hành hóa sinh miễn dịch Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Hà Nội, 316 trang 10 Lâm Thị Nhạn, 2001 Cải tiến kĩ thuật định lượng Aflatoxin thực phẩm Luận án thạc sĩ khoa học, chuyên nghành hóa phân tích, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 11 Lê Anh Phụng, 2001 Bệnh nhiễm độc Aflatoxin phương pháp phát Aflatoxin Chuyên đề cấp tiến sĩ, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 12 Trịnh Việt Anh Tài, 2002 Đánh giá hiệu thu hồi Aflatoxin cột lực miễn dịch phân viện công nghệ sau thu hoạch Tp HCM chế tạo Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 35 13 Châu Vĩnh Thị, 2001 Khảo sát tình hình nhiễm vi nấm sinh độc tố & độc tố aflatoxin số thành phẩm đông dược Việt Nam lưu hành Tp Hồ Chí Minh Luận văn thạc sĩ dược học, chuyên nghành Kiểm nghiệm - Độc chất, trường Đại học Y Dược, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 14 Nguyễn Lê Trang, 2003 Aflatoxin B1: sản xuất giá lực miễn dịch bắt aflatoxin(s) Thuyết minh đề tài nghiên cứu Khoa học Công nghệ cấp bộ, phịng Miễn dịch, viện Pasteur, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam TIẾNG ANH 15 Carlos A Muro-Cacho et al, 2004 Mycotoxins: Mechanisms of toxicity and Methods of Detection for identifying exposed individuals Journal of Land Use, Vol 19:2, spring, 2004 16 Fun sun Chun, 1983 Immunoassays for analysis of Mycotoxins Journal of Food Protection, Vol 47, No 7, Pages 562-569 (July 1984) 17 M O Moss, 1998 Recent study of mycotoxins Journal of Applied Microbiology Symposium Supplement 1998, 84, 62S-76S 18 Maryann E Smela et al, 2001 The chemistry and biology of aflatoxin B1: from mutational spectrometry to carcinogenesis Carcinogenesis vol.22 no.4 pp.535-545, 2001 19 Yu et al, 2004 Clustered Pathway Genes in Aflatoxin Biosynthesis Applied and Environmental Microbiology, March 2004, p 1253-1262, Vol 70, No 20 http://www.schimmel-schimmelpilze.de/schimmelpilz/aspergillus-flavus.html 21 http://www.schimmel-schimmelpilze.de/schimmelpilz/aspergillus-parasiticus.html 22 http://www.ehso.com/ehshome/aflatoxin.php ... - Viện Pasteur, Tp Hồ Chí Minh TS Nguyễn Ngọc Hải, tơi tiến hành đề tài ? ?Đánh giá khả bắt aflatoxin G1 cột lực miễn dịch Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất? ?? 1.2 Mục đích Khảo sát khả bắt aflatoxin G1. .. trên, viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh tiến hành thực đề tài Sản xuất giá lực miễn dịch bắt aflatoxin B1 Giá (cột) sắc kí lực tạo nên cho hiệu cao phân tích định lượng aflatoxin B1 Bên cạnh đó, aflatoxin. .. bắt aflatoxin G1 cột lực miễn dịch 1.3 Yêu cầu Xác định đặc tính cột lực miễn dịch việc bắt aflatoxin G1: • Độ nhạy cột • Độ lặp lại cột Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cương aflatoxin 2.1.1 Lịch

Ngày đăng: 15/11/2012, 09:06

Xem thêm: Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất, Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất, Đặt vấn đề 1. MỞ ĐẦU, Sắc kí ái lực miễn dịch, Các phương pháp phục vụ cho nghiên cứu, Xây dựng đường chuẩn cho AFG1 bằng huỳnh quang kế Khảo sát các chỉ tiêu, Cột IAC 2,5 do Viện Pasteur Tp. HCM sản xuất Nồng độ dung dịch AFG1 chuẩn xác định bằng quang phổ kế Độ nhạy của cột