1 Cơng trình hồn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG BÙI XUÂN TỈNH Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRỊNH THỊ THỦY Phản biện 1: PGS TS LÊ TỰ HẢI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THĂM DỊ Phản biện 2: GS TSKH NGUYỄN BIN HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHẤT MÀU TỪ LÁ CẨM (Peristrophe bivalvis) Luận văn ñược bảo vệ Hội ñồng chấm luận văn tốt nghiệp thạc Chuyên ngành: Hoá hữu Mã số: 60.44.27 sĩ khoa học họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 26 tháng 08 năm 2011 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Có thể tìm hiểu luận văn tại: Đà Nẵng - Năm 2011 - Trung tâm Thông tin-Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng MỞ ĐẦU chất màu chưa ñược nghiên cứu Đặc biệt, dân tộc thiểu Lý chọn ñề tài số nước ta ñang lưu giữ kinh nghiệm quý báu - Như ñã biết, phát triển ngành cơng nghiệp việc sử dụng nhiều lồi có khả nhuộm màu thực phẩm thực phẩm ñã ñang ñáp ứng ñược nhu cầu ngày cao thực làm thuốc chữa bệnh Do chưa thể khai thác, sản xuất chế phẩm phẩm người, mà nhuộm màu thực phẩm với màu từ thực vật nên nước ta chủ yếu sử dụng dạng thơ, cịn dạng chế chất màu phong phú đóng vai trị vơ quan trọng giúp tăng phẩm phải nhập từ nước ngồi tính thẩm mỹ chất lượng sản phẩm, ñặc biệt ñối với quốc - Trước tình hình an tồn vệ sinh thực phẩm nay, vấn đề gia có ẩm thực ña dạng cầu kỳ Trung Quốc, Hàn nghiên cứu, khai thác thương mại hóa chất màu thực phẩm Quốc, Nhật Bản, Việt Nam….Bên cạnh chất màu thực phẩm truyền thống từ thiên nhiên cần quan tâm cịn sử dụng rộng rãi nhiều ngành công nghiệp khác mỹ phẩm, dược phẩm… - Cây Cẩm lồi thực vật sử dụng nhiều để nhuộm màu thực phẩm (xôi, loại bánh lá…) [3], [6], [10], - Ngày nay, chất nhuộm màu thực phẩm thu từ nhiều dùng làm thuốc trị số bệnh lao phổi, khái huyết, nôn nguồn khác nhờ phát triển ngành cơng nghiệp hóa chất máu, tiêu chảy, lị, bong gân cấp… [2], [3], [6] Cây Cẩm có tên khoa (chiết tách từ thực vật [59], chiết tách từ côn trùng, tổng hợp học Peristrophe bivalvis (L.) Merr., thuộc họ Acanthaceae (Durande, phương pháp hóa học…) nguồn chất màu thực phẩm từ thực vật 1782, Nom Cons.), ngồi cịn có tên khác Peristrophe ñược quan tâm hàng ñầu chúng an toàn với người roxburghiana (Schult.) Bremek, P tinctoria (Roxb.) Ness [2], [3], [6], môi trường [7], [33] Ở Việt Nam, Cẩm mọc nhiều tỉnh Lào Cai, Hòa - Ở Việt Nam, từ xa xưa người biết sử dụng số lồi Bình, Lai Châu, Mộc Châu, Sơn La, vùng đồng sơng Cửu Long thực vật ñể làm thuốc chữa bệnh, nhuộm màu cho ăn (Đồng Tháp, Long An, Cần Thơ …) [3], [6] Đã có số nghiên cứu gia đình Một số cho màu đặc trưng màu hồng, tím thực vật học vài dạng Cẩm [10] thành phần hóa (Cẩm đỏ, Cẩm tím), màu đỏ, cam (Tơ mộc) màu xanh (Lá dứa) Đây học chưa nghiên cứu cách [53], [61] gam màu chính, có nhu cầu sử dụng lớn thực phẩm Ưu - Xuất phát từ tình hình thực tế trên, chúng tơi chọn đề tài: điểm Cẩm có khả gây trồng qui mơ lớn, khơng “Nghiên cứu thành phần hóa học thăm dị hoạt tính sinh học gây mùi vị lạ cho thực phẩm, chưa thấy có tượng độc có khả chất màu từ Cẩm (Peristrophe bivalvis)” phát triển thành sản phẩm màu Ngoài ra, cịn có nhiều Mục đích nghiên cứu tác dụng chữa bệnh kể bệnh hiểm nghèo ung thư, bệnh - Xác định thành phần hố học, phân lập xác ñịnh cấu trúc máu, tiểu ñường Tuy nhiên, Việt Nam người dân lâu cấu tử dịch chiết từ thân Cẩm dùng theo kinh nghiệm dân gian chất hố học cấu tử tách được, khảo sát tính ổn định màu dịch chiết 5 - Thăm dị hoạt tính sinh học dịch chiết Đối tượng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu - Trong tình hình số người bị ngộ độc thực phẩm lạm dụng chất màu tổng hợp ngày gia tăng, làm ảnh hưởng xấu - Trong luận văn chúng tơi sâu vào việc tách, tinh chế xác tới sức khoẻ người, mà xu hướng chung giới ñịnh cấu trúc số thành phần hóa học dịch chiết từ tìm kiếm chất màu có nguồn gốc tự nhiên ñể sử dụng thực Cẩm Mộc Châu, Sơn La phẩm Từ lâu Cẩm ñã ñược coi nhuộm màu thực phẩm, - Thu thập mẫu nghiên cứu chất chất màu thành phần hóa học - Xác ñịnh tên khoa học xử lý mẫu Cẩm Mộc Châu, chưa ñược nghiên cứu Cẩm tím, ñỏ dạng Cẩm cho Sơn La màu ñặc trưng ñược ñồng bào dân tộc sử dụng phổ biến ñể - Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chất màu chiết từ Cẩm nhuộm màu thực phẩm Vì việc nghiên cứu qui trình cơng nghệ - Tách phân lập cấu tử dịch chiết chất màu chiết, tách chất màu từ Cẩm, nghiên cứu ñộc tính cấp độc tính - Thăm dị hoạt tính sinh học chất màu tổng, cấu tử bán trường diễn chất màu tách ñược cần thiết, có ý nghĩa khoa phân lập Phương pháp nghiên cứu - Tổng quan tài liệu tình hình sử dụng phẩm màu tự nhiên thực phẩm, mỹ phẩm dược phẩm Phương pháp nghiên cứu tổng hợp hợp chất màu tự nhiên - Tìm hiểu Cẩm, tình hình nghiên cứu nước giới Cẩm - Chiết nước nóng ngâm chiết dung mơi hữu n-hexan, etanol, cloroform,… - Phân lập chất từ cặn chiết thu ñược phương pháp SKBM, SKC - Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập ñược phương pháp phổ: MS, IR, 1D- 2D-NMR - Thăm dị hoạt tính sinh học dịch chiết cấu tử phân lập ñược Ý nghĩa khoa học thực tiễn ñề tài Từ kết nghiên cứu, luận văn ñã thu ñược số kết với đóng góp thiết thực sau: học thực tiễn cao - Lần ñầu tiên Cẩm Peristrophe bivalvis (L.) Merr., thuộc họ Acanthaceae Việt Nam nghiên cứu thành phần hóa học thăm dị hoạt tính sinh học - Góp phần giải thích tác dụng chữa bệnh Cẩm y học cổ truyền Bố cục luận văn Luận văn gồm 80 trang, có 12 bảng 27 hình Nội dung luận văn chia làm chương Mở ñầu: trang Chương 1: Tổng quan tài liệu (26 trang) Chương 2: Thực nghiệm ( trang) Chương 3: Kết thảo luận ( 32 trang) Kết luận kiến nghị: trang Tài liệu tham khảo: trang, gồm 67 tài liệu có 11 tài liệu tiếng Việt 56 tài liệu tiếng Anh Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng chất màu tự nhiên nước giới Rhodoxanthin 1.1.1 Giới thiệu chung chất màu thực phẩm 1.1.2 Các hợp chất anthocyanin 1.1.3 Một số loài thực vật chứa chất màu thiên nhiên khác
Gỗ Vang (Caesalpinia sappan)
Cà rốt, cà chua gấc
Vitamin A Cà rốt cà chua Một số carotenoid có cà rốt, cà chua gấc α -caroten Lycopen (Sắc tố màu ñỏ cà chua) β-caroten (tiền vitamin) 1.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng Cẩm Peristrophe bivalvis (L.) Merr., họ Ơrơ [Acanthaceae (Durande, 1782, Nom Cons.)] nước giới 1.2.1 Đặc ñiểm thực vật Cẩm thân thảo, lâu năm cao khoảng 30-60 cm; hình γ-caroten trứng, thn hay hình giáo, góc nhọn, mặt có lơng [3] dạng Cẩm tím [10]; cịn loại có phím xoan, khơng lơng, có bớt trắng [6], [10] loại Cẩm ñỏ Phát hoa nhỏ ngọn, có hoa xoan mang hoa tía, hường hay trắng, dài 5cm; ñài ngắn, nhau; vành có Carotenoit metoxyl hóa - dẫn xuất lycopen vị trí C-1 mơi to, mơi có thùy cạn; tiểu nhụy thị, nang dài 1,5cm
Mơ tả sơ lược đặc điểm thực vật Cẩm Mộc Châu, Sơn La Cây thảo nhiều, mọc tỏa, cao 30 – 50 cm Lá hình giáo, góc nhọn, mặt có lơng Cụm hoa nhỏ ngọn, bao chung 10 cụm hoa có bắc khơng đều; có khoảng - 10 hoa nằm Chương bắc hình tam giác nhọn, nhỏ đài; đài 5, nhau, đính vào THỰC NGHIỆM đến ½; tràng màu tím, ống dài mơi 2.1 Thiết bị hóa chất 2.1.1 Thiết bị hóa chất dùng cho nghiên cứu hóa học 2.1.2 Thiết bị hóa chất dùng thử hoạt tính sinh học 2.2 Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học 2.3 Phương pháp xử lý mẫu thực vật chiết mẫu 2.3.1 Xử lý mẫu thực vật 2.3.2 Chiết mẫu Cẩm ñỏ tươi với nước nóng, phân lập chất T-red T-red Mẫu Cẩm ñỏ tươi 720g Chiết H2O nóng 800-900C, lần Dịch chiết tổng MC3-H2O Hoa Cẩm Cô cạn bếp, sấy chân không 70-800C Hình 1.1 Một số hình ảnh Cẩm P bivalvis Mộc Châu , Sơn La 1.2.2 Phẩm màu thô MC3 (6,20g) Sắc ký cột sephadex LH-20, MeOH Đặc ñiểm sinh thái phân bố Cây mọc tán rừng ẩm, ven rừng, lùm cỏ dọc ñường, ñộ cao 300 - 1600m so với mặt nước biển Ra hoa vào mùa thu đơng [3] 1.2.3 Một số công dụng Cẩm theo y học cổ truyền 1.2.4 Một số nghiên cứu hoạt tính sinh học thành phần hóa học Cẩm T-red 5mg T-red 32mg Hình 2.1 Quy trình tách chiết phân lập chất màu từ Cẩm ñỏ tươi Mẫu Cẩm ñỏ thu hái Mộc Châu, Sơn La (10/2010) ñược ngắt riêng cành loại bỏ vàng úa, rửa nước Lá Cẩm ñỏ 11 12 tươi (720g) ñược chiết với lít nước nóng (tỉ lệ mẫu/nước≈1kg/1,5lit, 2.3.4 Chiết mẫu Cẩm tím khơ với dung mơi hữu cơ, phân O t≈80-90 C, thời gian 15-20 phút) Lọc bỏ phần bã, chiết tiếp lần lập chất từ cao clorofom (500 ml nước), gộp dịch nước hai lần; cô bớt cịn 1/3 thể tích quay 1kg bột Cẩm khơ cất áp suất giảm thu ñược bột chất màu tổng, kí hiệu MC3, n-hexan Cloroform Metanol (6,20g, hàm lượng ≈ 0,86% tính theo tươi) Chất màu tổng MC3 ñược chiết với hỗn hợp dung mơi ethyl Nước nóng Cơ kiệt dung mơi acetat/H2O (1:1), loại dung môi áp suất giảm thu ñược cặn chiết EtOAc Chạy sắc ký cột sephadex LH-20 (MeOH) cặn chiết EtOAc, thu ñược chất (ký hiệu T-red ) chất có ký hiệu T-red 14g cao n-Hexan 15,77g cao Cloroform 53,32g cao Metanol 39,42g cao H2O Metanol 2.3.3 Chiết mẫu Cẩm tím tươi với nước nóng, phân lập chất ECPB6 12,6g cao Cloroform Lá Cẩm Làm sạch, thái nhỏ Chiết nước sơi liên tục Lọc đuổi nước n-Hexan, Cao n-Hexan Cao ñặc Clorofom, Etanol, Cô kiệt dung môi Cao Clorofom (ECPB) Cao etanol (EEPB) Cơ đuổi dung mơi SKBM + SKC PĐ CF1 0,419g SKBM + SKC Chất ECPB6 Hình 2.2 Quy trình chiết phân lập chất ECPB6 từ Cẩm tím SKBM thu phân đoạn Cô kiệt dung môi PĐ CF2 0,14g PĐ CF3 3,81g PĐ CF4 0,4g SKC sephadex với dung môi MeOH SKBM thu phân ñoạn Xác ñịnh cấu trúc Phần khơng tan Các phân đoạn tươi thu Mộc Châu, Sơn La SKC silicagel với dung môi CHCl3 với lượng MeOH tăng dần từ - 100% 2mg CF2.1PB 4mg CF2.2PB Hình 2.3 Quy trình chiết, tách chất CF2.1-PB CF2.2-PB từ Cẩm tím khơ thu Mộc Châu, Sơn La 2.4 Thử hoạt tính sinh học 2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn 2.4.2 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào [24], [58] 13 14 Chương Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR chất ECPB6 chất KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Peristrophine theo tài liệu [53, 64] Vị trí C ECPB6 Peristrophine [64]Peristrophine [53] 3.1 Khảo sát thành phần hóa học dịch chiết nước Cẩm đỏ tươi 13 3.2 Khảo sát thành phần hóa học dịch chiết nước Cẩm tím tươi 125MHz 500 MHz 75 MHz 300 MHz 75MHz 300 MHz 3.2.1 Hàm lượng cao chiết từ Cẩm tím tươi CD3OD DMSO-d6 DMSO-d6 DMSO-d6 CDCl3 3.2.2 Phân lập xác ñịnh cấu trúc chất ECPB6 δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) C-NMR H-NMR 1(CH) 108,90 6,39 180,55 179,43 179,12 4(CH) 103,65 4’(C-O) 140,34 137,40 137,08 (C bậc IV) 150,78 149,01 147,01 6,31 100,74 6,90 10 147,27 146,79 NH2 102,84 7,23 5' O 4' 99,27 7,25 s 98,89 128,08 127,61 150,74 148,79 CDCl3 6,50 s 6,44 s 6,93 s 7,21 s 56,67 3,87 56,53 3,88 s 56,02 3,99 s 56,18 3,85 s 55,72 3,97 s 6,43 br s 6,55 br s 5.06 br s 3.3 Khảo sát thành phần hóa học dịch chiết clorofom từ Cẩm NH2 tím khơ Mộc Châu, Sơn La 3.3.1 MeO 98,28 8(C bậc IV) 148,68 OMe HO 7,20 s 102,41 146,79 10 (C bậc IV) 152,84 98,88 6,32 s 146,79 ’ ' 102,76 7(C bậc IV) 147,65 (C bậc IV) 129,19 N 108,42 3(C=O) ’ ' 6,40 s C-NMR 1H-NMR 145,33 9(CH) 108,89 13 145,61 6(CH) Cấu trúc ECPB6 C-NMR 1H-NMR 2(C bậc IV) 145,20 ’ Hình 3.9 Phổ 13C-NMR DEPT chất ECPB6 13 O Hàm lượng cao chiết từ Cẩm tím khơ 16 15 Bảng 3.4 Hàm lượng màu sắc cao chiết từ 1kg Cẩm tím khơ Loại cao n-Hexan Cloroform Metanol Màu sắc Xanh lục Vàng cam Tím đỏ Nước Tím nhạt Khối lượng (gam) 14 15,775 53,324 39,428 Hàm lượng (%) 1,4 1,58 5,33 3,94 3.3.2 Phân lập xác ñịnh cấu trúc cấu tử CF2.1-PB CF2.2-PB H N MeO H N HO O O O HO CF2.1-PBa Hình 3.13 Phổ 13C-NMR DEPT CF2.2-PB O MeO CF2.1-PBb Bảng 3.5 Số liệu phổ 13C-, 1H-NMR peristrophin [12], ECPB6 CF2.2-PB [125/500 MHz, δ ppm] Hình 3.10 Màu sắc chất CF2.1-PB CF2.2-PB C Chất CF2.2-PB: Kết hơp phổ 1H- 13C-DEPT NMR với Peristrophin THUY [12] (DMSO) ECPB6 + (CD3OD) phổ HR-ESI-MS [m/z 299,0674 (tính tốn C15H11N2O5 299,0668)] xác định cơng thức phân tử CF2.2-PB δ C 13 C15H11N2O5+ δ H δC δH nhóm OH δH 8,49 (1H, br s) proton thơm δH 6,91; 6,50; 6,45 (mỗi pic 1H, s) δ 13C δ 1H δ 1H HMBC CD3OD CD3OD DMSO 1H/13C Phổ 1H-NMR CF2.2-PB có diện nhóm methoxy δ3,92 (3H, s) nhóm acetyl δ 2,23 (3H, s), nhóm NH CF22PB 98,6 6,40 146,7 179,4 102,5 6,33 102,9 6,42 s 145,2 180,6 103,7 6,28 s 116,9 148,5 173,0 102,1 * 6,50 * 6,06 (C-2), C-10' 4a 148,7 - 148,7 130,6 - - 18 17 5a 137,4 99,1 7,21 129,2 134,6 100,7 7,03 s 107,3 6,91 6,69 C-8, Bảng 3.6 Các chất phân lập ñược từ Cẩm tím (Peristrophe C-7,C-9' 150,4 147,0 108,8 7,26 148,7 155,8 152,8 177,1 108,9 6,79 s 103,6 6,45 6,12 C-7, C-9',C-5' 9a 127,9 10a 145,4 7-OMe 56,3 3,89 140,4 149,6 150,8 133,6 56,7 3,90 s 56,3 3,92 3,92 C-7 bivalvis) Phổ ñã ño, MS TT Ký hiệu Mẫu (mg) Cấu trúc CTPT Tài liệu liên quan cấu trúc Thuy H, 13C, HR-ESI-MS Chất CF2.1PB Found 274.07078 mg calc 272.05644 C14H10NO5 8-OMe 55,9 3,85 - C=O Me NH 171,5 24,3 - 2,23 8,49 - C-8 2,12 C=O 8,36 C-3, Thuy H, 13C, HR-ESI-MS ECPB6 Found 274.07078 Chưa Chất calc 272.05644 C-2 OH C14H10NO5 8,23 9,02 Thuy * Tín hiệu khơng nhìn thấy Phổ 13 C–NMR có tín hiệu 15 carbon, bao gồm: nhóm H-, 13C-, 2D-NMR, CF22PB HR-ESI-MS Chất (Dự đốn 299.06744 carbonyl δC 177,1; 173,0 171,5; 4xCH (δC 107,3; 103,6, 102,1 calc 299.06734 Artifact 116,9), 6xCq (δC 155,8; 149,6; 148,5; 134,6; 133,6 130,6), C15H11N2O5- chất nhóm methoxy (δC56,3) nhóm acetyl (δC24,3, CH3; 171.5 C=O) ECPB-6) Từ liệu phổ trên, kết hợp với liệu phổ tương tác phổ HSQC, HBMC, chúng tơi xác định cấu trúc chất CF2.2- 3.4 Thực phản ứng T-Red2 với CH3COCl PB 8-acetamido-3-methoxy-2,7-dioxy-2,7-dihydrophenoxazin - 3.4.1 Cách tiến hành 5-ium (bảng 3.6) 3.4.2 Phân lập xác ñịnh cấu trúc chất Tred2Ac 20 19 3.5 Thực phản ứng T-Red2 với benzylbromua 3.5.1 Cách tiến hành MeO 9' N 10' 4' NH2 + MeO 5' O C6H5CH2Br O T-red 2: Peristrophin MeO 9' N 10' NH-CH2C6H5 + HBr MeO 5' O 4' O 2-(N-benzyl)amino-7,8-dimethoxy-3H-phenoxazine-3-on (Tred2Ben) 3.5.2 Phân lập xác ñịnh cấu trúc chất Tred2Ben 3.6 3.6.1 Thử hoạt tính sinh học Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh dịch chiết MC3-H2O, CEPB EEPB Hình 3.16 Phổ 13C-NMR chất Tred2Ac Phổ 13C–NMR chất Tred2Ac có tín hiệu 15 carbon, bao Thử hoạt tính kháng sinh với mẫu: Dịch chiết MC3-H2O, Dịch etanol (EEPB Dịch cloroform (ECPB) chiết từ Cẩm đỏ Cẩm tím Tiến hành pha lỗng mẫu từ nồng độ cao xuống nồng gồm: nhóm carbonyl δC 177,1 171,5; 4xCH (δC 113,1; 109,7; độ thấp (128µg/ml, 32 µg/ml, µg/ml, µg/ml, 0,5 µg/ml) ñĩa 102,8 99,1), 6xCq (δC 153,0; 149,0; 147,4; 114,6; 133,6 130,6), 96 giếng Vi sinh vật kiểm định sau hoạt hóa mơi nhóm methoxy (δC56,1 56,6) nhóm acetyl (δC24,3, CH3; 171.5 C=O) (Bảng 3.7) So sánh phổ NMH chất Tred2Ac với peristrophin ta thấy phổ hai chất phù hợp với chất Tred2Ac có thêm tín hiệu nhóm acetyl( δC 170,5 24,3; δH 2,2) Như cấu trúc chất Tred2Ac xác ñịnh ñược là: N -(7,8-dimethoxy-3-oxo-3H -phenoxazin-2-yl)acetamide trường phù hợp ñược cho vào giếng ñã có sẵn chất thử Để tủ ấm 370C 24h Kháng sinh Amoxilin ñược dùng làm ñối chứng dương Kết ñược xử lý phương pháp ño ñục tế bào máy quang phổ bước sóng 595 nm Giá trị IC50 (µg/ml) tính chương trình Raw data máy tính thu bảng kết sau: 21 22 Bảng 3.8 Kết thử hoạt tính kháng VSVKĐ dịch chiết Nồng độ ức chế IC50 (µg/ml) Dịch Dịch chiết etanol MC3-H2O (EEPB) STT Chủng vi sinh vật Dịch cloroform (ECPB) Lactobasillus fermantum > 256 >256 >256 Enterococcus faecium > 256 >256 >256 Staphylococcus aureus > 256 >256 >256 Bacillus subtilis > 256 >256 245 Escherichia coli > 256 >256 >256 Pseudomonas aeruginosa > 256 >256 >256 Candida albicans > 256 >256 >256 Mẫu so sánh Lượng tế bào sau có tác dụng ECPB nồng ñộ 0.5, µg/ml Nhận xét: Dịch chiết MC3-H2O, etanol (EEPB) khơng có tác dụng kháng bảy chủng vi sinh vật trên, dịch cloroform (ECPB) có tác dụng kháng chủng Bacillus subtilis với giá trị IC50 = 245 µg/ml (yếu) 3.6.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mơ (KB) dịch chiết ECPB, EEPB chất T-Red2, ECPB6 Bảng 3.9 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô (KB) STT Ký hiệu mẫu KB IC50(µg/ml) ECPB 31,36 EEPB >128 ECPB6 57,90 T- Red 15,5 Elipticine 0,31 - 0,62 Lượng tế bào có tác dụng ECPB nồng độ 32 µg/ml Lượng tế bào có tác dụng ECPB nồng độ 128 µg/ml Hình 3.20 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào dịng KB ECPB với nồng ñộ khác 23 24 Nhận xét: Từ kết lập hình 3.21 sau: Dịch chiết EEPB khơng có khả ức chế tế bào dịng KB Dịch chiết ECPB có khả ức chế phát triển dòng tế bào ung thư biểu mô thực nghiệm KB với giá trị IC50 = 31.36 µg/ml Kết cụ thể sau: dịch ECPB với nồng độ 0.5, µg/ml chưa gây ức chế ñược tế bào KB, nồng ñộ 32 µg/ml lượng tế bào KB chết nhiều nồng độ 128 µg/ml lượng tế bào KB bị tiêu diệt hồn tồn 3.6.3 Kết thử nghiệm độc tính cấp chuột nhắt Bảng 3.11 Số liệu thử nghiệm độc tính cấp chuột nhắt Mức Liều thử Số chuột Số chuột % chuột liều (g mẫu thử /kg chết/ sống chết/ sống chết chuột) 12,5 thực tế 0/10 kỳ vọng 0/27 18,75 2/8 2/17 10,5 25,0 4/6 6/9 40,0 Kết luận: Kết thử độc tính cấp phẩm màu Peristrophe 31,25 7/3 13/3 81,3 bivalvis chuột nhắt trắng là: liều không gây độc an tồn với 37,5 10/0 23/0 100 chuột 12,5g mẫu thử/kg chuột liều gây chết 100% số chuột thử Hình 3.21 Thử nghiệm độc tính cấp chuột nhắt nghiệm 37,5g mẫu thử/kg chuột Dựa số liệu thực tế, mẫu thử Theo kết bảng 3.12, ta có: a = 40,0% ; b = 81,3% ; A = 25,0g mẫu thử/kg Áp dụng cơng thức Behrens có: (50 − 40,0) × 6,25 LD50 = 25,0 + = 26,5 g mẫu thử/kg chuột 81,3 − 40,0 có liều LD50 khoảng (26,5 ± 1,56) g mẫu thử/kg chuột Thơng thường liều an tồn ñối với người gấp 10 lần so với chuột, theo tinh tốn liều an tồn tương ứng người khoảng 1g/kg Trong thực tế cần 50 g tươi tương ứng 2,03g Peristrophe bivalvis cho kg gạo cho màu tím đẹp Như vậy, sơ ñánh giá phẩm màu PB khơng gây độc cho người sử dụng 25 26 Kết thử độc tính cấp chuột thực nghiệm ñã xác ñịnh KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ñược LD50 phẩm màu từ Cẩm tím nằm khoảng 26,5 ± * Kết luận: Đã tiến hành nghiên cứu quy trình chiết chất màu từ hai dạng Cẩm ñỏ Cẩm tím rút số kết luận sau: 1,56 g/kg chuột * Kiến nghị: - Chất màu chiết từ Cẩm tươi cho hàm lượng lớn màu ñẹp so với chiết từ Cẩm khô Từ kết nghiên cứu luận văn cho thấy chất chất màu từ dạng cẩm thuộc nhóm chất phenoxazin alkaloid Đây - Chất màu chiết từ nước nóng cho màu chọn lọc so với nhóm chất gặp tự nhiên chưa ñược sử dụng thực phẩm nước ta cung giới Vì cịn có nhiều vấn chiết từ dung mơi hữu Đã nghiên cứu cách có hệ thống thành phần hóa học hai dạng Cẩm tím Cẩm đỏ ñề khoa học liên quan trực tiếp ñến sức khỏe cộng đồng cần nghiên cứu sâu Vì vậy, tơi đề nghị cấp có thẩm quyền tiếp Từ dịch chất màu hai dạng Cẩm, phương pháp sắc ký cột silicagel sắc ký cột sephadex LH-20 ñã phân lập ñược: tục nghiên cứu cách sâu rộng chất màu từ Cẩm - Các chất ECPB6 CF2.2-PB chưa thấy mơ tả tài liệu, cần phải phân lập chúng với lượng nhiều ñể - Chất màu từ Cẩm đỏ: T-Red2 nghiên cứu sâu - Chất T-red1, CF2.1-PB chất có màu đẹp nên cần - Hai chất từ Cẩm tím khô: ECPB6, CF2.2PB Bằng phương pháp phổ: IR, MS, H-NMR, C-NMR, phân lập lượng nhiều ñể xác ñịnh xác cấu trúc Mặt khác DEPT phổ hai chiều (HSQC, HMBC) ñã xác ñịnh ñược cấu trúc cấu tử tìm thấy cao chiết clorofom - cao có chất sau: hoạt tính kháng khuẩn độc tế bào tốt, cần phải nghiên cứu 13 - Chất T-Red2: Peristrophin hoạt tính sinh học cấu tử ñể ñưa hướng ứng - Chất ECPB6: Là dẫn xuất demethyl peristrophin dụng chúng vào sống - Chất CF2.2-PB: dẫn xuất acetyl demethyl peristrophin Các chất thuộc nhóm chất phenoxazin alkaloid, hai chất ECPB6 CF2.2-PB chất Kết thử hoạt tính độc tế bào cho thấy dịch chiết chloroform từ cẩm tím (ECPB) có khả ức chế phát triển dòng tế bào ung thư biểu mô thực nghiệm KB với giá trị IC50 = 31.36 µg/ml  ... phân lập cấu tử dịch chiết chất màu chiết, tách chất màu từ Cẩm, nghiên cứu ñộc tính cấp độc tính - Thăm dị hoạt tính sinh học chất màu tổng, cấu tử bán trường diễn chất màu tách ñược cần thiết,... phẩm Từ lâu Cẩm ñã ñược coi nhuộm màu thực phẩm, - Thu thập mẫu nghiên cứu chất chất màu thành phần hóa học - Xác ñịnh tên khoa học xử lý mẫu Cẩm Mộc Châu, chưa ñược nghiên cứu Cẩm tím, ñỏ dạng Cẩm. .. có số nghiên cứu gia đình Một số cho màu đặc trưng màu hồng, tím thực vật học vài dạng Cẩm [10] thành phần hóa (Cẩm đỏ, Cẩm tím), màu đỏ, cam (Tơ mộc) màu xanh (Lá dứa) Đây học chưa nghiên cứu