1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Cơng trình ñược hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRẦN VĨNH THỌ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÁC DỊCH CHIẾT N – HEXAN VÀ ETYL AXETAT TỪ CỦ RỄ CÂY BÔNG GIỜ (CURCUMA COCHINCHINENSIS GAGNEP.) Ở TỈNH PHÚ YÊN _ VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ Mã số: 60 44 27 Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ BÍCH TUYẾT Phản biện 1: GS TS Đào Hùng Cường Phản biện 2: TS Trịnh Đình Chính Luận văn bảo vệ Hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ khoa học họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 30/11/2012 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC * Có thể tìm hiểu luận văn tại: Đà Nẵng, 2012 − Trung tâm Thông tin – Học liệu, Đại học Đà Nẵng − Thư viện Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng MỞ ĐẦU phần vào việc nghiên cứu, khai thác sử dụng có hiệu nguồn Lí chọn đề tài Việt Nam thuộc vùng nhiệt đới gió mùa ẩm, lồi thực vật phong phú đa dạng Chúng đóng vai trị quan trọng đời tài ngun sẵn có Mục tiêu nghiên cứu Xác ñịnh thành phần dịch chiết n-hexan etyl axetat từ củ rễ sống người dân cung cấp lương thực thực phẩm, sản phẩm cho (Curcuma cochinchinensis Gagnep.) ngành cơng nghiệp vị thuốc q để chữa nhiều loại Giới hạn ñề tài bệnh khác Do nghiên cứu lồi thực vật để có hiểu Dịch chiết n-hexan etyl axetat từ củ rễ biết sâu thành phần hóa học dược tính chúng để ứng dụng (Curcuma cochinchinensis Gagnep.) thu hái TX Sông Cầu – Tỉnh cách an toàn hiệu vấn ñề ñang ñược quan tâm Phú Yên Phương pháp nghiên cứu Các chi nghệ (Curcuma) lồi có từ xa 4.1 Nghiên cứu lí thuyết xưa giới thực vật Việt Nam với số lồi đa dạng phong phú 4.2 Nội dung nghiên cứu Chúng ñược người dân sử dụng với nhiều mục đích khác làm - Tổng quan cơng trình nghiên cứu ñặc ñiểm hình thái thực gia vị bột màu cho ăn, chữa nhiều bệnh khác vật, thành phần hóa học thuộc chi nghệ nói chung củ rễ ung thư, đau dày, làm lành vết sẹo, liền da,…Với ứng dụng lồi Curcuma cochinchinensis Gagnep nói riêng rộng rãi nên có nhiều tác giả giới Việt Nam nghiên cứu số loài thuộc chi Cây Phú Yên (Curcuma cochinchinensis Gagnep.), thuộc chi nghệ Người ta bào chế thân rễbơng mật ong để làm mỹ phẩm chữa bệnh viêm da mãn tính mụn trứng cá Phụ nữ sau sinh ăn ngày muỗng dạng bột giúp ngon miệng bồi bổ thể - Chiết củ rễ khô Curcuma cochinchinensis Gagnep n hexan sau chiết với dung môi etyl axetat - Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết n-hexan etyl axetat GC/MS - Tiến hành sắc ký cột sắc ký mỏng để tách số cấu tử có dịch chiết etyl axetat - Xác ñịnh cấu trúc cấu tử tách ñược dựa vào phương pháp vật Với tầm quan trọng ý nghĩa thực tiễn nêu thực ñề tài: lý ñại: phổ UV-Vis; IR; MS; 1H-NMR; 13C-NMR "Nghiên cứu chiết tách số hợp chất hòa tan dịch chiết Kết giá trị thực tiễn luận văn n – hexan etyl axetat củ rễ (Curcuma cochinchinensis Gagnep.) tỉnh Phú Yên _ Việt Nam” nhằm góp - Các kết thu tài liệu tham khảo cho nghiên cứu Bảng 2.1 Sơ ñồ tách chiết dịch chiết củ rễ Curcuma cochinchinensis Gagnep vấn đề có Củ rễ Curcuma cochinchinensis Gagnep liên quan (1) - Sự thành công luận văn cho phép khai thác sử dụng có hiệu nguồn dược liệu Curcuma cochinchinensis Gagnep Rửa sạch, cạo vỏ, thái nhỏ, sấy khơ, cân xác khối lượng xay thành bột so với thuốc dân gian dùng (2) Bố cục luận văn Ngâm chiết với n-hexan - Luận văn gồm: 79 trang, có 10 bảng, 25 hình (3) - Ngồi phần mở ñầu, kết luận, tài liệu tham khảo phụ lục, nội dung luận văn gồm chương: + Chương 1: Phần tổng quan + Chương 2: Phần thực nghiệm + Chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận Dịch chiết Đem GC/MS xác thành phần hóa học Bã rắn định Ngâm chiết với (4) etyl axetat Chương PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Sơ lược chi Curcuma 1.2 Đặc ñiểm thực vật thành phần hóa học số lồi thuộc chi Curcuma 1.3 Công dụng số loại nghệ 1.4 Giới thiệu curcumin 1.5 Tình hình nghiên cứu bơng (Curcuma cochinchinensis Gagnep.) Phú Yên mặt hóa học ngồi nước Dịch chiết (5) Cơ đuổi dung môi (6) Cao (7) Dịch chiết Đem GC/MS LC/MS xác định thành phần hóa học Sắc ký cột, mỏng ñể tách cấu tử (8) UV-Vis; IR; MS; NMR Chương PHẦN THỰC NGHIỆM 2.1 Xác ñịnh tên khoa học 2.2 Xử lý mẫu thực vật 2.3 Chuẩn bị mẫu dịch chiết Bã rắn Cấu trúc phân tử hợp chất hữu 2.3.1 Xác ñịnh thời gian ngâm tối ưu dung môi n-hexan Chuẩn bị bình tam giác với dung tích Song song với ta chuẩn bị gói bột củ bơng gói giấy lọc, gói cân xác 5g bột Giấy lọc gói cho bột khơng bị bung Đem ngâm gói bột củ bơng vào bình tam giác có Hình 2.4 Bột củ Phú 50 ml n-hexan cho bình Yên ngâm cách Sau cho n-hexan vào ngâm, ñem khuấy bể lắc siêu âm khoảng 15 phút tiếp tục ngâm Làm cho đủ bình Sau 48 lấy phần gói bã khỏi bình tam giác, lấy dịch vừa ngâm ñem ño phổ UV-Vistrong vùng 349 - 780 nm, xác ñịnh ñược bước song hấp thụ cực ñại 729 nm mật ñộ quang dung dịch bước sóng Kết trình bày hình 2.5 bảng 2.2 cho thấy kéo dài thời gian chiết, dung dịch thu có mật ñộ quang tăng hay lượng chất tan tăng ñạt cực ñại chiết ñến Như thời gian chiết tối ưu ñối với hệ chiết 24 Hình 2.5 Đồ thị biểu diễn hấp phụ cực ñại dịch chiết 24 khoảng bước sóng từ 340nm – 780nm 9 Bảng 2.2 Thời gian chiết tối ưu dung môi n – hexan 24 10 lắc siêu âm vòng 15 phút bình Sau 24 ngâm ta lấy bã rắn gói ra, lấy dịch chiết tương ứng đem ño ñộ hấp thụ cực ñại máy UV-Vis với bước sóng từ 340-729 nm Tương ứng với mẫu có mật độ quang cực đại kết luận độ tan tương ứng bột củ trường hợp ñó lớn Kết tỉ lệ 3,5g bột 40 ml dung mơi n-hexan mật độ quang lớn Ngâm mẫu tương ứng chiết tách với thời gian tối ưu nồng ñộ tối ưu Cân xác 43,753g bột cho vào bình với 500 ml n-hexan ñem khuấy bể lắc siêu âm khoảng 15 phút ñem ngâm thời gian 24 Lọc lấy bã rắn phần dịch chiết Đem chưng cất thu hồi dung môi (ký hiệu DMH1) dịch chiết đặc (ký hiệu DCH1), thu hai gửi phân tích GC/MS phịng Khối phổ, Trường Đại học sư phạm Huế − Đại học Huế 2.3.2 Xác ñịnh ñộ tan tối ưu dung môi n-hexan Sau ta xác ñịnh ñược thời gian ngâm tối ưu, ta tiếp tục xác ñịnh ñộ tan tối ưu dung mơi n-hexan Ta dùng bình tam giác với dung tích Cân xác khối lượng bột củ tương ứng 1,5g, 2,0g, 2,5g, 3,0g, 3,5g, 4,0g, 4,5g gói chúng giấy lọc Ngâm gói vào bình tam giác, thể tích n-hexan với bình 40ml, đem ngâm với thời gian tối ưu (24 giờ) tìm Sau cho n-hexan vào ngâm ñem khuấy nhờ bể 11 12 Bảng 2.3 Tỉ lệ chiết tối ưu dung môi n – hexan 3,5g bột 40ml Hình 2.6 Đồ thị biểu diễn hấp phụ cực ñại dịch chiết 18 khoảng bước sóng từ 200nm – 400nm Kết dịch chiết etyl axetat, thời gian chiết tối ưu 18 2.3.3 Xác ñịnh thời gian ngâm tối ưu độ tan tối ưu dung mơi etyl axetat Phần bã rắn sau chiết với n-hexan giai đoạn 3, làm tương tự tìm thời gian tối ưu độ tan tối ưu dung mơi n-hexan tỉ lệ chiết tối ưu 3g bột 40 ml dung mơi bước sóng 281 nm 13 14 Cân xác 39,413g bột sau ngâm chiết với n-hexan, ñem Bảng 2.4 Thời gian chiết tối ưu dung môi etyl axetat 18 ngâm với 525,51 ml etyl axetat ñem khuấy bể lắc siêu âm khoảng 15 phút, ngâm chiết thời gian 18 Bảng 2.5 Tỉ lệ chiết tối ưu dung môi etyl axetat 3,0g bột 40ml bước sóng 281nm Đem chưng cất thu hồi dung mơi dịch chiết cạn khoảng 100 ml ký hiệu DCE1, đem tiếp tục cạn cịn khoảng 20ml ñược dịch chiết cô lần ký hiệu DCE2 15 16 * GC/MS: Phổ ñược ghi máy GC/MS HP 5890, hệ GC (có cột tách mao quản kích thước 30m x 0,25mm x 0,25 µm, độ chia 40ml/phút, khí mang He, dung mơi n-hexan) theo chương trình nhiệt ñộ tăng 80C/phút từ 450C-2000C 150C/phút từ 2000C-3000C, Injector 2500C Detector 2800C Hệ GC ñược ghép với máy ño phổ khối kèm thư viện liệu WILEY 275.L ñể so sánh nhận diện cấu tử * LC/MS: Hệ LC thực cột tách C18 pha đảo có kích thước 15cm x 2,1mm, dung mơi hệ axetonitril nước, thực nhiệt độ phịng, nhiệt độ buồng ion hóa 3250C Hệ LC ñược ghép Hình 2.7 Sơ ñồ chưng cất thu hồi dung mơi với máy đo phổ khối 2.5 Phân lập xác định cấu trúc Chúng tơi tiến hành phân lập xác ñịnh cấu trúc cấu tử dịch chiết cô cạn DCE2 2.5.1 Sắc ký lớp mỏng (SKLM) Dịch chiết cạn DCE2 tiến hành thử SKLM để tìm hệ dung mơi tốt trình rửa giải cột sắc ký Bản mỏng Silicagel Merck tráng sẵn nhơm, độ dày 0,25 mm Sau triển khai Hình 2.8 Dung mơi n-hexan thu Hình 2.9 Dung mơi etyl acetat thu với hệ dung mơi, mỏng sấy khơ nhận diện chất qua hồi dịch chiết n-hexan đặc hỗn hợp dung dịch H2SO4 (98%) vanilin hồi dịch chiết etyl axetat đặc 2.4 Xác ñịnh thành phần hóa học Các cấu tử dung môi chiết (DMH1) dịch chiết cô cạn (DCH1) từ dịch chiết n-hexan dịch chiết etyl axetat (DCE1) ñược nhận diện xác ñịnh hàm lượng phương pháp GC/MS sở so sánh với liệu phổ phòng Khối phổ, Trường Đại học sư phạm Huế − Đại học Huế SKLM ñược tiến hành ñể nhận diện gộp phân ñoạn trình sắc ký cột Cách tiến hành SKLM: dùng hệ dung môi n-hexan etyl axetat với tỉ lệ tăng dần ñộ phân cực sau: 17 Tỉ lệ thể n-hexan tích dung (ml) mơi 18 Cột ñược nhồi silicagel theo phương pháp nhồi khơ Dịch chiết cạn DCE2 ñưa lên cột tiến hành rửa giải với hệ dung môi theo tỉ Etyl axetat 2.5.2 Sắc ký cột, tách tinh chế (ml) lệ tìm SKLM Silicagel cỡ hạt từ 40 – 60 µm, Merck, cột dài 45cm, đường kính 1,0cm Bình đựng bão hịa dung môi theo tỉ lệ, dung môi cao khoảng Sau trình sắc ký cột, thử SKLM với hệ dung mơi trên, 0,5cm, mỏng vạch bút chì khoảng 1,0cm Chấm mẫu thử vết hỗn hợp vanilin axit H2SO4 đặc thấy có vệt trịn màu micropipet, vết chấm ñường vạch cách 1,0cm xanh tím, tiến hành đo Rf = 3, = 0, 377 , đem đuổi dung mơi 8, Sau lần thay ñổi tỉ lệ thể tích dung mơi, ta lấy mỏng sấy khơ nhận diện hỗn hợp dung dịch H2SO4 (98%) vanilin, chất rắn màu vàng cân nặng 42mg (ký hiệu THO – HHC K22) thấy mỏng có cấu tử tách tốt ta chọn tỉ lệ dung Gửi Phòng cộng hưởng từ hạt nhân, Viện Hóa học, Viện KH&CN Việt mơi để tách tinh chế sắc ký cột Nam ñể ño phổ MS, IR, 1H-NMR 13C-NMR Kết quả: ta chọn ñược tỉ lệ n – hexan etyl axetat : thể tích Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tên khoa học Sau phân tích đối chiếu với tài liệu có kết luận bơng Phú Yên có tên khoa học Curcuma cochinchinensis Gagnep., họ Zingiberaceae, Zingiberales 3.2 Thành phần hóa học dịch chiết củ rễ Curcuma cochinchinensis Gagnep Phú Yên 3.2.1 Thành phần hóa học dung mơi chiết (DMH1) nhexan Khơng có kết chạy GC/MS Hình 2.10 Bản mỏng hỗn hợp dung dịch tỉ lệ n – hexan etyl axetat : thể tích 3.2.2 Thành phần hóa học dịch chiết cạn (DCH1) từ dịch chiết n-hexan Khơng có kết chạy GC/MS 19 Giải thích: Có thể chất tan dịch chiết cạn DCH1 có khối lượng phân tử lớn có nhiệt độ hóa cao nên nhiệt ñộ 0 buồng ñốt từ 45 C ÷ 250 C chưa đủ làm hóa chất Vì chạy 20 Trong phổ ESI – MS chất rắn xuất peak [M+H]+ = 369,121 Vậy khối lượng phân tử chất M = 368,121 3.3.2.2 Phổ hồng ngoại IR GC/MS có dung mơi 3.2.3 Thành phần hóa học dịch chiết (DCE1) Có 21 chất định danh, ñó có chất chiếm tỉ lệ cao αPinene (14,449%), 1,2-Diisopropenylcyclobutane (14,316%), 3.3 Phân lập xác ñịnh cấu trúc cấu tử tách từ dịch cao dịch chiết etyl axetat (DCE2) 3.3.1 Phân lập Sau trình sắc ký cột dịch chiết cạn DCE2 tơi phân lập ñược chất rắn màu vàng tươi, tinh thể hình kim, ký hiệu: THO – HHC K22 3.3.2 Xác ñịnh cấu trúc Gửi mẫu (THO – HHC K22) ñến phịng cộng hưởng từ hạt nhân, Viện Hóa học, Viện KH&CN Việt Nam ñể ño phổ MS, IR, 1HNMR 13C-NMR Kết thu ñược sau: 3.3.2.1 Phổ MS: Hình 3.2 Phổ hồng ngoại IR chất rắn THO – HHC K22 Trong phổ hồng ngoại IR chất rắn ta thấy có đỉnh đặc trưng Hình 3.1 Phổ MS chất rắn THO – HHC K22 so sánh với tài liệu cơng bố có nhiều ñiểm tương ñồng 21 22 Bảng 3.1 So sánh λ liên kết, nhóm chức chất rắn với tài liệu cơng bố Liên kết λ chất nhóm rắn đo chức λ References λ References [30] λ References [8] [17] − OH 3410,50 3600 ÷ 3200 3511,27 3410 −C=O 1627,37 1750 ÷1650 1627,10 1640 − O − CH3 2835,20 2960 ÷ 2850 2925 −C=C 1541,08 1650 ÷ 1600 2900,85 1602,87 1610 − C – O – 1028,44 1150 ÷ 1100 1153,79 1150 2998,56 3050 3015,62 2930 1599,45 1600 1508,09 1500 1509,23 1515 1437,03 1470 1429,61 1422 815,26 900 ÷ 700 856,35 815 C− Hình 3.3 Phổ 1H-NMR chất rắn THO – HHC K22 3.3.2.3 Phổ 1H-NMR Hình 3.4 Phổ 1H-NMR hex chất rắn THO – HHC K22 23 24 Trong phổ 1H-NMR chất rắn có 20 tín hiệu, chứng tỏ hợp chất có 20 ngun tử hiđro Bảng 3.2 Bảng so sánh liệu phổ 1H-NMR chất rắn tách ñược với liệu phổ 1H-NMR tài liệu ñã ñược công bố δ (ppm), số hidro, số vân phổ Vị trí References[1] References[41] 6,057, 2H, s 6,06, 2H, s 6,10, 2H, s 3, 3’ 6,738 ÷ 6,770, 2H, d 6,75, 2H, d 6,79, 2H, d 4, 4’ 7,529 ÷ 7,560, 2H, d 7,55, 2H,d 7,41, 2H, d Đo ñược 2, 2’ 5, 5’ Hình 3.5 Phổ 13C-NMR chất rắn THO – HHC K22 6, 6’ 7,318 ÷ 7,322, 2H, d 7,31, 2H, d 7,30, 2H, d ’ 7, 9, 9’ 6,813 ÷ 6,830, 2H, d ’ 10, 10 7,140 ÷ 7,143 6,80, 2H, d ÷ 7,15, 2H, dd 6,90, 2H, d 7,20, 2H, dd 7,156 ÷ 7,159, 2H, dd OCH3 2,296 ÷ 2,500 ÷ 3,84, 6H, s 2,503 ÷ 3,363 ÷ 3,70, 6H, s 3,816 ÷ 3,835, 6H, s 8, 8’- 9,666, 2H, s OH 9,65, 2H, s 9,69, 2H, s Bảng 3.3 Bảng so sánh liệu phổ 13C-NMR chất rắn tách ñược với liệu phổ 13C-NMR tài liệu cơng bố Vị trí C Đo References[1] References[41] 100,785 ÷ 100,864 100,841 101,60 ’ 2, 183,161 183,206 184,50 3, 3’ 120,767 ÷ 121,085 121,110 122,30 ’ 4, 140,325 ÷ 140,658 140,707 141,40 5, 5’ 125,812 ÷ 126,334 126,360 128,20 6, 6’ 111,303 ÷ 111,387 111,375 111,60 ’ 7, 147,978 148,007 148,80 8,8’ 149,334 149,358 150,10 9, 9’ 115,706 ÷ 115,893 115,727 116,20 ’ 10, 10 123,053 123,110 123,80 OCH3 55,682 55,708 56,30 8, 8’-OH Kết so sánh cho thấy liệu phổ IR, 1H-NMR 13 3.3.2.4 Phổ C-NMR 13 C-NMR chất rắn tách ñược phù hợp với liệu phổ hợp chất 25 26 curcumin cơng bố Vì vậy, tơi khẳng định chất rắn tơi phân lập curcumin hay 1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6heptadiene-3,5-dione, có cơng thức phân tử: C21H20O6, công thức cấu HO – Kết luận Trong phạm vi nghiên cứu ñề tài, ñã thu ñược số kết sau ñây: tạo sau: H 3CO KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 10 O o 2' 4' ' 5' 6' 7' O CH cochinchinensis Gagnep., họ Zingiberaceae, Zingiberales 8' 10 ' 9' Xác định tên khoa học bơng Phú Yên Curcuma OH Phân tích GC/MS phần dịch chiết n-hexan dung môi chiết n-hexan củ rễ Curcuma cochichinensis Gagnep thu hồi, Hoặc không cho kết Chứng tỏ thành phần không chứa hợp chất có khả bay khoảng nhiệt độ từ 450C đến 2500C Thành phần hóa học dịch chiết etyl axetat có 21 chất ñịnh danh, ñó có chất chiếm tỉ lệ cao α-Pinene (14,449%), 1,2-Diisopropenylcyclobutane (14,316%), 3.4 Tỉ lệ curcumin bột củ rễ Curcuma cochichinensis Gagnep Phú Yên H= Từ cao chiết etyl axetat củ rễ Curcuma cochichinensis Gagnep phân lập ñược chất kết tinh màu vàng với tỉ lệ 0,096% mcurcu 0,042 100% = 100% = 0,096% msanpham 43,753 Kết hợp phương pháp phổ MS, IR, 1H-NMR 13C-NMR, ñã xác ñịnh ñược cấu trúc tên chất rắn màu vàng curcumin hay 1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione – Kiến nghị Curcumin chất có hoạt tính sinh học cao chiết tách từ Curcuma longa Linn ñược giới quan tâm tác dụng Chất tìm thấy củ rễ Curcuma cochichinensis Gagnep., ñây kết ñáng ý hướng sử dụng bột củ rễ Curcuma cochichinensis Gagnep có ứng dụng giá trị thực tiễn cao  ... ngun s? ?n có Mục tiêu nghi? ?n cứu Xác ñịnh thành ph? ?n dịch chiết n- hexan etyl axetat từ củ rễ sống người d? ?n cung cấp lương thực thực phẩm, s? ?n phẩm cho (Curcuma cochinchinensis Gagnep. ) ngành công... cochinchinensis Gagnep n? ?i riêng rộng rãi n? ?n có nhiều tác giả giới Việt Nam nghi? ?n cứu số loài thuộc chi Cây Phú Y? ?n (Curcuma cochinchinensis Gagnep. ), thuộc chi nghệ Người ta bào chế th? ?n rễbơng... ti? ?n lu? ?n v? ?n n – hexan etyl axetat củ rễ (Curcuma cochinchinensis Gagnep. ) tỉnh Phú Y? ?n _ Việt Nam? ?? nhằm góp - Các kết thu ñược tài liệu tham khảo cho nghi? ?n cứu Bảng 2.1 Sơ ñồ tách chiết dịch