BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG UNG THỊ NHƯ TRUYỀN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ CHUYỂN HOÁ MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦA AXIT ASIATIC TỪ CÂY RAU MÁ [Centella asiatica (L.) Urban] Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 60 44 27 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng - 2012 Công trình ñược hoàn thành tại ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: GS.TSKH. TRẦN VĂN SUNG Phản biện 1 : PGS.TS. LÊ THỊ LIÊN THANH Phản biện 2 : PGS.TS. LÊ TỰ HẢI Luận văn ñã ñược bảo vệ trước hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khoa học họp tại Đại học Đà Nẵng vào ngày 14 tháng 11 năm 2012. Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin – Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Thư viện trường Đại Học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng 1 MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay trong thế giới hiện ñại, công nghiệp phát triển kéo theo nhiều vấn ñề về môi trường, sinh thái và sức khoẻ con người. Mô hình bệnh tật vì thế cũng ngày càng phức tạp hơn. Gần ñây thế giới luôn phải ñối mặt với những dịch bệnh nguy hiểm và có khả năng lan rộng thành ñại dịch ở quy mô toàn cầu. Có thể lấy một số ví dụ ñiển hình như HIV/AIDS, ung thư, viêm ñường hô hấp cấp SARS, cúm gia cầm H5N1, cúm lợn H1N1, tim mạch v.v Thực tế ñó ñã thúc ñẩy chúng ta luôn luôn phải tìm ra các thuốc chữa bệnh mới, có hiệu quả cao hơn, tác dụng chọn lọc hơn và giá thành rẻ hơn. Một trong những con ñường hữu hiệu ñể phát hiện ra các chất có hoạt tính tiềm năng, có thể phát triển thành thuốc chữa bệnh cho người, gia súc và cây trồng là ñi từ các hợp chất thiên nhiên. Các hợp chất thiên nhiên ñã trải qua hàng triệu năm tiến hóa, nó tương ñối phù hợp với cơ thể sống, ít ñộc hơn và thân thiện với môi trường. Người ta có thể sử dụng các hợp chất thiên nhiên một cách trực tiếp ñể làm thuốc, hoặc sử dụng làm các mô hình ñể nghiên cứu tổng hợp các thuốc mới. Cây rau má là một trong những cây thuốc ñược sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền ở các nước trong khu vực ñông Á như: Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Sri lanka, Việt Nam…, do ñó ñã thu hút ñược rất nhiều sự chú ý của các nhà hóa học. Các nghiên cứu thử nghiệm trong ống nghiệm về các dịch chiết của cây rau má trong CHCl 3 và etanol 95%, ñã cho thấy các dịch chiết này ñều có các hoạt tính sinh học ñáng chú ý như: hoạt tính kháng viêm, hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính chống u và có tác dụng bảo vệ gan. Nguồn rau má mọc tự nhiên ở Việt Nam khá dồi dào. Tuy vậy, cây chỉ ñược khai thác và sử dụng tại chỗ, chưa trở thành mặt hàng thương mại hóa [1]. Thành phần hóa học chính của cây rau má gồm các hợp chất triterpen và triterpen glucosid như axitasiatic, asiaticosid, axitmadecassic, madecassoid, irahmosid, brahminosid. Ngoài 2 ra cây rau má còn chứa tinh dầu với mùi thơm ñặc trưng, các hợp chất polyacetylen, flavonoid, vitaminC, ancaloid và oligosacharid [1, 17]. Từ những lí do trên trong bản luận văn này chúng tôi ñặt nhiệm vụ “nghiên cứu chiết tách và chuyển hoá một số dẫn xuất của axit asiatic từ cây rau má [Centella asiatica (L.) urban] “ 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Chiết tách và tinh chế axit asiatic từ cây rau má Việt Nam - Chuyển hoá một số dẫn xuất - Thăm dò hoạt tính sinh học + Hoạt tính gây ñộc tế bào + Thăm dò hoạt tính sinh học. 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Tách, tinh chế axit asiatic từ dịch chiết EtOH của cây rau má. - Tổng hợp các dẫn xuất của axit asiatic. - Thử hoạt tính sinh học của các dẫn xuất sạch thu ñược. 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4.1. Chiết tách axit asiatic trong cây rau má - Chiết tách và tinh chế axit asiatic. - Định lượng axit asiatic. 4.2. Phương pháp tổng hợp hữu cơ Các phản ứng ñược thực hiện bằng các phương pháp tổng hợp hữu cơ cơ bản như phương pháp khử, phương pháp oxi hóa, phương pháp ankyl hóa, phương pháp axyl hóa, phương pháp thế, . 4.3. Phương pháp sắc ký bản mỏng theo dõi quá trình phản ứng Phương pháp sắc ký lớp mỏng ñược sử dụng ñể giám sát tiến trình xảy ra của các phản ứng hóa học và phân tích chất lượng sản phẩm của phản ứng. 3 4.4. Phương pháp phân lập và tinh chế Các hợp chất sau phản ứng ñược phân lập và tinh chế bằng các phương pháp chiết, phương pháp sắc ký cột silicagel, phương pháp kết tinh, . 4.5. Phương pháp xác ñịnh cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ Các chất tinh khiết sau khi ñược phân lập và tinh chế sẽ ñược xác ñịnh các hằng số lý hóa ñặc trưng như: màu sắc, nhiệt ñộ nóng chảy . Sau ñó tiến hành ghi các phổ như: - Phổ hồng ngoại (FT-IR) ñối với chất rắn ñược ño dưới dạng viên nén KBr, ñối với chất lỏng ñược ño ở dạng màng mỏng (film). - Phổ khối (ESI-MS) ñược ghi trong dung môi CHCl 3 hoặc CH 3 OH. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 1 chiều và 2 chiều sử dụng chất nội chuẩn là TMS (δ = 0 ppm), dung môi CDCl 3 hoặc DMSO-d6 ñược ghi ở tần số 500 MHz cho phổ 1 H-NMR và ở tần số 125 MHz cho phổ 13 C-NMR. Cấu trúc của các hợp chất ñược xác ñịnh bằng sự kết hợp các phương pháp phổ và so sánh tài liệu. 4.6. Phương pháp sinh học Thăm dò hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp ñược tại phòng thử hoạt tính của Viện Hoá học. 5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Từ các kết quả nghiên cứu, luận văn ñã thu ñược một số kết quả với những ñóng góp thiết thực sau: - Đã xác ñịnh ñược các ñiều kiện tối ưu ñể thực hiện qui trình chiết, tách axit asiatic và axit madecassic từ cây rau má. - Từ dịch chiết EtOH của rau má ñã phân lập ñược 3 chất sạch - Đã tổng hợp ñược 4 dẫn xuất của axit asiatic trong ñó dẫn 41 (RMDV25mE) là chất mới. - Cấu trúc của các chất trên ñã ñược xác ñịnh bằng việc kết hợp các 4 phương pháp phổ hiện ñại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối phân giải (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H -NMR, 13 C-NMR,DEPT và phổ NMR hai chiều (H-H-COSY, HSQC và HMBC). - Kết quả cho thấy hầu hết các chất ñều có hoạt tính ức chế sự phát triển của 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm là KB (ung thư biểu mô), HepG2 (ung thư gan) và Lu (ung thư phổi). Các chất 40, 42 và 43 có hoạt tính mạnh hơn axit asiatic ban ñầu. 6. BỐ CỤC CỦA LUẬN VĂN Nội dung luận văn chia làm 4 chương Chương 1: Tổng quan Chương 2: Nguyên liệu hoá chất và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Thực nghiệm Chương 4: Kết quả nghiên cứu và thảo luận CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY RAU MÁ VIỆT NAM Cây rau má có tên khoa học là Centella asiatica (Linn) Urban. Thuộc họ hoa tán (Apiaceae), tên thường gọi là rau má, có tên khác là Tích huyết thảo, Cây thảo mọc bò, phân nhánh nhiều trên mặt ñất. Rễ mọc từ các mấu của thân. Lá có cuống dài mọc ra từ gốc hoặc từ các mấu. Lá hơi tròn, có mép khía tai bèo, trông giống như những ñồng tiền tròn ñược xếp nối tiếp nhau nên còn gọi là Liên tiền. Cụm hoa hình tán ñơn mọc ở nách lá gồm 1-5 hoa nhỏ, cuống màu trắng hoặc phớt ñỏ. Quả dẹt, có sống hơi rõ. Là một thứ rau dại ăn ñược thường mọc ở những nơi ẩm ướt như thung lủng, bờ mương thuộc những vùng nhiệt ñới như Việt nam, Lào, Campuchia, Indonesia, Malaysia, Srilanka, Ấnñộ, Pakistan, Madagascar [1]. 5 Dân gian thường dùng rau má trị cảm mạo, phong nhiệt, thuỷ ñậu, sởi, sốt da vàng mặt, viêm họng, viêm khí quản, ho, viêm ñường tiết niệu, ñái dắt ñái buốt, còn dùng trị thổ huyết, chảy máu cam, tả lỵ, khí hư, bạch ñới, giải ñộc lá ngón và nhân ngôn. Dùng ngoài trị rắn cắn, mụn nhọt, lở ngứa và vết thương chảy máu. Ở Trung Quốc, rau má ñược dùng trị cảm mạo, phong nhiệt, viêm phần trên ñường hô hấp, viêm gan, lỵ, cúm, ăn phải vật có ñộc, viêm màng phổi, rắn cắn, gai ñâm vào thịt, trúng ñộc nấm dại, ngộ ñộc sắn, trúng ñộc thuốc nông dược, ngộ ñộc thức ăn và ñòn ngã tổn thương. Từ những năm 1940, y học hiện ñại bắt ñầu nghiên cứu những tác dụng của rau má. Rau má có những hoạt chất thuộc nhóm saponins (còn ñược gọi là tripernoids) bao gồm asiaticoside, madecassoside, madecassic acid và asiatic acid. Hoạt chất asiaticoside ñã ñược ứng dụng trong ñiều trị bệnh phong và bệnh lao. Người ta cho rằng trong những bệnh này, vi khuẩn ñược bao phủ bởi một màng ngoài giống như sáp khiến cho hệ kháng nhiễm của cơ thể không thể tiếp cận. Chất asiaticoside trong dịch chiết rau má có thể làm tan lớp màng bao nầy ñể hệ thống miễn dịch của cơ thể tiêu diệt chúng. Tuy nhiên, ở nước ta các công trình nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào mặt thực vật học. Trong số các loại rau má thì cây rau má có tên khoa hoc: Centella asiatica (Linn) Urban, ñược sử dụng rộng rã trong các bài thuốc ñông y, ñặc biệt rất nhiều các nhà khoa học trên thế giới ñã nhiều năm nghiên cứu thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của chúng. 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGOÀI NƯỚC 1.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC 6 CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU Axit asiatic ñược phân lập từ cây rau má ñược thu hái tại Sơn Tây, Hà Nội vào tháng 10 năm 2011. 2.2. DUNG MÔI VÀ HOÁ CHẤT NGHIÊN CỨU Các dung môi ñược sử dụng ñể chiết tách và tinh chế là: Ethanol, methanol, n-hexan, etyl axetat, chloroform Các tác nhân và hóa chất tinh khiết dùng cho các quá trình tổng hợp dẫn xuất và phân tích ñược mua từ hãng Sigma-aldrich, Merck hoặc Trung Quốc. 2.3. CHIẾT TÁCH AXIT ASIATIC TRONG CÂY RAU MÁ Nguyên liệu rau má tươi ñược sấy khô, xay nhỏ và chiết với các dung môi và các phương pháp khác nhau. Cặn chiết ñược loại tinh dầu và các chất béo bằng n-hexan. Cặn ñược thủy phân trong dung dịch NaOH, trung hòa với HCl sau ñó ñược kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng, sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) ñể xác ñịnh hàm lượng axit asiatic và các tritecpen khác. 2.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN HOÁ HOÁ HỌC Các phản ứng hóa học ñược thực hiện theo các phương pháp thông dụng trong các phòng thí nghiệm tổng hợp hữu cơ. Các phản ứng của các chất nhạy cảm với hơi ẩm và không khí ñược tiến hành trong môi trường có khí trơ. Các dung môi phản ứng ñược làm khan trong thiết bị chuyên dụng. 2.5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HOÁ HỌC CỦA CÁC CHẤT Việc xác ñịnh cấu trúc hóa học của các chất sạch ñược thực hiện thông qua việc kết hợp các phương pháp phổ hiện ñại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (MS), sắc kí lỏng cao áp gắn với khối phổ (LC/MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR) như 1 H, DEPT, COSY, HSQC và HMBC. Trong trường hợp cần thiết sẽ ñiều 7 chế dẫn xuất acetyl của những chất chứa nhóm hydroxyl ñể khẳng ñịnh thêm cấu trúc của chúng. 2.6. PHƯƠNG PHÁP THĂM DÒ HOẠT TÍNH SINH HỌC 2.6.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh 2.6.2.Phương pháp thử ñộ ñộc tế bào CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 3.1. KHẢO SÁT CÁC THÔNG SỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT TÁCH AXIT ASIATIC VÀ CÁC TRITERPEN KHÁC 3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ñộ chiết tới hàm lượng axit asiatic và axit madecassic. 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ dung môi chiết tới hàm lượng axit asiatic 3.1.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết Kết luận Bằng các phương pháp phân tích với 9 mẫu thí nghiệm khảo sát, chúng tôi ñã xác ñịnh ñược các ñiều kiện tối ưu ñể thực hiện qui trình chiết, tách axit asiatic và axit madecassic từ cây rau má. Các ñiều kiện ñó như sau: + Nồng ñộ dung môi chiết là etanol (80%) + Thời gian chiết là 2 giờ cho một lần (chiết 2 lần). + Nhiệt ñộ chiết là 80 O C Từ kết quả khảo sát này, chúng tôi áp dụng ñể nghiên cứu qui trình chiết, qui mô phòng thí nghiệm. 3.2. QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH AXIT ASIATIC VÀ CÁC TRITERPEN KHÁC 3.2.1. Quy trình chiết tách (theo sơ ñồ 1) 8 kg rau má tươi ñược sấy ở 45 0 C, thu ñược 900 gam khô, xay nhỏ và ngâm chiết lần một với 3,6 lít EtOH ở nhiệt ñộ 80 0 C trong 2 giờ, lọc 8 qua phễu lọc thu ñược 2,5 lít dịch chiết. Bã ñược chiết thêm 1 lần nữa với EtOH (2,5 lít). Thời gian rút dịch chiết là 2 tiếng/lần. Gộp dịch lại, quay cất dung môi dưới áp suất giảm, ở nhiệt ñộ 50 0 C, thu ñược 165 gam cặn EtOH. Cặn chiết thu ñược ñược chế thêm nước cất. Sau ñó chiết lần lượt với n-hexan và chloroform. Các dịch chiết ñược cất loại dung môi cho ñến khi khô sẽ thu ñược 20 gam cặn n-hexan, 25 gam cặn chloroform và 120 gam cặn dịch nước. Các chất phân lập từ dịch chiết EtOH của cây rau má Tên chất Cấu trúc Hiệu suất (so với mẫu khô) Axit asiatic (RM1) 0,37% Axit Madecassic (RM2) 0,43% Stigmasterol glucoside + β-sitosterol glucoside (RM3) 0,096% 3.3. TỎNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA AXIT ASIATIC Sau khi chiết tách và tinh chế ñược axit asiatic là có ñộ sạch > 98%, tiến hành tổng hợp các dẫn xuất của axit asiatic theo sơ ñồ 2.