Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành 1 Trờng Đại học Vinh khoa sinh học ------- ------ khoá luận tốt nghiệp cử nhân sinh học chuyên ngành: Di truyền vi sinh vi sinh vật phân giải xenlulôza kỵ khí trong đất Giáo viên hớng dẫn : Nguyễn Dơng Tuệ Sinh viên thực hiện : Hắc Bá Thành Lớp : 42E 2 - Sinh Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Lời cảm ơn Để hoàn thành luận văn này em đã nhận đợc sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo trong khoa sinh học, phòng Thí nghiệm di truyền vi sinh đã giúp đỡ em về cơ sở vật chất cũng nh tinh thần trong quá trình tiến hành. Đặc biệt là thầy giáo Nguyễn Dơng Tuệ đã quan tâm hớng dẫn tận tình và giúp đỡ em hoàn thành với phơng pháp nghiên cứu khoa học đến lúc hoàn thành luận văn này. Qua đây em xin gửi lời cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ, động viên của tất cả bạn bè đồng nghiệp trong suốt thời gian qua. Vinh, ngày tháng năm Sinh viên thực hiện Hắc Bá Thành 2 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Phần I: Đặt vấn đề Xenluloza là một trong những thành phần chủ yếu của tổ chức thực vật. Hàm lợng Xenluloza trong xác thực vật thay đổi trong khoảng 50 80% (tính theo khối lợng thô), trong sợi bông hàm lợng này thờng vợt quá 90%, ớc tính tổng lợng Xenluloza trên trái đất này là vào khoảng 35 tỷ tấn. (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự 1980) Xenluloza lại là hợp chất rất bền vững, đó là loại polysaccarit cao phân tử, chúng cấu tạo bởi nhiều gốc - glucozơ, liên kết với nhau nhờ dây nối - 1,4 glucozit. Mỗi phân tử thờng có chứa từ 1400 10.000 gốc glucozơ, khối lợng phân tử Xenluloza thay đổi khác nhau phụ thuộc vào tuỳ từng loại thực vật và tuỳ phơng pháp xác định. Xenluloza có cấu tạo dạng sợi có cấu trúc phân tử là một polimer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một disacarit gọi là Xenlubioza. Xenlubioza có cấu trúc từ hai phân tử D - - glucozơ. Cấu trúc bậc hai và bậc ba rất phức tạp thành cấu trúc dạng lớp gắn với nhau bằng lực liên kết hydro. Lực liên kết hydro trùng hợp nhiều lần nên rất bền vững bởi vậy Xenluloza là hợp chất khó phân giải. Dịch tiêu hoá của ng- ời và động vật không thể tiêu hoá đợc chúng, động vật nhai lại tiêu hoá đợc Xenluloza là nhờ khu hệ vi sinh vật sống trong dạ cơ động vật nhai lại. (Trần Cẩm Vân Giáo trình vi sinh vật học môi trờng năm 2000. NXBĐHQG HN) Xenluloza đợc sử dụng dới dạng rơm, rạ, giấy, mạt ca các loại nguyên liệu này tuỳ theo đối tợng vi sinh vật sẽ có cách xử lý thích hợp khác nhau. Hiện nay hớng sử dụng trực tiếp Xenluloza còn rất hạn chế. (Trần Thị Thanh Công nghệ vi sinh 2001 NXBGD) Sự phân giải Xenluloza đợc thực hiện cả trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, cả trong môi trờng kiềm hay axit, khi độ ẩm thấp hoặc cao và ở các 3 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành nhiệt độ khác nhau. Tất cả vi sinh vật tham gia vào việc vô cơ hoá Xenluloza đều thuộc loại dị dỡng hoá năng hữu cơ. Chúng hình thành men Xenluloza xúc tác việc phân giải Xenluloza thành Xenlubioza và glucoza, sử dụng các hợp chất sinh ra làm nguồn các bon và nguồn năng lợng. N.X.Egrov Thực tập vi sinh vật học NXB MIR Maxcơva (1983) Trong thiên nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân huỷ Xenluloza nhờ có hệ enzym Xenlulaza ngoài bào. Nhóm vi khuẩn kỵ khí bao gồm: Clotridium và đặc biệt là nhóm vi khuẩn sống trong dạ cỏ của động vật nhai lại, chính nhờ nhóm vi khuẩn này mà trâu bò có thể sử dụng Xenluloza nh vi khuẩn: - Ruminococus albus. - Ruminocus flavefacius. - Cillobacterium Cellulosolvens. Trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí Xenluloza có thể bị phân giải dới tác dụng của nhiều nhóm vi sinh vật nh vi khuẩn, niêm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, nấm men, nấm mủ. Các vi khuẩn có khả năng phân giải Xenluloza mạnh thuộc các chi nh: Achromobacter, Pseudomonas, Cellulomonas, Vibrio, Cellvibrio, Clotridium, Baccillus (vi khuẩn), Bac. omelianskii, Bac.Cellulosaedissolven. Nhiều nghiên cứu gần đây cho biết các vi sinh vật này ít nhất cũng làm sinh ra hai loại enzym phân giải Xenluloza: Xenlulaza C 1 và Xenlulaza Cx enzym C 1 tác dụng sơ bộ vào các phân tử Xenluloza thiên nhiên và biến chúng thành chuỗi Xenluloza mạch thẳng. Sau đó dới tác dụng của enzym Cx sẽ bị phân hủy thành đờng Xenlubioza (gồm hai phân tử -glucoza), loại đ- ờng này có thể tan trong nớc dới tác dụng của - Glucozidaza (hay Xenlobioza) rất dễ dàng chuyển hoá thành glucoza. Nguyễn Lân Dũng Nguyễn Đình Quyến -1998- vi sinh vật học. Trong điều kiện nớc ta hiện nay việc tìm kiếm các nòi vi sinh vật có khả năng phân giải mạnh Xenluloza có ý nghĩa rất lớn đặc biệt là khả năng sử dụng vi sinh vật để chế biến các nguyên liệu giàu Xenluloza tạo sinh khối 4 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành dùng trong chăn nuôi, lên men sản xuất cồn thay xăng và góp phần xử lý chất thải rắn, hạn chế ô nhiễm môi trờng. Chính vì lẽ đó ở đây chúng tôi đi vào tìm hiểu vi khuẩn có khả năng phân giải Xenluloza để có thể ứng dụng vào thực tiễn. Mục tiêu đề tài -Tìm các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải yếm khí Xenluloza. -Chọn một chủng để nghiên cứu các đặc điểm hình thái và khả năng phân giải Xenluloza để sử dụng vào thực tiễn. -Rèn luyện phơng pháp nghiên cứu và làm việc tại phòng thí nghiệm. Phần II: Tổng luận I . Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nớc. Ngoài các vi sinh vật hiếu khí còn một số vi khuẩn kỵ khí có khả năng tham gia tích cực vào quá trình phân giải Xenluloza. Ngời ta gọi quá trình phân giải Xenluloza kỵ khí là quá trình lên men Xenluloza . C.Thermocellum là loại vi khuẩn đợc nghiên cứu rất nhiều bởi nhà khoa học Nga A.A.Imseuhietxki . chúng phân lập lần đầu tiên từ phân ngựa, lúc còn non có hình que ngắn, khi trởng thành có hình uốn cong với kích th- ớc khá dài, bào tử sinh ra ở một đầu của tế bào. 5 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Loại vi khuẩn này có thể phát triển đợc trên các môi trờng tổng hợp đơn giản chứa nguồn cácbon là Xenluloza hoặc Xenlobioza, nguồn nitơ là muối NH 4 + chúng không sử dụng đợc glucoza và nhiều loại đờng khác, chúng phát triển và lên men mạnh mẽ ở nhiệt độ 60 65 0 C, giới hạn nhiệt độ cao nhất thờng là 70 0 C, còn ở 40 50 0 C ngời ta nhận thấy chúng bắt đầu kém phát triển. Sản phẩm của quá trình lên men vi khuẩn này là etanol, Axit Axetic, Axit focmic, Axit lactic, hydro và CO 2 . Có lẽ enzym Xenlulaza chỉ giúp chúng chuyển hoá Xenluloza thành Xenlobioza. Việc lên men Xenluloza đợc thực hiện nhờ sự xúc tác của nhiều loại men khác nhau. vi sinh vật a ấm C.omelianskii đợc nhà khoa học Nga Omelianski phân lập đầu tiên năm 1902. Đó là loại vi khuẩn có hình que, kích thớc 0.5 3 x 4 - 8 à m, có khả năng di động, bào tử đợc hình thành ở một đầu do đó làm cho vi khuẩn trở nên có hình dáng giống cái dùi trống, loại vi khuẩn này phát triển và lên men mạnh mẽ nhất ở 30 40 0 C. Sản phẩm của quá trình lên men này là: etanol, Axit Axetic, Axit lactíc, Axit focmic, H 2 , CO 2. . Còn một nhóm vi sinh vật đặc biệt nữa có khả năng phân giải Xenluloza một cách mạnh mẽ trong điều kiện kỵ khí đủ là nhóm vi sinh vật sống trong dạ cỏ của trâu bò và các động vật nhai lại khác. Trâu bò sẽ không thể tiêu hoá đợc cỏ, rơm rạ nếu không có sự cộng sinh với một khu hệ đông đúc các sinh vật trong dạ cỏ của chúng, nhiều nghiên cứu cho biết trong mỗi ml các chất lấy đợc từ dạ cỏ ngời ta nhận thấy thờng có khoảng 10 9 10 10 tế bào vi khuẩn, sinh khối vi khuẩn chiếm đến 5 10% so với lợng khô của toàn bộ các chất chứa trong dạ cỏ trâu bò. Ngoài vi khuẩn ra trong ml các chất trong dạ cỏ trâu bò còn thấy có khoảng vài triệu cơ thể động vật nguyên sinh (cũng chiếm 6 10% khối lợng khô). Về khu hệ vi khuẩn của dạ cỏ hệ động vật nhai lại có thể kể đến rất nhiều loài nhng trong số này những loài có khả năng phân giải Xenluloza mạnh mẽ nhất là:Ruminococus flavefeciens, R.albus, Ruminobacter parvum, Bacteroides Succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Clotridium Cellobio parum, Cellulosolvens, Cillobacterium 6 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Các cầu khuẩn sống trong dạ cỏ đợc nghiên cứu rất nhiều nhất là thuộc về hai loài Ruminococus flavefeciens và R.albus. Ruminococus flavefeciens là loại cầu gram dơng, thờng xếp thành chuỗi có khả năng sinh sắc tố vàng, sản phẩm cuối cùng khi lên men Xenluloza và Xenlobioza ,Axit xucxinic và Axit Axetic. Một số chủng còn có khả năng sinh ra một lợng nhỏ Axit lactic, Axit focmic, Etanol . R.Albus khi lên mem Xenluloza và Xenlobioza thờng làm sinh ra Axit Axetic, Etanol, Axit focmic, H 2 và CO 2 . Bacteroidessuccinogenes là loại trực khuẩn gram âm kỵ khí bắt buộc, không sinh bào tử, nguồn năng lợng tốt nhất đối với chúng là Xenluloza và glucoza. Chúng còn có khả năng đồng hoá cả tinh bột, Xenlobioza, Pectin và một số đờng khác. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men Xenluloza là Axit Succinic và một lợng nhỏ Axit Axetic, Axit focmic, để phát triển tốt chúng đòi hỏi phải có muối amôn và một lợng nhỏ Xixtein, chúng còn cần cả một ít biotin và Axit paraaminobenzoic. Để nuôi cấy loại vi khuẩn này ngời ta thờng dùng môi trờng chứa dịch dạ cỏ, Xenluloza, một số muối vô cơ và bicacbonat. Bytyrivibrio fibrisolvens là loại trực khuẩn uốn cong gram âm, không sinh bào tử. Ngoài Xenluloza chúng đồng hoá cả tinh bột, hemixenluloza, Xilan,glucoza, galactoza, arabinoza và nhiều hydratcacbon khác. Để sinh trởng tốt, loài vi khuẩn này đỏi hỏi phải cung cấp một số amino axit thiếu chất này chúng phát triển rất chậm. Chúng còn cần đợc cung cấp một số chất nh biotin, axit folic, vitaminB6 loại vi khuẩn này phân bố khá rộng trong tự nhiên. Cellobacterium Cellulosolven cũng là những trực khuẩn kỵ khí, không sinh bào tử , chúng thuộc loại gram dơng có khả năng di động, ngoài khả năng đồng hoá Xenluloza loại vi khuẩn này có thể đồng hoá cả glucoza, Xenlobioza, maltoza, Fructoza, insulin sản phẩm chủ yếu sinh ra trên môi tr- ờng chứa Xenluloza và Axit lactic. 7 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành Về trực khuẩn kỵ khí không sinh bào tử có khả năng phân giải Xenluloza trong dạ cỏ cần phải kể đến loài Clostridium Cellobioparum loại vi khuẩn này phân lập từ năm 1944 (Hungate 1944) chúng thuộc loại vi khuẩn gram âm, có khả năng lên men Xenluloza và một số hydrat cacbon khác, sản phẩm của quá trình lên men này là Axit Axetic, Axit lactic,Axit focmic, Etanol, H 2 và CO 2 . Gần đây ngời ta còn phân lập đợc từ dạ cỏ hai loài Clotridium khác (Cl.Locheadii và Ch.longisporum). Khi lên men Xenluloza, Xenlobioza và một số đờng khác các loại vi khuẩn này sẽ làm sinh ra khá nhiều chất nhầy. II . Cấu tạo của Xenluloza. Thành phần Xenluloza tinh khiết trong các nguyên liệu chứa Xenluloza. Nguyên liệu Xenluloza tinh khiết (%) Sợi bông 80 95 Gỗ thông 41 Bã mía 56,6 Rơm rạ 44 Trấu lúa mì 30,5 Trấu lúa nớc 32,1 Vỏ đậu tơng 51 Thân cây ngô 36 Cỏ 28 Xenluloza có cấu trúc lớp sợi song song các chuỗi Xenluloza gắn với nhau nhờ mạng lới liên kết hydro còn các lớp gắn với nhau nhờ lực Van der van. Trong tự nhiên các chuỗi glucan của Xenluloza có cấu trúc dạng sợi, đơn vị sợi nhỏ nhất có đờng kính khoảng 3nm, các sợi sơ cấp hợp thành vi sợi có đờng kính từ 10 40nm, những vi sợi này hợp thành bó sợi to, có thể quan sát dới kính hiển vi quang học toàn bộ lớp sợi này là một lớp vỏ. Hemixenluloza và lignin gắn chặt bao bọc bên ngoài phân tử Xenluloza có cấu trúc không đồng nhất gồm hai vùng. Xenluloza có cấu trúc 8 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành đặc, bền chắc cùng với sự có mặt của lớp vỏ Hemixenluloza, lignin khiến cho sự xâm nhập của enzym vào cấu trúc hết sức khó khăn và làm tăng tính kỵ khí của chuỗi - 1-4 glucan làm cản trở tốc độ phản ứng thuỷ phân. Xenluloza cấu tạo bởi các gốc - D glucopyranoza liên kết với nhau qua dây nối 1,4 - glucorit. CH 2 OH CH 2 OH CH 2 OH n Các sợi xenluloza chứa khoảng 10-12 nghìn gốc - Glucopyranoza (Nguyễn Lân Dũng 1984) Xenluloza là hợp chất bền vững không tan trong nớc không đợc tiêu hoá trong đờng tiêu hoá của ngời và các động vật có dạ cỏ một túi. Tuy nhiên trong dạ cỏ của động vật nhai lại và trong đất có tồn tại rất nhiều loài vi sinh vật có khả năng sản sinh Xenluloza và enzym, xúc tác quá trình chuyển phân Xenluloza thay đổi ở từng loại vi sinh vật. III . Công nghệ xử lý chất thải hữu cơ bằng vi sinh vật. Nhờ hoạt động sống của vi sinh vật các chất hữu cơ (CHO) có trong rác thải phân hủy thành những phần nhỏ hơn, hình thành sinh khối vi sinh vật mới, các sản phẩm trao đổi chất, các chất khí nh CH 4 , CO 2 , H 2 các quá trình chuyển hoá các chất hữu cơ có thể xẩy ra dới tác dụng của các vi sinh vật trong điều kiện hiếu khí hay kỵ khí đợc tóm tắt nh sau: CHO -> Các chất hữu cơ bị thuỷ phân + tế bào vi sinh vật + CO 2 + H 2 O + CH 4 + Kcal. ủ kỵ khí là phơng pháp đơn giản dễ thực hiện, chi phí thấp và có thể thu khí mêtan làm chất đốt. Nhợc điểm chính của biện pháp này là quá trình 9 Luận văn tốt nghiệp Hắc Bá Thành xử lý thờng kéo dài không tận thu đợc hết khí mêtan nên cũng gây ô nhiễm môi trờng. Quá trình phân giải hợp chất cácbon trong tự nhiên là quá trình sinh hoá phức tạp, nhờ hoạt động sống của vi sinh vật một lợng lớn chất hữu cơ bị phân giải và làm giảm trọng lợng. Trong quá trình này các hydratcabon Xenluloza, Hemixenluloza, lizim đợc phân giải thành phần nhỏ hơn, sinh khối vi sinh vật mới đợc tạo thành đồng thời tạo ra các sản phẩm của quá trình trao đổi chất các chất khí (NH 3 , CO 2 ) các axit hữu cơ, axit focmic, axit axetic, axit propyonic, axit béo, axit lactic các chất này tiếp tục chuyển hoá thành các sản phẩm khác. Chu trình chuyển hoá các hợp chất cácbon đợc chuyển hoá qua hàng loạt các phản ứng hoá học, xúc tác mỗi phản ứng là một enzym để duy trì sự sống, các vi sinh vật sử dụng các sản phẩm do chúng phân huỷ hay do vi sinh vật khác chuyển hoá. Trong quá trình chuyển hoá vật chất trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật cùng tham gia, sản phẩm chuyển hoá chủng vi sinh vật này lại là cơ chất cho vi sinh vật khác hoạt động vi sinh vật diễn ra phức tạp và có liên quan chặt chẽ. Việc thủy phân Xenluloza có thể bằng phơng pháp hoá học hoặc sinh học nhng phơng pháp hoá học đòi hỏi sử dụng axit sunfuric đậm đặc, đầu t thiết bị tốn kém và khó thu sản phẩm đồng thời do vậy hiệu quả kinh tế thấp. Trong khi đó vi sinh vật sinh trởng nhanh, nuôi cấy dễ sinh enzym đặc hiệu cho nên có thể thu đợc sản phẩm tinh khiết ngay ở nhiệt độ thờng và áp suất thờng. Theo hớng này trớc hết Xenluloza đợc thuỷ phân thành Xenlobioza sau đó dới tác dụng của Xenlobiaza thành glucoza, rồi từ glucoza có thể làm thức ăn cho ngời và gia súc (protein đơn bào) hoặc lên men tạo thành các dung môi, chất dẻo, cồn. Xenluloza Xenlulaza lên men 10