Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Trang - 0601 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, trước tiên em xin cảm ơn tới PGS – TS Tô Long Thành – Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương là người thầy đã trực tiếp dìu dắt, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho em trong suốt quá trình làm khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong ban giám hiệu trường Viện Đại học Mở Hà Nội, các cán bộ kỹ thuật viên trong phòng thí nghiệm Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương đã nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình hoàn thành khóa luận. Qua đây em cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện vật chất và tinh thần cho em. Do thời gian và khả năng bản thân có hạn nên khóa luận này không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong được sự chỉ bảo của thầy cô và góp ý của các bạn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2010 Sinh viên thực hiện Phạm Thị Trang Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Trang - 0601 MỤC LỤC PH N I: M UẦ Ở ĐẦ 1 1. T V N ĐẶ Ấ ĐỀ 1 2. M C TIÊU TÀIỤ ĐỀ 3 PH N II: T NG QUAN TÀI LI UẦ Ổ Ệ .4 2.1.GI I THI U CHUNG V B NH CÚM GIA C MỚ Ệ Ề Ệ Ầ 4 2.1.1. L ch s b nh cúm gia c mị ử ệ ầ 4 2.1.2. Tình hình d ch cúm gia c m trên th gi iị ầ ế ớ .5 2.1.3. Tình hình d ch cúm gia c m Vi t Namị ầ ở ệ 6 2.2. VIRUS H C B NH CÚM GIA C MỌ Ệ Ầ 8 2.2.1. C u trúc chung c a virusấ ủ 8 2.2.2. Thành ph n hóa h c c a virusầ ọ ủ 10 2.2.3. Quá trình nhân lên c a virusủ 10 2.2.4. Tính a d ng c a kháng nguyênđ ạ ủ .12 2.2.5. c l c c a virus cúm gia c mĐộ ự ủ ầ 12 2.2.6. S c kháng c a virus cúm gia c mứ đề ủ ầ 13 2.2.7. Nuôi c y và l u gi virusấ ư ữ .14 2.3. D CH T H C B NH CÚM GIA C MỊ Ễ Ọ Ệ Ầ .14 2.3.1. ng v t mang virusĐộ ậ .14 2.3.2. ng v t c m nhi mĐộ ậ ả ễ .15 2.3.3. S truy n lâyự ề .15 2.3.4. Mùa v phát b nhụ ệ .16 2.3.5. Tu i m c b nhổ ắ ệ 16 2.4. TRI U TR NG, B NH TÍCH C A B NH CÚM GIA C MỆ Ứ Ệ Ủ Ệ Ầ .16 2.4.1 Tri u tr ngệ ứ 16 2.4.2. B nh tíchệ .17 2.5. CÁC PH NG PHÁP CH N OÁN B NHƯƠ Ẩ Đ Ệ .17 2.5.1. Ch n oán lâm sàngẩ đ .17 2.5.2. Ch n oán phòng thí nghi mẩ đ ệ 18 2.6. MI N D CH CH NG B NH CÚM GIA C MỄ Ị Ố Ệ Ầ .18 2.6.1. Mi n d ch không c hi uễ ị đặ ệ 18 2.6.2. Mi n d ch c hi u ễ ị đặ ệ .18 2.7. TÌNH HÌNH S D NG VACXIN PHÒNG B NH CÚM GIA C MỬ Ụ Ệ Ầ TRÊN TH GI I VÀ KHUY N CÁO C A T CH C D CH T TH Ế Ớ Ế Ủ Ổ Ứ Ị Ễ Ế GI IỚ .21 2.7.1. Các lo i vacxin phòng b nh cúm gia c m hi n nayạ ệ ầ ệ .21 2.7.2. Yêu c u c n t c i v i vacxin cúm gia c mầ ầ đạ đượ đố ớ ầ 22 2.7.3. Tình hình s d ng vacxin cúm gia c m trên th gi iử ụ ầ ế ớ .23 2.7.5. Các lo i vacxin phòng b nh cúm gia c m c s d ng ạ ệ ầ đượ ử ụ ở Vi t Namệ 25 2.8. C TÍNH K THU T C A VACXIN H5N1 (K - NEWH5) C AĐẶ Ỹ Ậ Ủ Ủ MÊXICO .27 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Trang - 0601 2.8.1. Thành ph n, hàm l ng c a các ho t ch t có trong công ầ ượ ủ ạ ấ th cứ 27 2.8.2. c tính c a s n ph mĐặ ủ ả ẩ .27 PH N III: N I DUNG, NGUYÊN LI U VÀẦ Ộ Ệ .29 PH NG PHÁP NGHIÊN C UƯƠ Ứ .29 3.1. N I DUNG NGHIÊN C UỘ Ứ .29 3.1.1. Ki m nghi m vacxin phòng ch ng cúm gia c m H5N1 (K –ể ệ ố ầ New H5) c a Mêxicoủ .29 3.1.2. Kh o nghi m vacxin phòng ch ng cúm gia c m H5N1 (K –ả ệ ố ầ New H5) c a Mêxicoủ .29 3.2. NGUYÊN LI UỆ 29 3.2.1. ng v t thí nghi mĐộ ậ ệ .29 3.2.2. Vacxin 29 3.2.3. Các trang thi t b và c s v t ch tế ị ơ ở ậ ấ 29 3.3. PH NG PHÁP NGHIÊN C UƯƠ Ứ 29 3.3.1. Ph ng pháp l y và x lý m u b nh ph mươ ấ ử ẫ ệ ẩ 30 3.3.2. M t s ph ng pháp th ng c dùng trong ch n oán ộ ố ươ ườ đượ ẩ đ cúm gia c mầ .31 3.4. B TRÍ THÍ NGHI MỐ Ệ .39 3.4.1. Ki m nghi m Vacxinể ệ .39 3.4.2. Kh o nghi m Vacxinả ệ .41 PH N IV: K T QU VÀ TH O LU NẦ Ế Ả Ả Ậ 43 4.1. K T QU KI M NGHI M VACXINẾ Ả Ể Ệ .43 4.1.1. Ch tiêu vô trùngỉ 43 4.1.2. Ch tiêu an toànỉ 44 4.1.3. Ch tiêu hi u l cỉ ệ ự 45 4.2. K T QU KH O NGHI M VACXINẾ Ả Ả Ệ .46 4.2.1. K t qu ki m tra hi u giá kháng th kháng kháng nguyên ế ả ể ệ ể H5 trong huy t thanh v t tr c và sau khi tiêm vacxin K New-H5 ế ị ướ 46 4.2.2. K t qu công c ng c cho v t v i virus H5N1ế ả ườ độ ị ớ .49 4.2.3. K t qu ki m tra kháng th kháng kháng nguyên H5 và ế ả ể ể Newcastle trong huy t thanh gà tr c khi tiêm vacxin ế ướ 51 4.2.4. K t qu ki m tra hi u giá kháng th kháng kháng nguyên ế ả ể ệ ể H5 trong huy t thanh gà sau khi tiêm vacxin K New-H5 ế .52 4.2.5. K t qu công c ng c cho gà v i virus H5N1ế ả ườ độ ớ 54 4.2.6. K t qu ki m tra s có m t c a virus cúm H5 trên àn gia ế ả ể ự ặ ủ đ c m sau khi tiêm vacxinầ 56 PH N V: K T LU N VÀ NGHẦ Ế Ậ ĐỀ Ị .57 5.1. K T LU NẾ Ậ .57 5.2. NGHĐỀ Ị .58 TÀI LI U THAM KH OỆ Ả 59 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Trang - 0601 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Trang - 0601 PHẦN I: MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, ngành chăn nuôi gia cầm của Việt Nam đang giữ một vị trí quan trọng, cung cấp một phần đáng kể thịt và trứng cho nhu cầu thực phẩm ngày càng tăng của nhân dân. Trong những năm gần đây, chúng ta thường xuyên nhập gia cầm giống, trứng gia cầm giống nhằm phát triển chăn nuôi trong nước. tuy nhiên, việc nhập gia cầm và các sản phẩm của gia cầm luôn là nguy cơ lây lan dịch bệnh từ nước ngoài vào nước ta. Một trong những bệnh gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi gia cầm hiện nay, đang được Việt Nam cũng như thế giới quan tâm đó là cúm gia cầm. Bệnh cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, nguy hiểm có tốc độ lây lan nhanh với tỷ lệ chết cao có thể lên đến 100% đối với đàn gia cầm nhiễm bệnh. Bệnh cúm gia cầm là một loại bệnh cúm do virus gây ra cho các loài gia cầm (hay chim) và có thể xâm nhiễm một số loài động vật có vú. Virus này được phát hiện lần đầu tiên tại Ý vào đầu thập niên 1900 và giờ đây phát hiện ở hầu hết các nơi trên thế giới, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế. Virus cúm gia cầm là một thành viên của họ Orthomyxoviridae, là virus ARN phân mảnh có khả năng đột biến mạnh. Với tính chất nguy hiểm, bệnh cúm gia cầm được tổ chức Y tế Thế giới (OIE) xếp vào bảng A-bảng danh mục các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất của động vật. Dịch cúm gia cầm xảy ra lần đầu tiên ở Việt Nam vào cuối tháng 12 năm 2003. Dịch đã bùng phát ở 57 tỉnh, thành phố khiến 50 triệu gia cầm bị chết hoặc bị tiêu hủy, thiệt hại lên đến 5000 tỷ đồng, gây ra những hậu quả nghiêm trọng ảnh hưởng đến đời sống xã hội, làm thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi gia cầm nước ta. Nhiều cơ sở chăn nuôi công nghiệp quy mô lớn, nhiều trang trại và hộ chăn nuôi gia đình đã bị phá sản. Sự nguy hại của bệnh cúm gia cầm không phải chỉ gây tỷ lệ chết cao ở gia cầm mà còn có thể lây từ gà sang người thậm chí gây tử vong. Năm 1997 Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 1 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Trang - 0601 lần đầu tiên virus cúm gia cầm đã vượt “rào cản về loài” để lây sang người ở Hồng Kông làm cho 6 người chết trong số 18 người nhiễm bệnh. Đầu năm 2004 nhiều trường hợp nhiễm H 5 N 1 ở người đầu tiên cũng được phát hiện tại Việt Nam và Thái Lan. Đến năm 2005 những ca bệnh cúm này ở người cũng được ghi nhận tại Campuchia, Indonexia và Trung Quốc. Trước những diễn biến phức tạp của bệnh đã làm cho cộng đồng quốc tế lo ngại về nguy cơ của một đại dịch cúm ở người. Nhằm ngăn chặn và khống chế dịch cúm gia cầm chúng ta đã áp dụng các biện pháp mạnh mẽ như tiêu hủy gia cầm, cấm lưu thông và tiêu thụ gia cầm, sản phẩm gia cầmđồng thời vệ sinh tiêu độc, kiểm tra huyết thanh học thường xuyên đối với đàn gia cầm, tuyên truyền về sự nguy hiểm của bệnh cúm gia cầm trên các phương tiện truyền thông, tổ chức lại chăn nuôi, áp dụng các biện pháp sinh học… Các biện pháp trên được áp dụng triệt để ngay từ đầu đã góp phần khống chế các đợt dịch song rất tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và ít mang lại hiệu quả mong muốn khi mà điều kiện thực tế nước ta còn nhiều hộ gia đình chăn nuôi nhỏ lẻ. Chính vì vậy, việc sử dụng vacxin được coi như là biện pháp hỗ trợ tích cực trong chiến lược phòng chống bệnh cúm gia càm. Theo kinh nghiệm của một số nước như: Italia, Mêxico, Pakistan, Mỹ, Hồng Kông cho thấy tiêm phòng vacxin là một biện pháp hỗ trợ trong chương trình khống chế bệnh cúm gia cầm nhằm làm giảm thiệt hại do bệnh gây ra. Các tổ chức như: FAO, OIE, WHO đã khuyến cáo các nước nên sử dụng một chiến lược tiêm phòng có định hướng trong chính sách đối phó với bệnh cúm gia cầm. Trên cơ sở đó Việt Nam cũng đã tiến hành nhập khẩu, kiểm nghiệm, khảo nghiệm và tiêm thí điểm vacxin đối với gia cầm bằng các loại vacxin ngoại nhập từ Trung Quốc, Hà Lan, Mêxico. Những ưu điểm của biện pháp chủng ngừa trong chiến lược khống chế dịch cúm gia cầm độc lực cao đó là: - Làm giảm sự cảm nhiễm bệnh đối với gia cầm đã được tiêm vacxin. Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 2 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Trang - 0601 - Làm giảm đáng kể lượng virus bài thải ra môi trường bên ngài dẫn đến. làm giảm nguy cơ lây lan giữa các đàn gia cầm, tránh lây nhiễm sang người. - Có tính khả thi đối với những đàn gà có giá trị cao và gà chăn nuôi gia đình, gà cảnh, giảm thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm. Để hiểu rõ khả năng ứng dụng của vacxin cúm gia cầm trong điều kiện Việt Nam trước khi đưa vacxin vào tiêm phòng chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Kiểm nghiệm và khảo nghiệm vacxin phòng chống cúm gia cầm H 5 N 1 (K New- H 5 ) của Mêxico”. 2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Đánh giá được vacxin cúm gia cầm H 5 N 1 (K New-H 5 ) theo quy định của nhà nước. Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 3 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Trang - 0601 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM 2.1.1. Lịch sử bệnh cúm gia cầm Bệnh cúm gia cầm (Avian Influenza – AI) được phát hiện và xảy ra từ rất lâu trên thế giới. Nó được mô tả lần đầu tiên ở Italia vào năm 1878 bởi Porroncito với tên gọi bệnh “Dịch tả gia cầm”. Đây là một bệnh rất nguy hiểm và gây tử vong cao ở đàn gia cầm. Đến năm 1901, Centanni và Savunozzi mới xác định được căn nguyên là một tác nhân qua lọc (filterable agent) [13]. Nhưng phải đến năm 1955, virus gây bệnh mới được Schafer xác định thuộc type A thông qua kháng nguyên bề mặt H 7 N 1 và H 7 N 7 gây chết nhiều gà, gà tây và chim hoang ở Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Trung Cận Đông, Châu Phi [1]. Năm 1959 bệnh xảy ra trên đàn gà ở Scotland do virus cúm A H 5 gây ra [2]. Năm 1963, virus cúm type A được phân lập từ gà tây ở Bắc Mỹ do loài thủy cầm di trú lây nhiễm virus vào đàn gà. Cuối thập kỷ 60, thấy phân type H 1 N 1 ở lợn và có liên quan đến những ổ dịch ở gà tây với biểu hiện đặc trưng là những triệu trứng ở đường hô hấp và giảm đẻ. Năm 1971, Beard đã mô tả rất kỹ về virus gây bệnh và đặc điểm bệnh lý lâm sàng của gà trong các ổ dịch cúm gà, gà tây khá lớn xảy ra ở Mỹ mà chủng gây bệnh là H 7 N 1 . Từ khi phát hiện ra virus cúm type A, các nhà khoa học đã tăng cường nghiên cứu và thấy virus cúm có ở nhiều loài chim hoang dã và gia cầm nuôi ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới. Bệnh dịch nghiêm trọng nhất xảy ra ở gia cầm là những chủng gây bệnh cao thuộc phân type H 5 và H 7 , như ở Scotland năm 1950 là H 5 N 1 , ở Mỹ năm 1983 – 1984 là H 5 N 2 . Nhiều công trình nghiên cứu có hệ thống về bệnh cúm gia cầm lần lượt được công bố ở Australia năm 1975, ở Anh năm 1979 và ở Mỹ năm 1983 – 1984. Các nghiên cứu này đã tập trung nghiên cứu về đặc điểm sinh học, bệnh Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 4 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Trang - 0601 học và dịch tễ học, các phương pháp chẩn đoán miễn dịch và biện pháp phòng chống bệnh. Ngày nay, dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở khắp nơi trên thế giới với mức độ ngày càng nguy hiểm, đã thúc đẩy các nhà khoa học và hiệp hội chăn nuôi gia cầm tổ chức hội thảo chuyên đề về bệnh cúm gia cầm [4]. Hội thảo lần đầu tiên tổ chức vào năm 1981 tại Beltsville, 2 lần tiếp theo tại Ailen năm 1987 và 1992. Đến nay thì bệnh cúm gia cầm vẫn luôn là một trong những nội dung quan trọng trong các hội nghị về dịch tễ trên thế giới. Từ đó có thể thấy, bệnh cúm gia cầm ngày càng trở nên nguy hiểm, gây nhiều thiệt hại về mặt kinh tế cho ngành chăn nuôi trên phạm vi toàn cầu. 2.1.2. Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới Virus cúm gia cầm có mặt ở khắp nơi trên thế giới và gây dịch bệnh ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ. Đặc biệt, ở Hồng Kông năm 1997 virus không chỉ gây bệnh cho gia cầm mà lần đầu tiên đã vượt “rào cản về loài” để lây sang người làm cho 6 người chết trong số 18 người nhiễm bệnh [6]. Từ cuối năm 2003, dịch cúm gia cầm đã xảy ra với quy mô lớn, diễn biến hết sức phức tạp với tốc độ bùng phát nhanh ở các nước Châu Á và lan sang các quốc gia khác. Cuối tháng 02/2004 đã có rất nhiều nước và vùng lãnh thổ công bố dịch cúm gia cầm do virus H 5 N 1 gây ra trong đó có: Hàn Quốc, Thái Lan, Nhật Bản, Lào, Campuchia, Indonesia, Malaysia, Trung Quốc, Hồng Kông và Việt Nam [11]. Chủng virus độc lực cao gây bệnh đã được phân lập và định type là H 5 N 1 là chủ yếu, ngoài ra còn có chủng H 7 N 3 và H 9 N 2 ở Pakistan, chủng H 7 N 3 ở Canada, chủng H 7 N 2 ở Mỹ, chủng H 6 và H 5 N 2 ở Nam Phi, chủng H 10 N 7 ở Ai Cập và chủng H 7 ở Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Triều Tiên. Đến giữa năm 2005, dịch cúm gia cầm do H 5 N 1 bắt đầu xuất hiện tại Kazakhstan, Nga rồi nhanh chóng lan rộng sang các nước khác ở khu vực Châu Âu như Rumani, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Azerbaijan, rồi tràn sang Châu Phi và các nước khác thuộc khu vực Châu Á như Trung Quốc và Iraq. Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 5 Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Trang - 0601 Theo thống kê của tổ chức Dịch tễ Thế giới - OIE (2006) tính đến ngày 02/08/22006 chủng virus độc lực cao H 5 N 1 đã có mặt tại 51 quốc gia và vùng lãnh thổ trên hầu hết các Châu lục. Năm 2008, dịch cúm gia cầm phát ra tại 22 quốc gia và vùng lãnh thổ gồm Ixraen, Ảrập Xêút, Thụy Sỹ, Ucraina, Thổ Nhĩ Kỳ, Nga, Ấn Độ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Anh, Trung Quốc, Pakisxtan, Nigiêria, Băngladet, Tô Gô, Hồng Kông, Ai Cập, Đức, Inđônêxia, Lào, Thái Lan và Việt Nam. Ngay từ tháng 1 năm 2009, nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ thông báo có phát sinh dịch cúm gia cầm như Canada, Đức, Ba Lan, Nêpan, Ấn Độ, Ai Cập, Băngladet, Inđônêxia, Trung quốc. 2.1.3. Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam Dịch cúm gia cầm xuất hiện lần đầu tiên ở nước ta vào cuối tháng 12 năm 2003, sau đó liên tục tái phát. Tính đến nay, đã có 6 đợt dịch cúm gia cầm xuất hiện ở Việt Nam: Đợt dịch thứ nhất: Từ tháng 12/2003 đến hết tháng 3/2004. Dịch lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng 2 tháng dịch đã xảy ra ở 2.574 xã phường, 381 quận, huyện, thị xã thuộc 57 tỉnh [5]. Tổng số gà và thủy cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy hơn 43,9 triệu con, trong đó gà chiếm 30,4 triệu con, thủy cầm chiếm 13,5 triệu con. Ngoài ra còn có 14,76 triệu con chim cút và các loại chim khác bị chết và tiêu hủy. Đợt dịch thứ hai: Từ tháng 4 đến hết tháng 11/2004. Bệnh xuất hiện ở 46 xã, phường tại 32 quận, huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh. Tổng số gia cầm bị tiêu hủy trong thời gian này là 84.078 con trong đó có 59.999 gà, 8.132 vịt và 19.947 chim cút [1]. Đợt dịch thứ ba: Từ tháng 12 đến hết tháng 6/2005. Trong khoảng thời gian này dịch đã xuất hiện ở 670 xã của 182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố. Ở đợt dịch này có 470.495 con gà, 825.689 vịt, ngan và 551.029 chim cút đã chết hoặc bị tiêu hủy. Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh học 6 . tài: Kiểm nghiệm và khảo nghiệm vacxin phòng chống cúm gia cầm H 5 N 1 (K New- H 5 ) của Mêxico . 2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Đánh giá được vacxin cúm gia cầm H. bệnh cúm gia cầm. Trên cơ sở đó Việt Nam cũng đã tiến hành nhập khẩu, kiểm nghiệm, khảo nghiệm và tiêm thí điểm vacxin đối với gia cầm bằng các loại vacxin