BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Khoa Công Nghệ Sinh Học -----***----- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐỀ TÀI: : NGHIÊN CỨU VỀ VAI TRÒ CỦA GEN GERK TRONG NHÓM GEN SINH TỔNG HỢP GỐC ĐƯỜNG KHỬ CỦA CẤU TRÚC KHÁNG SINH DIHYDROCHALCOMYCIN Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện Lớp : : : TS. Tạ Thị Thu Thủy Phạm Chí Công KS. CNSH 06-04 Hà Nội – Tháng 6/2010 Khóa luận tốt nghiệp VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Khoa Công Nghệ Sinh Học -----***----- Khóa luận tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng cám ơn chân thành nhất tới các thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Hà Nội đã trang bị cho tôi những kiến thức, thiết bị và hóa chất nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Cô giáo TS. Tạ Thị Thu Thủy – Người đã trực tiếp giao đề tài và hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện để tài. Tôi xin gửi lời cám ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên em trong suốt thời gian em thực hiện đề tài. Qua thời gian nghiên cứu đề tài, mặc dù bản thân đã có nhiều cố gắng, nhưng khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, hạn chế, rất mong nhận được những ý kiến góp ý của các thầy, cô giáo cũng như các bạn trong lĩnh vực nghiên cứu. 1 ĐỀ TÀI: : NGHIÊN CỨU VỀ VAI TRÒ CỦA GEN GERK TRONG NHÓM GEN SINH TỔNG HỢP GỐC ĐƯỜNG KHỬ CỦA CẤU TRÚC KHÁNG SINH DIHYDROCHALCOMYCIN Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện Lớp : : : TS. Tạ Thị Thu Thủy Phạm Chí Công KS. CNSH 06-04 Hà Nội – Tháng 6/2010 Khóa luận tốt nghiệp Xin trân trọng cám ơn. Hà Nội, ngày 26 tháng 5 năm 2010 Sinh viên Phạm Chí Công MỤC LỤC MỞ ĐẦU .4 CHƯƠNG I: 5 TỔNG QUAN 5 1.1.Đại cương về kháng sinh .5 1.1.1Lịch sử ra đời và phát triển của kháng sinh 5 1.2Gốc đường khử trong cấu trúc kháng sinh 11 1.3Giới thiệu về Enzyme giới hạn 14 1.4Giới thiệu về gerK 14 1.5Vector .17 CHƯƠNG II: .20 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .20 2.1Hóa chất và vật liệu .20 2.2 Các phương pháp nghiên cứu .23 CHƯƠNG III .28 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .28 3.2Kết luận và đề xuất: . 39 2 Khóa luận tốt nghiệp 3.3 Thảo Luận . 40 Tài liệu tham khảo .41 NHỮNG TỪ NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT Amp Ampicillin CNSH Công nghệ sinh học DNA Axit deoxyribonucleic dNTP Deoxiribonucleotide 5’ – triphosphates EDTA Ethylen diamin tetra-acetic acid EtBr Ethidium bromide LB Luria-Bertani OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction RNA Axit ribonucleic SDS Sodium dodecyl sulphate TAE Tris – Acetate –EDTA Taq Polymerase Polymerase Thermus aquaticus TBE Tris – Base –EDTA TE Trophectoderm 3 Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Công nghệ sinh học là một lĩnh vực công nghệ cao dựa trên nền tảng khoa học về sự sống, kết hợp với quy trình và thiết bị kỹ thuật nhằm tạo ra các công nghệ khai thác các hoạt động sống của vi sinh vật, tế bào thực vật và động vật để sản xuất ở quy mô công nghiệp các sản phẩm sinh học có chất lượng cao, phục vụ phát triển kinh tế - xã hội và bảo vệ môi trường. Sinh học phân tử là môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở mức độ phân tử. Phạm vi nghiên cứu của môn này có phần giống với các ngành khác trong Sinh học, đặc biệt là di truyền học và hóa sinh. Sinh học phân tử chủ yếu nghiên cứu tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, gồm quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein cũng như tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này . Ứng dụng những kỹ thuật của CNSH phân tử vào trong đề tài này để nghiên cứu về vai trò của gen gerK trong nhóm gen sinh tổng hợp gốc đường khử của cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin. Cụ thể như các kỹ thuật như PCR nhằm tách dòng gen, cắt gen bằng enzyme giới hạn, tách plasmit, giải trình tự gen,… CNSH nói chung và ngành CNSH Phân tử nói riêng đã và đang được ứng dụng vào trong rất nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, y học, dịch vụ, du lịch… nhằm phục vụ cho mọi nhu cầu của cuộc sống như dinh dưỡng, giải trí, chăm sóc sức khỏe . Bằng những kiến thức sinh học về thực vật, động vật, nấm, vi khuẩn, . và sử dụng “công nghệ DNA tái tổ hợp” những nhà khoa học đang cố gắng tạo ra những cây trồng, vật nuôi có năng suất và chất lượng cao, những loại thực phẩm, dược phẩm phục vụ cho việc chữa bệnh cho con người… 4 Khóa luận tốt nghiệp CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Đại cương về kháng sinh. 1.1.1 Lịch sử ra đời và phát triển của kháng sinh Trước khi Alexander Flemming phát hiện ra tác dụng của kháng sinh, người ta đã biết sử dụng nấm để chữa trị các chứng viêm, chữa trị vết thương bằng cách áp rêu lên vết thương cho chóng khỏi, thậm chí ngay cả những mẫu bánh mỳ mốc cũng được sử dụng để chữa vết thương. Năm 1928, nhà vi khuẩn học người Anh Alexander Flemming đã tình cờ phát hiện hiện tượng nấm xuất hiện trên đĩa và phát triển thành những tảng nấm xung quanh những tảng nấm đó là những vi khuẩn bị phá hủy. Ông chứng minh rằng loại nấm này tiết ra một chất có khả năng ức chế sự phát triển của Staphylococcus, sau này được gọi là penixillin [1]. Năm 1929, ông công bố penicixillin trước dư luận công chúng. Ông khẳng định rằng chất này có thể trở thành một thứ thuốc quan trọng nhưng bản thân ông không có khả năng và kỹ thuật để chiết xuất [1]. Năm 1938, hai nhà khoa học Howara Walter Florey và Ernst Boris Chaen đã chiết được hoạt chất diệt khuẩn từ môi trường nuôi cấy penicillum notatum và hoạt chất được đặt tên là penicillin. Tuy nhiên đến khi chiết được penicillin tinh khiết thì nó mới được thử nghiệm trên người [1]. Năm 1941, các nhà bác học Chain và Florey mới tinh chế được penixillin dưới dạng ổn định và nghiên cứu được phương pháp lên men để điều chế đủ lượng cần thiết cho việc thử lâm sàng, điều trị hiệu nghiệm các bệnh nhiễm khuẩn đã tạo điều kiện nhanh chóng việc đầu tư nghiên cứu sản xuất penixillin ở quy mô công nghiệp. Năm 1944, penixillin đã được sản xuất ở quy mô lớn ở Mỹ để phục vụ chữa trị các bệnh nhiễm khuẩn cho thương bệnh binh trong chiến tranh thế giới thứ II. Sau đó Nga và một số nước khác cũng đã sản xuất được 5 Khóa luận tốt nghiệp penixillin G và penixillin V. Việc phát minh ra penixillin đã tạo được một bước ngoặt quan trọng trong lĩnh vực y học thế giới. Năm 1944, Waksman tìm ra streptomycin bởi nuôi cấy nấm Streptomyces griseus và ông gọi đó là kháng sinh (antibiotics). Đến nay, có hơn 1600 chất kháng sinh được tìm ra nhưng chi có khoảng 150 loài đã được sử dụng rộng rãi (do phần lớn: độc, có tác dụng phụ, phổ kháng khuẩn hẹp, giá thành sản xuất cao…). 1.1.2 Lịch sử kháng sinh ở Việt Nam. Năm 1950, trong kháng chiến chống Pháp, GS Đặng Văn Ngữ đã nuôi cấy Penicillium chrysogenum và dung dịch chiết môi trường nuôi cấy để điều trị vết thương cho thương binh. Năm 1968, bộ môn công nghệ Dược (trường Đại học Dược Hà Nội) được thành lập và đào tạo cán bộ chuyên khoa kháng sinh chuẩn bị cho công nghiệp kháng sinh và năm 1970 đơn vị nghiên cứu chuyên đề kháng sinh được thành lập [14]. Sau đó Việt Nam được nhiều đối tác nước ngoài như Liên Xô (cũ); Trung Quốc; Tây Ban Nha; Triều Tiên hợp tác và giúp sản xuất điều chế kháng sinh, song cũng không thành công do nhiều nguyên nhân. Năm 1985-1990 một chương trình nghiên cứu Nhà Nước 64C của Bộ Y Tế nghiên cứu sản xuất thử kháng sinh oxytetracillin và tetracycline nhưng kết quả đạt được không cao về công nghệ lẫn hiệu suất [4]. Như vậy trong thời gian nghiên cứu, hợp tác điều chế, sản xuất kháng sinh gặp rất nhiều khó khăn nhưng vẫn chưa thành công. 1.1.3 Định nghĩa kháng sinh. Có rất nhiều cách định nghĩa về kháng sinh, nhưng theo Waksman (1942) có thể định nghĩa kháng sinh như sau: “Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tạo ra có tác dụng ức chế phát triển hay tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác” [1]. 6 Khóa luận tốt nghiệp Tuy nhiên định nghĩa này có phần hạn chế và chưa đề cập đến các kháng sinh thực vật, kháng sinh bán tổng hợp và các hợp chất hóa học có tác dụng tiêu diệt chọn lọc các vi sinh vật. Ngày nay, có thể định nghĩa thuật ngữ kháng sinh theo nghĩa rộng là tất cả các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên, tổng hợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chon lọc đối với các vi sinh vật gây bệnh mà không có hoặc hầu như không có tác dụng lên con người, động vật và thực vật bằng con đường cung cấp chung. Ngoài ra, tính mẫn cảm của vi sinh vật đối với chất kháng sinh cũng thay đổi tùy trường hợp, thông thường thì các vi khuẩn Gram (+) mẫn cảm với chất kháng sinh hơn vi khuẩn Gram (-). 1.1.4 Đơn vị kháng sinh. Năng lực tích tụ kháng sinh của chủng hay nồng độ chất kháng sinh thường được biểu thị bằng một trong các đơn vị là : mg/ml, µg/ml, hay đơn vị kháng sinh UI/ml (hay UI/g, International Unit ). Đơn vị của mỗi kháng sinh được định nghĩa là lượng kháng sinh tối thiểu pha trong một thể tích quy ước dung dịch có khả năng ức chế hoàn toàn sự phát triển của chủng vi sinh vật kiểm định đã chọn, thí dụ, với penicillin là số miligam penicillin pha vào trong 50 ml môi trường canh thang và sử dụng Staphylococcus aureus 209P làm chủng kiểm định; với Streptomicin là số miligam pha trong 1 ml môi trường canh thang và kiểm định bằng vi khuẩn Escherichia coli) [2]. 7 Khóa luận tốt nghiệp 1.1.5 Cơ chế tác dụng của kháng sinh. Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh ( hay các đối tượng gây bệnh khác - gọi tắt là mầm bệnh) của mỗi chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc vào bản chất của kháng sinh đó; trong đó, những kiểu tác động thường gặp là làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức năng điều tiết quá trình vận chuyển vật chất của màng tế bào chất, làm rối loạn hay ức chế quá trình sinh tổng hợp protein, rối loạn quá trình tái bản ADN, hoặc tương tác đặc hiệu với những giai đoạn nhất định trong các chuyển hóa trao đổi chất (hình 1.1) [15]. Hình 1.1. Sự tương tác đặc hiệu với những giai đoạn trao đổi chất - Ức chế quá trình tổng hợp vách của vi khuẩn (vỏ) của vi khuẩn.Các nhóm kháng sinh gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin. Do tác động lên quá trình tổng hợp vách nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp suất thẩm thấu. 8 . thuật của CNSH phân tử vào trong đề tài này để nghiên cứu về vai trò của gen gerK trong nhóm gen sinh tổng hợp gốc đường khử của cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin. . Nghệ Sinh Học -----***----- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐỀ TÀI: : NGHIÊN CỨU VỀ VAI TRÒ CỦA GEN GERK TRONG NHÓM GEN SINH TỔNG HỢP GỐC ĐƯỜNG KHỬ CỦA CẤU TRÚC KHÁNG